本發(fā)明涉及菌劑制備，具體涉及一種耐鹽嗜熱的副短短芽孢桿菌h166及其篩選方法與應(yīng)用。

背景技術(shù)：

1、我國餐廚廢棄物的年產(chǎn)生量逐年增加，其處理需遵循減量化、資源化和無害化的原則。但餐廚廢棄物具有油脂含量高、鹽分含量高等特性，因而增加了運輸和處理的難度。近年來，微生物菌劑接種技術(shù)在餐廚廢棄物好氧發(fā)酵中的應(yīng)用前景廣闊，已有研究表明在餐廚廢棄物好氧發(fā)酵過程中添加菌劑能夠顯著降解餐廚廢棄物中的粗脂肪和粗纖維，提高粗蛋白含量等，是高效處理餐廚廢棄物將其變?yōu)橛袡C肥料的有效方式之一。因此，需要進一步優(yōu)化微生物的適應(yīng)性，以提升微生物在餐廚廢棄物好氧發(fā)酵過程中的作用，加速處理餐廚廢棄物減少堆積造成的環(huán)境問題。

2、土壤鹽漬化是世界性的生態(tài)問題，受鹽漬化化的影響，亟需改善土地退化現(xiàn)狀，提高農(nóng)業(yè)生產(chǎn)力。目前，生物治理鹽土的方式主要依賴于微生物肥料，通過嗜鹽微生物制備菌肥改善鹽土的透水和透氣性等，以提高農(nóng)作物的產(chǎn)量。餐廚廢棄物本身具有高鹽分的特性，目前餐廚廢棄物的菌劑主要是外源微生物，鮮有從自身來源富集篩選得到耐鹽菌株并制備成菌劑的。若從其與鹽土的混合溶液中富集篩選得到本土的耐鹽嗜熱微生物，可對餐廚廢棄物進行更環(huán)保、徹底的肥料化利用，同時或可對解決土壤鹽漬化問題具有重要意義。

3、餐廚廢棄物現(xiàn)有的好氧發(fā)酵菌劑大多是從原料外篩選得來的外源微生物，雖具有一定的廣譜適宜性，但難以預(yù)料菌劑中的菌株和土著微生物間的相互作用，不足以針對餐廚廢棄物的高油高鹽等特殊組分物料進行加速發(fā)酵，這使得在接種過程中需要進行一定的探索預(yù)試。同時，需要考慮菌劑接種的成本。

4、因此，針對現(xiàn)有技術(shù)不足，本發(fā)明提供了一種耐鹽嗜熱的副短短芽孢桿菌h166及其篩選方法與應(yīng)用，旨在從鹽脅迫條件下的餐廚廢棄物堆肥過程中篩選得到一種耐鹽嗜熱菌株，制備成菌劑應(yīng)用于餐廚廢棄物中，來強化餐廚廢棄物的好氧發(fā)酵過程。

技術(shù)實現(xiàn)思路

1、本發(fā)明的目的是提供一種耐鹽嗜熱的副短短芽孢桿菌h166及其篩選方法與應(yīng)用，填補目前技術(shù)的空白。

2、本發(fā)明的目的通過以下技術(shù)方案來實現(xiàn)：

3、一種耐鹽嗜熱的副短短芽孢桿菌h166及其篩選方法，所述耐鹽嗜熱的副短短芽孢桿菌(brevibacillus?parabrevis)h166，保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏日期為2020年11月26日，保藏編號為cgmccno.21234；

4、所述耐鹽嗜熱的副短短芽孢桿菌h166的篩選方法，具體包括以下步驟：

5、(1)原料采集：

6、采集餐廚廢棄物樣品，同時，采集鹽土，剔除較大粒徑的雜物后，通過四分法混勻裝入自封袋，于4℃儲存?zhèn)溆茫?/p>

7、(2)富集培養(yǎng)：

8、將步驟(1)采集的餐廚廢棄物和鹽土以及木屑充分混勻，置于容器中在50～70℃的恒溫條件下培養(yǎng)28～32d，培養(yǎng)過程中每5～6d向容器中添加水以補充水分，避免水分流失影響微生物活性；

9、(3)稀釋涂布：

10、將富集樣品溶液稀釋到10-3、10-4、10-5和10-6，制備經(jīng)除菌過濾器過濾的1～2％溴甲酚紫，備用；

11、制備含有nacl的lb選擇培養(yǎng)基：稱取胰蛋白胨，酵母提取物，nacl，放入容器1中，加入少量去離子水將溶質(zhì)混勻后，用去離子水少量多次沖洗定容，轉(zhuǎn)移全部溶液至容器2中，并用封口膜包扎121℃滅菌15～25min，取出培養(yǎng)基置于室溫待冷卻至45～55℃，加入溴甲酚紫和溶解到甲醇中的放線菌酮，混勻后在超凈臺中進行倒平板操作，冷凝成固體平板后，備用；

12、繼續(xù)在超凈臺中操作，分別取10-3、10-4、10-5和10-6的富集樣品稀釋液，涂布到含nacl的lb選擇培養(yǎng)基中，在25～35℃恒溫條件下培養(yǎng)過夜，觀察各平板的生長情況；

13、(4)純化保存：

14、挑選菌落分散生長且均勻的平板，挑取菌落形態(tài)不同的單菌落進行劃線純化，得到的單菌株使用40％的甘油儲存于-80℃，此外，將純化后的菌株挑到離心管中，加入lb肉湯培養(yǎng)基，在28～33℃恒溫條件下培養(yǎng)20-28h，10000xg離心5～7min，去除上清液后儲存于-20℃條件下，待提取菌株dna用；

15、(5)平板水解試驗：

16、配制蛋白質(zhì)、淀粉、油脂水解培養(yǎng)基，3個水解培養(yǎng)基滅菌后進行倒平板操作，待平板冷凝至固態(tài)，將分離純化得到的菌株分別接種至3種水解培養(yǎng)基中，觀察是否出現(xiàn)水解透明圈，若出現(xiàn)說明該種底物已被水解，菌株具有降解該底物的能力，反之則無；

17、(6)菌株提取和鑒定：

18、提取已篩選得到的上述耐鹽菌株，選擇通用引物27f和1492r進行pcr擴增，產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測合格后，進行檢測，在水解培養(yǎng)基試驗中觀察得到菌株h166具有很強的油脂降解能力，經(jīng)測序鑒定得知其為副短短芽孢桿菌(brevibacillus?parabrevis)h166，rrna序列相似度達98.90％；

19、(7)菌劑的制備：

20、a.菌株生長曲線繪制：

21、取單一菌落于離心管中28～32℃恒溫條件下培養(yǎng)過夜，至od600值為0.8～1，以1～2％的體積比進行接種至新的lb培養(yǎng)基中，于恒溫搖床上28～32℃下170～200r/min培養(yǎng)16～22h，吸取培養(yǎng)液置于96孔板中測定od600值；

22、b.酶活定量測定：

23、將分離純化培養(yǎng)所得的菌株h166在lb培養(yǎng)基上活化后，28～32℃恒溫條件下培養(yǎng)10～16h，挑取單菌于24孔細胞培養(yǎng)板中，28～32℃下170～200r/min培養(yǎng)10～16h，分別轉(zhuǎn)接至裝有蛋白酶、脂肪酶和淀粉酶活性發(fā)酵液的24孔板中，35～39℃180～230r/min培養(yǎng)24～26h，將發(fā)酵液在5000～6000rpm4～5℃的條件下離心10min，所得上清液經(jīng)過濾后即為粗酶液；

24、c.一級種子培養(yǎng)液：

25、將上述菌株在超凈臺中接種至含lb液體培養(yǎng)基的容器中，在28～32℃下170～200r/min的恒溫搖床中培養(yǎng)46～54h，菌液od600值超過3.0時停止培養(yǎng)，即得到一級種子培養(yǎng)液；

26、d.二級種子培養(yǎng)液：

27、將一級種子培養(yǎng)液在超凈臺中接種至含lb液體培養(yǎng)基的容器中，在28～32℃下170～200r/min的恒溫搖床中培養(yǎng)34～40h，菌液od600值超過3.0時停止培養(yǎng)，得到的二級種子培養(yǎng)液即為耐鹽嗜熱的副短短芽孢桿菌h166。

28、優(yōu)選地，步驟(5)中，所述蛋白質(zhì)水解培養(yǎng)基的制備方法：蛋白胨，牛肉膏，nacl，酪蛋白，cacl2，l-酪氨酸，瓊脂，蒸餾水，ph調(diào)節(jié)至7.0～7.2，121℃滅菌20min，冷卻至55～65℃，加入滅菌的吐溫80。

29、優(yōu)選地，步驟(5)中，所述淀粉水解培養(yǎng)基的制備方法：可溶性淀粉，蛋白胨，nacl，瓊脂，曲利苯藍，蒸餾水，ph7.0-7.2，121℃滅菌20min。

30、優(yōu)選地，步驟(5)中，所述油脂水解培養(yǎng)基的制備方法：油脂，1.6％中性紅，蛋白胨，氯化鈉，牛肉膏，瓊脂，蒸餾水，ph調(diào)節(jié)至7.0～7.2，121℃滅菌20min。

31、優(yōu)選地，步驟(7)中所述步驟b中所述蛋白酶的制備方法：吸取粗酶液，加入預(yù)先經(jīng)36～38℃孵育的0.5％酪素溶液，36～38℃水浴25～35min，再加入10％tca溶液終止反應(yīng)，12000r/min離心5～8min后吸取上清液，測定酪氨酸含量；

32、優(yōu)選地，步驟(7)中所述步驟b中所述脂肪酶的制備方法：將聚乙烯醇溶液與橄欖油以3∶1(v/v)混合，超聲處理5～8min，制成乳白色的聚乙烯醇乳化液，即為底物溶液，吸取4ml底物溶液，加入5ml磷酸緩沖鹽溶液，于38～42℃水浴5～6min后加入1ml粗酶液，混勻后恒溫反應(yīng)12～18min，加入15ml95％的乙醇終止反應(yīng)，測定脂肪酸所需的酶量。

33、優(yōu)選地，步驟(7)中所述步驟b中所述淀粉酶的制備方法：吸取0.1ml粗酶液，加入到1％可溶性淀粉溶液2ml中，浸提在36～38℃水浴中孵育25～35min，每5min振蕩一次，再經(jīng)沸水浴5～6min后冷卻到室溫，加入3ml3，5-二硝基水楊酸試劑，再次經(jīng)沸水浴5～6min后迅速冷卻至室溫，定容，測od值。

34、由于上述技術(shù)方案運用，本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比具有如下有益效果：

35、1、本發(fā)明h166耐鹽菌株來源于餐廚廢棄物，具有較高的脂肪酶活性，其制備成的菌劑可幫助加速餐廚廢棄物好氧發(fā)酵進程，為實現(xiàn)餐廚廢棄物快速好氧發(fā)酵提供了一種高效環(huán)保的微生物預(yù)處理方式；

36、2、本發(fā)明h166菌劑有助于提高餐廚廢棄物堆體的最高溫度和延長堆體高溫期的時長，堆體溫度的顯著變化有助于嗜熱微生物保持較高的活性，從而促進堆肥進程；

37、3、本發(fā)明h166菌劑提高了微生物利用有機質(zhì)的效率以及腐熟效率，使得發(fā)酵效果更佳。