本發(fā)明屬于生物，具體內(nèi)容涉及一株青霉素?；傅纳a(chǎn)菌株、青霉素?；负屯蛔凅w以及在酶法合成β-內(nèi)酰胺抗生素中的應(yīng)用。

背景技術(shù)：

1、青霉素?；?penicillin?acylase，pga)，又稱為青霉素酰胺酶或青霉素氨基水解酶。主要來自大腸埃希氏菌和巨大芽孢桿菌胞，該酶已大規(guī)模應(yīng)用于工業(yè)生產(chǎn)β-內(nèi)酰胺類抗生素的關(guān)鍵中間體和半合成β-內(nèi)酰胺類抗生素。該酶在酸性及中性條件下可用于催化6-氨基青霉素酸(6-apa)、7-氨基頭孢烷酸(7-aca)或7-氨基去乙酰氧基頭孢烷酸(7-adca)與酰基供體發(fā)生?；磻?yīng)，制備半合成抗生素；而在偏堿性條件下，可催化青霉素鉀鹽、頭孢菌素鈉鹽等水解成6-apa、7-adca或7-aca，而6-apa和7-adca(7-aca)是制備半合成抗生素的重要母核，可以制備高效、廣譜新型內(nèi)酰胺類抗生素。因此，青霉素酰化酶是工業(yè)上應(yīng)用價(jià)值很高的酶。

2、頭孢菌素是β-內(nèi)酰胺類抗生素，具有很高的療效，通常用于治療輕至嚴(yán)重的感染性疾病。根據(jù)2004年至2014年醫(yī)療保健數(shù)據(jù)庫的記錄，美國頭孢菌素的處方數(shù)量(占抗生素總量的47.5％)超過了窄譜和廣譜青霉素的數(shù)量(占抗生素總量的39.7％)(bush?andbradford.β-lactams?andβ-lactamase?inhibitors:an?overview.)。半合成頭孢菌素對革蘭氏陽性菌和革蘭氏陰性菌都有廣泛的活性，它們是基于雙環(huán)核合成的，雙環(huán)核由一個(gè)六元二氫噻嗪環(huán)和一個(gè)β-內(nèi)酰胺環(huán)連接而成。頭孢菌素骨架的兩個(gè)碳，c3和c7，為引入可變側(cè)鏈提供了巨大的可能性，從而顯著擴(kuò)展抗菌活性并增強(qiáng)針對β-內(nèi)酰胺酶的結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性。

3、而頭孢拉定為第一代半合成頭孢菌素，抗菌作用與頭孢氨芐相似。本品耐酸可以口服，吸收好，血藥濃度較高，特點(diǎn)是耐β-內(nèi)酰胺酶，對耐藥性強(qiáng)的金葡萄球菌及其它多種對廣譜抗生素耐藥的桿菌等有迅速而可靠的殺菌作用。具現(xiàn)有文獻(xiàn)報(bào)道，頭孢拉定的酶法催化合成活力無法滿足工業(yè)應(yīng)用的需求。因此，挖掘性能優(yōu)良的青霉素?；?，如ph耐受性好、合成底物范圍廣泛，熱穩(wěn)定性更高的菌株，為工業(yè)化生產(chǎn)提供更好的選擇。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路

1、本發(fā)明公開了一種青霉素?；干a(chǎn)菌株，該青霉素?；副磉_(dá)載體構(gòu)建和該酶在大腸桿菌(e.coli)bl21(de3)中的異源表達(dá)獲得重組酶，該青霉素酰化酶合成6-apa、7-aca、7-adca為母核的β-內(nèi)酰胺類抗生素。

2、本發(fā)明提供一種青霉素?；富蚱渫蛔凅w，其來自于克雷伯氏菌klebsiellasp.wp8-s18-esbl-06，所述青霉素?；妇哂衧eq?id?no.1所示的氨基酸序列；所述突變體在seq?id?no.1所示的氨基酸序列上存在下述氨基酸位點(diǎn)的替換突變：s356、i466、a72、s175、r171、a72、s290、r171、a72、s290、r171、a109、s290、f172、m168、y316、f360、m168、y316、f360、f313?y316、f360、f313、l542、r409、h481、f545、r409、y537、f545、f748、f543、f545、f748、y628、l546、f748、a651、l546、544h、t770、l546、679e、544h、664c、679c、544h、666h、679a。

3、優(yōu)選地，所述突變體在seq?id?no.1所示的氨基酸序列上存在下述氨基酸位點(diǎn)的替換突變：m168f/f313g、m168g/y316c、m168g/f360g、m168g/r409h、m168g/f545g、m168g/f748s、m168g/t770a、f313g/y316c、f313g/f360g、f313g/r409h、f313g/f545e、f313g/f748s、f313g/t770a、y316c/f360g、y316c/r409h、y316c/f748s、y316c/t770a、f360g/r409h、f360g/f545e、f360g/f748s、f360g/t770a、r409h/f545e、r409h/f748s、r409h/t770a、f545e/f748s、f545e/t770a、f748s/t770a。

4、本發(fā)明提供一種包括所述的青霉素酰化酶或其突變體的編碼核酸，所述核酸是dna，如cdna、基因組dna或重組dna；所述核酸是rna，如mrna或hnrna。

5、本發(fā)明進(jìn)一步提供包括所述的編碼基因的重組載體。具體地，其出發(fā)載體是pet-28a。

6、本發(fā)明提供包括所述重組載體的重組菌株。具體地，其是大腸桿菌，更具體的是將所述核酸與載體pet-28a構(gòu)建的表達(dá)載體轉(zhuǎn)化到大腸桿菌bl21(de3)所得。

7、本發(fā)明進(jìn)一步提供所述一種青霉素?；富蚱渫蛔凅w在合成β-內(nèi)酰胺抗生素，例如頭孢拉定中的應(yīng)用。

8、具體地，所述青霉素?；负铣梢?-apa、7-aca或7-adca為母核的頭孢菌素類抗生素。

9、本發(fā)明也提供一種制備β-內(nèi)酰胺類抗生素的方法，其包括：以β-內(nèi)酰胺類抗生素6-apa、7-aca、7-adca為底物，利用所述權(quán)利要求6所述重組菌株的細(xì)胞或其裂解產(chǎn)物進(jìn)行催化反應(yīng)，得到β-內(nèi)酰胺類抗生素；

10、所述催化反應(yīng)的溫度為10-40℃，具體為15℃；所述反應(yīng)的ph?6.5～9.5的磷酸鹽緩沖液中進(jìn)行的，具體ph?6.5至7.5，更具體為ph7.0；

11、反應(yīng)時(shí)間為0.5-24小時(shí)，具體為1小時(shí)。

12、本發(fā)明首先挖掘出了來源于klebsiella?sp.wp8-s18-esbl-06的青霉素?；缚捎糜诖呋?內(nèi)酰胺類抗生素母核7-adca、7-aca、6-apa合成β-內(nèi)酰胺類抗生素。更進(jìn)一步地，本發(fā)明所提供的青霉素酰化酶菌株，具有較為廣泛的底物譜，在生物催化制備β-內(nèi)酰胺類抗生素中具有較好的工業(yè)應(yīng)用前景。

技術(shù)特征：

1.一種青霉素酰化酶或其突變體，其特征在于該酶來自于克雷伯氏菌klebsiella?sp.?wp8-s18-esbl-06，所述青霉素?；妇哂衧eq?id?no.1所示的氨基酸序列；所述突變體在seq?id?no.1所示的氨基酸序列上存在下述氨基酸位點(diǎn)的替換突變：s356、i466、a72、s175、r171、a72?、s290、r171、a72?、s290、r171、a109、s290、f172、m168、y316、f360、m168、y316、f360、f313?y316、f360、f313、l542、r409、h481、f545、r409、y537、f545、f748、f543、f545、f748、y628、l546、f748、a651、l546、544h、t770、l546、679e、544h、664c、679c、544h、666h、679a。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述青霉素?；富蚱渫蛔凅w，其特征在于，所述突變體在seq?idno.1所示的氨基酸序列上存在下述氨基酸位點(diǎn)的替換突變：m168f/f313g、m168g/y316c、m168g/f360g、m168g/r409h、m168g/f545g、m168g/f748s、m168g/t770a、f313g/y316c、f313g/f360g、f313g/r409h、f313g/f545e、f313g/f748s、f313g/t770a、y316c/f360g、y316c/r409h、y316c/f748s、y316c/t770a、f360g/r409h、f360g/f545e、f360g/f748s、f360g/t770a、r409h/f545e、r409h/f748s、r409h/t770a、f545e/f748s、f545e/t770a、f748s/t770a。

3.一種包括權(quán)利要求1至2任一項(xiàng)所述的青霉素?；富蚱渫蛔凅w的編碼核酸，所述核酸是dna，如cdna、基因組dna或重組dna；所述核酸是rna，如mrna或hnrna。

4.包括權(quán)利要求3所述的編碼核酸的重組載體。

5.如權(quán)利要求4所述的重組載體，其特征在于，其出發(fā)載體是pet-28a。

6.包括權(quán)利要求4或5所述重組載體的重組菌株。

7.如權(quán)利要求6所述的重組菌株，其特征在于，其是大腸桿菌，更具體的是將權(quán)利要求3所述編碼核酸與載體pet-28a構(gòu)建的表達(dá)載體轉(zhuǎn)化到大腸桿菌bl21（de3）所得。

8.權(quán)利要求1或2所述一種青霉素?；富蚱渫蛔凅w在合成β-內(nèi)酰胺抗生素，例如頭孢拉定中的應(yīng)用。

9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的應(yīng)用，其特征在于，所述青霉素酰化酶合成以6-apa、7-aca或7-adca為母核的頭孢菌素類抗生素。

10.一種制備β-內(nèi)酰胺類抗生素的方法，其特征在于，所述方法包括：以β-內(nèi)酰胺類抗生素6-apa、7-aca、7-adca為底物，利用權(quán)利要求6所述重組菌株的細(xì)胞或其裂解產(chǎn)物進(jìn)行催化反應(yīng)，得到β-內(nèi)酰胺類抗生素；

技術(shù)總結(jié)
本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，公開了青霉素?；富蚱渫蛔凅w，構(gòu)建的菌株，以及酶法合成β?內(nèi)酰胺抗生素的方法。本發(fā)明獲得的青霉素?；缚纱呋?內(nèi)酰胺抗生素母核與?；w發(fā)生酰基化反應(yīng)，用于制備β?內(nèi)酰胺類抗生素，在生物酶法催化頭孢類藥物中間體的合成中具有良好工業(yè)應(yīng)用前景。

技術(shù)研發(fā)人員：孫周通,袁波,劉玲怡,李湘瑩,曲戈
受保護(hù)的技術(shù)使用者：中國科學(xué)院天津工業(yè)生物技術(shù)研究所
技術(shù)研發(fā)日：
技術(shù)公布日：2024/12/19