本發(fā)明屬于生物，具體涉及一種人源誘導(dǎo)性多能干細(xì)胞ips-clone?12c、外泌體的制備及其生發(fā)應(yīng)用。

背景技術(shù)：

1、隨著人口老齡化和生活方式的變化，脫發(fā)問(wèn)題日益成為全球性的健康與美學(xué)挑戰(zhàn)。脫發(fā)在臨床上可分為雄激素性脫發(fā)、斑禿、休止期脫發(fā)等。脫發(fā)是一個(gè)復(fù)雜的生理過(guò)程，其原因涉及遺傳、荷爾蒙水平、年齡、環(huán)境因素、生活方式等多個(gè)方面。不同脫發(fā)類(lèi)型的病因不盡相同，但都是毛囊萎縮、退化導(dǎo)致的。毛發(fā)生長(zhǎng)周期包括生長(zhǎng)期、退行期和休止期，一般情況下，毛發(fā)在生長(zhǎng)期結(jié)束后進(jìn)入退行期和休止期，隨后出現(xiàn)生理性脫落。當(dāng)毛發(fā)每天脫落數(shù)量超過(guò)100根時(shí)，就打破了毛發(fā)生長(zhǎng)的動(dòng)態(tài)平衡，從而導(dǎo)致病理性脫發(fā)。

2、藥物治療和毛發(fā)移植作為目前主要的脫發(fā)治療方式，存在顯著的局限性和問(wèn)題。臨床治療脫發(fā)的常用藥物主要有米諾地爾、非那雄胺、度他雄胺、氟他胺、比卡魯胺、螺內(nèi)酯等。然而，藥物治療脫發(fā)通常僅適用于特定類(lèi)型的脫發(fā)，且需要長(zhǎng)期持續(xù)使用，一旦停藥，脫發(fā)問(wèn)題往往會(huì)再次出現(xiàn)，導(dǎo)致患者需長(zhǎng)期接受藥物治療，并可能引發(fā)一系列副作用，例如頭皮刺激和瘙癢。此外，藥物治療的效果因個(gè)體差異而異，對(duì)于部分患者，療效可能并不顯著。毛發(fā)移植雖是一種較為直接的治療方法，但同樣存在諸多問(wèn)題。第一，作為一種外科手術(shù)，毛發(fā)移植具有一定的手術(shù)風(fēng)險(xiǎn)，包括感染和出血等，并且術(shù)后需要一定的恢復(fù)期，可能對(duì)患者的日常生活產(chǎn)生影響。第二，毛發(fā)移植依賴(lài)于患者自身的供體毛囊，對(duì)于大面積脫發(fā)的患者，供體毛囊可能不足以滿(mǎn)足需求。第三，盡管醫(yī)師在手術(shù)中會(huì)盡量模仿自然生長(zhǎng)的頭發(fā)，但移植效果仍可能與自然狀態(tài)存在差異。最后，毛發(fā)移植的費(fèi)用相對(duì)昂貴，對(duì)患者而言，經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)較重。

3、干細(xì)胞療法作為一種新興的再生醫(yī)學(xué)技術(shù)，近年來(lái)在各種疾病治療中顯示出巨大潛力。干細(xì)胞是一種具有自我增殖和多向分化潛能的特殊細(xì)胞，能夠利用其分泌的外泌體調(diào)控毛囊干細(xì)胞的生長(zhǎng)，從而促進(jìn)頭發(fā)的再生。干細(xì)胞外泌體是干細(xì)胞分泌的納米級(jí)胞外囊泡，包含多種生物活性分子，如蛋白質(zhì)、rna、脂質(zhì)等，能夠通過(guò)調(diào)節(jié)細(xì)胞間的通訊和信號(hào)傳導(dǎo)，促進(jìn)毛囊干細(xì)胞的修復(fù)和再生。

4、相比于藥物治療和毛囊移植治療的副作用和受限性，干細(xì)胞外泌體治療脫發(fā)的優(yōu)越性在于：（1）多類(lèi)型脫發(fā)適用性。干細(xì)胞外泌體中包含多種生物分子，如蛋白質(zhì)、rna、脂質(zhì)等。這些生物分子可以調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖、分化、免疫調(diào)節(jié)等多種生理過(guò)程，在多種脫發(fā)機(jī)制中發(fā)揮作用，從而外泌體治療具有較廣泛的適用性，可用于多種類(lèi)型的脫發(fā)，為更多患者提供了選擇。（2）無(wú)手術(shù)風(fēng)險(xiǎn)。相較于植發(fā)手術(shù)，外泌體治療脫發(fā)無(wú)需手術(shù)，可外用或局部頭皮注射，避免了手術(shù)風(fēng)險(xiǎn)和術(shù)后的不適感。（3）安全性與患者友好性。外泌體通過(guò)天然的生物學(xué)信號(hào)傳導(dǎo)途徑，更符合人體生理特點(diǎn)，有望降低不良反應(yīng)的發(fā)生率，提高治療的安全性，是一種更為安全和舒適的治療選擇。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路

1、基于背景技術(shù)中存在的問(wèn)題，本發(fā)明的目的在于提高干細(xì)胞外泌體的生物活性和穩(wěn)定性，提高其治療效果，提出一種人源誘導(dǎo)性多能干細(xì)胞ips-clone?12c、外泌體的制備及其生發(fā)應(yīng)用，為脫發(fā)患者提供一種全新的、具有高效和低副作用的治療選擇。

2、為了實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用的技術(shù)方案如下：

3、一種人源誘導(dǎo)性多能干細(xì)胞ips-clone?12c，其特征在于：以有限稀釋法將人源誘導(dǎo)性多能干細(xì)胞ipsc（atcc細(xì)胞株編號(hào)：bys0112）鋪種于96孔板中，放置于低氧培養(yǎng)箱培養(yǎng)，每天更換無(wú)飼養(yǎng)層維持培養(yǎng)基，對(duì)96孔板中長(zhǎng)出的細(xì)胞克隆連續(xù)傳代30次，篩選出在低氧條件下連續(xù)傳代30次仍具有快速生長(zhǎng)、清晰邊緣、良好緊密度、無(wú)分化特征以及均勻鵝卵石狀形態(tài)的細(xì)胞克隆，該細(xì)胞克隆為ips-clone?12c，該細(xì)胞克隆分類(lèi)命名為人源誘導(dǎo)性多能干細(xì)胞ips-clone?12c?homo?sapiens，2024年7月23日保藏于中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏編號(hào)為cctcc?no:?c2024238。

4、進(jìn)一步的，培養(yǎng)方式是對(duì)ips-clone?12c克隆進(jìn)行消化，并繼續(xù)在無(wú)飼養(yǎng)層維持培養(yǎng)基中進(jìn)行擴(kuò)增和傳代，當(dāng)細(xì)胞融合度達(dá)到70%?-?80%時(shí)，收集培養(yǎng)上清液，并將ips-clone12c細(xì)胞進(jìn)行消化和傳代，以確保其持續(xù)生長(zhǎng)和穩(wěn)定性。

5、一種制備人源誘導(dǎo)性多能干細(xì)胞ips-clone?12c外泌體的方法，其特征在于：

6、s1：篩選獲得人源誘導(dǎo)性多能干細(xì)胞株ips-clone?12c；

7、s2：收集ips-clone?12c培養(yǎng)上清液，提取和純化外泌體顆粒；

8、s3：對(duì)獲得的外泌體進(jìn)行形態(tài)學(xué)和成分功能分析，以確保外泌體的質(zhì)量及其功能特性。

9、進(jìn)一步的，通過(guò)較高速度離心去除亞細(xì)胞成分后，再通過(guò)超高速離心將外泌體沉淀分離出來(lái)，將外泌體沉淀用pbs緩沖液重懸并清洗，再經(jīng)過(guò)超高速度離心，以獲得純度較高的外泌體。

10、進(jìn)一步的，采用密度梯度離心或免疫捕獲技術(shù)來(lái)進(jìn)一步純化外泌體，以確保其純度和功能。

11、進(jìn)一步的，采用透射電子顯微鏡、納米顆粒跟蹤分析、蛋白質(zhì)印跡法以及蛋白質(zhì)組學(xué)方法對(duì)獲得的外泌體進(jìn)行形態(tài)學(xué)和成分功能分析。

12、一種人源誘導(dǎo)性多能干細(xì)胞ips-clone?12c外泌體的應(yīng)用，其特征在于：促進(jìn)毛發(fā)再生的應(yīng)用，包括改善毛囊萎縮、修復(fù)毛囊損傷、促進(jìn)毛囊再生。

13、一種人源誘導(dǎo)性多能干細(xì)胞ips-clone?12c外泌體的應(yīng)用方法，其特征在于：在需要促進(jìn)毛發(fā)再生的部位通過(guò)局部施用ips-clone?12c外泌體，刺激毛囊干細(xì)胞的增殖和分化，縮短毛發(fā)再生周期。

14、進(jìn)一步的，所述局部施用方式為注射法、噴霧法、貼片法、局部浸泡法、納米載體遞送法中的一種或多種。

15、通過(guò)上述技術(shù)方案可以得到以下有益效果：

16、細(xì)胞來(lái)源安全可靠且無(wú)倫理爭(zhēng)議：ips-clone?12c源自atcc提供的人源誘導(dǎo)性多能干細(xì)胞，經(jīng)過(guò)嚴(yán)格的培養(yǎng)篩選，該細(xì)胞株在低氧條件下連續(xù)傳代30次仍表現(xiàn)具有活力強(qiáng)、穩(wěn)定性高且無(wú)分化表型的特征，便于擴(kuò)增和傳代，同時(shí)無(wú)免疫排斥問(wèn)題，適宜于臨床研究和應(yīng)用。

17、ips-clone?12c外泌體具備促進(jìn)生發(fā)和降低炎癥的特性：ips-clone?12c外泌體能夠直接作用于毛囊干細(xì)胞，促進(jìn)毛囊干細(xì)胞的增殖，有助于從根源上提高對(duì)毛囊干細(xì)胞的調(diào)控效果，適用于多種脫發(fā)類(lèi)型的患者。

18、綜上，本發(fā)明不僅在促進(jìn)毛發(fā)生長(zhǎng)方面表現(xiàn)出顯著效果，同時(shí)具備高安全性和低副作用的優(yōu)點(diǎn)，為脫發(fā)患者提供了一種高效、低副作用的治療選擇，展現(xiàn)了廣泛的臨床應(yīng)用前景。

技術(shù)特征：

1.一種人源誘導(dǎo)性多能干細(xì)胞ips-clone?12c，其特征在于：以有限稀釋法將人源誘導(dǎo)性多能干細(xì)胞ipsc鋪種于96孔板中，放置于低氧培養(yǎng)箱培養(yǎng)，每天更換無(wú)飼養(yǎng)層維持培養(yǎng)基，對(duì)96孔板中長(zhǎng)出的細(xì)胞克隆連續(xù)傳代30次，篩選出在低氧條件下連續(xù)傳代30次仍具有快速生長(zhǎng)、清晰邊緣、良好緊密度、無(wú)分化特征以及均勻鵝卵石狀形態(tài)的細(xì)胞克隆，該細(xì)胞克隆為人源誘導(dǎo)性多能干細(xì)胞ips-clone?12c，2024年7月23日保藏于中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏編號(hào)為cctcc?no:?c2024238。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種人源誘導(dǎo)性多能干細(xì)胞ips-clone?12c，其特征在于：培養(yǎng)方式是對(duì)ips-clone?12c克隆進(jìn)行消化，并繼續(xù)在無(wú)飼養(yǎng)層維持培養(yǎng)基中進(jìn)行擴(kuò)增和傳代，當(dāng)細(xì)胞融合度達(dá)到70%?-?80%時(shí)，收集培養(yǎng)上清液，并將ips-clone?12c細(xì)胞進(jìn)行消化和傳代，以確保其持續(xù)生長(zhǎng)和穩(wěn)定性。

3.一種制備權(quán)利要求1所述的人源誘導(dǎo)性多能干細(xì)胞ips-clone?12c外泌體的方法，其特征在于：

4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的一種制備人源誘導(dǎo)性多能干細(xì)胞ips-clone?12c外泌體的方法，其特征在于：通過(guò)較高速度離心去除亞細(xì)胞成分后，再通過(guò)超高速離心將外泌體沉淀分離出來(lái)，將外泌體沉淀用pbs緩沖液重懸并清洗，再經(jīng)過(guò)超高速度離心，以獲得純度較高的外泌體。

5.根據(jù)權(quán)利要求3所述的一種制備人源誘導(dǎo)性多能干細(xì)胞ips-clone?12c外泌體的方法，其特征在于：采用密度梯度離心或免疫捕獲技術(shù)來(lái)進(jìn)一步純化外泌體，以確保其純度和功能。

6.根據(jù)權(quán)利要求3所述的一種制備人源誘導(dǎo)性多能干細(xì)胞ips-clone?12c外泌體的方法，其特征在于：采用透射電子顯微鏡、納米顆粒跟蹤分析、蛋白質(zhì)印跡法以及蛋白質(zhì)組學(xué)方法對(duì)獲得的外泌體進(jìn)行形態(tài)學(xué)和成分功能分析。

7.一種人源誘導(dǎo)性多能干細(xì)胞ips-clone?12c外泌體的應(yīng)用，其特征在于：促進(jìn)毛發(fā)再生的應(yīng)用，包括改善毛囊萎縮、修復(fù)毛囊損傷、促進(jìn)毛囊再生。

8.一種人源誘導(dǎo)性多能干細(xì)胞ips-clone?12c外泌體的生發(fā)應(yīng)用，其特征在于：在需要促進(jìn)毛發(fā)再生的部位通過(guò)局部施用ips-clone?12c外泌體，刺激毛囊干細(xì)胞的增殖和分化，縮短毛發(fā)再生周期。

9.根據(jù)權(quán)利要求8所述一種人源誘導(dǎo)性多能干細(xì)胞ips-clone?12c外泌體的生發(fā)應(yīng)用，其特征在于：所述局部施用方式為注射法、噴霧法、貼片法、局部浸泡法、納米載體遞送法中的一種或多種。

技術(shù)總結(jié)
本發(fā)明公開(kāi)了一種人源誘導(dǎo)性多能干細(xì)胞iPS?clone?12c、外泌體的制備及其生發(fā)應(yīng)用，篩選獲得人源誘導(dǎo)性多能干細(xì)胞iPS?clone?12c，該細(xì)胞株在低氧條件下連續(xù)傳代30次仍具有快速生長(zhǎng)、清晰邊緣、良好緊密度、無(wú)分化特征以及均勻鵝卵石狀形態(tài)的特征，收集iPS?clone?12c培養(yǎng)上清液，通過(guò)超速離心、密度梯度離心或免疫捕獲等手段，富集和純化外泌體顆粒。進(jìn)一步的，采用透射電子顯微鏡、納米顆粒跟蹤分析、蛋白質(zhì)印跡法以及蛋白質(zhì)組學(xué)等方法對(duì)獲得的外泌體進(jìn)行形態(tài)學(xué)和成分功能分析，以確保外泌體的質(zhì)量及其功能特性，結(jié)果表明，本發(fā)明中的iPS?clone?12c外泌體顯示出卓越的生物活性和穩(wěn)定性，在促進(jìn)毛發(fā)再生方面具有顯著效果。因此，本發(fā)明為脫發(fā)患者提供了一種高效、低副作用的治療選擇。

技術(shù)研發(fā)人員：阿曼尼·哈莫德·阿里·塞拉吉,居怡,張文玉,吳超,湯燚聰,李亞楠,宣之勝,施戈韜,高博
受保護(hù)的技術(shù)使用者：蘇州志恒生物科技有限公司
技術(shù)研發(fā)日：
技術(shù)公布日：2024/12/17