本發(fā)明屬于生物和酶工程領(lǐng)域，涉及一系列具有高熱穩(wěn)定性的溶葡萄球菌酶突變體及其制備方法和應(yīng)用。

背景技術(shù)：

1、溶葡萄球菌酶(lst)是擬葡萄球菌合成的一種鋅離子依賴型的肽酶，其可有效的切割細菌細胞壁肽聚糖交聯(lián)結(jié)構(gòu)甘氨酸五肽橋中的第2位和第3位甘氨酸形成的肽鍵，從而起到溶壁殺菌的作用。因此該蛋白具有特異性，可特異性的殺死金黃色葡萄球菌、表皮葡萄球菌和溶血性葡萄球菌。目前國內(nèi)、外研究人員利用基因重組技術(shù)已將此酶成功表達于多種工程菌中，并且國內(nèi)已批準溶葡萄球菌酶一批新藥臨床實驗，可應(yīng)用于醫(yī)藥、美妝、食品、黏膜消毒、口腔護理、私護、獸藥、寵物護理等多個領(lǐng)域，具有強大的市場潛力。

2、酶的熱穩(wěn)定性表征酶分子在高溫下維持自身結(jié)構(gòu)和活性的能力，是評價酶應(yīng)用價值的重要標準。熱穩(wěn)定的酶具有提高化學(xué)反應(yīng)速率、簡化工藝、降低成本、提高產(chǎn)品質(zhì)量，活性穩(wěn)定和耐儲藏的優(yōu)點。所以提高溶葡萄球菌酶的熱穩(wěn)定性一直是科研和生產(chǎn)關(guān)注的熱點，也是限制其擴大應(yīng)用場景的重要因素。

3、基于以上背景，本發(fā)明通過理性設(shè)計獲得一系列高熱穩(wěn)定性的溶葡萄球菌酶，為后續(xù)的生產(chǎn)和擴寬應(yīng)用場景奠定了基礎(chǔ)。

技術(shù)實現(xiàn)思路

1、本發(fā)明的目的在于提供一系列高穩(wěn)定性的溶葡萄球菌酶突變體，及其制備方法和應(yīng)用，以解決目前存在的熱穩(wěn)定性問題。

2、為了實現(xiàn)以上目的，本發(fā)明采用以下技術(shù)方案：

3、本發(fā)明提供了一種高熱穩(wěn)定性的溶葡萄球菌酶突變體，野生型溶葡萄球菌酶的氨基酸序列為seq?id?no.1所示，所述突變體包含以下一個或多個突變位點：k45y、y85f、n120g、m131l、s190a和190w。

4、進一步地，所述溶葡萄球菌酶包括不限于seq?id?no.1所示的序列，還包括截短形式的序列。

5、進一步地，所述包含多個突變位點的突變體優(yōu)選自以下位點的組合，包括但不局限于以下突變體：k45y/y85f；k45y/n120g；k45y/s190a；y85f/s190a；y85f/s190w；y85f/m131l；y85f/n120g；n120g/s190a；k45y/y85f/n120g；y85f/n120g/s190a；y85f/m131l/s190a；y85f/n120g/m131l。

6、本發(fā)明還提供了一種上述突變體的表達載體，包括但不局限于pet30a+。

7、本發(fā)明還提供了一種表達上述突變體的重組菌株。

8、進一步地，所述重組菌株優(yōu)選大腸桿菌，但不局限于大腸桿菌，還可以是其他的原核細胞或真核細胞。

9、更進一步地，所述真核細胞包括畢赤酵母；所述原核細胞包括乳酸乳球菌、枯草芽孢桿菌、葡萄球菌和鏈球菌。

10、本發(fā)明還提供了上述突變體的制備方法，包括以下步驟：利用定點突變構(gòu)建突變體表達載體，轉(zhuǎn)入大腸桿菌bl21(de3)感受態(tài)中并進行誘導(dǎo)表達。離心收菌超聲破碎，取上清經(jīng)ni柱純化，超濾管濃縮脫鹽。

11、本發(fā)明還提供了上述突變體、多聚核苷酸分子、重組表達載體、宿主細胞在抗葡萄球菌領(lǐng)域中的應(yīng)用。

12、進一步地，所述葡萄球菌包括但不限于表皮葡萄球菌、溶血性葡萄球菌、盧格敦葡萄球菌、腐生葡萄球菌和金黃色葡萄球菌。

13、有益效果在于，本發(fā)明基于結(jié)構(gòu)分析，結(jié)合多種熱穩(wěn)定性設(shè)計軟件的系統(tǒng)測試，以溶葡萄球菌酶的熱穩(wěn)定性為指標并以此進行突變體設(shè)計，獲得了一系列在tm值提高的突變體。其中篩選得到的有益突變體在60℃條件下的酶活損失減少5.8％-37.9％，tm值提高0.3-7.0℃。并且與野生型溶葡萄球菌酶進行活性比較相比，該突變體的酶活基本相當。為后續(xù)的存儲、運輸和擴大應(yīng)用場景提供了便利。

技術(shù)特征：

1.一種高熱穩(wěn)定性的溶葡萄球菌酶突變體，其特征在于，其是在氨基酸序列為seq?idno.1所示的基礎(chǔ)上，存在以下一個或多個突變位點：k45y、y85f、n120g、m131l、s190a和s190w。

2.如權(quán)利要求1所述的溶葡萄球菌酶突變體，其特征在于，所述突變位點選自以下位點的組合，包括但不局限于以下突變體：k45y/y85f；k45y/n120g；k45y/s190a；y85f/s190a；y85f/s190w；y85f/m131l；y85f/n120g；n120g/s190a；k45y/y85f/n120g；y85f/n120g/s190a；y85f/m131l/s190a；y85f/n120g/m131l。

3.如權(quán)利要求1或2所述的溶葡萄球菌酶突變體的編碼核酸。

4.含有如權(quán)利要求3所述的編碼核酸的表達載體，優(yōu)選地所述表達載體是原核表達載體，包括但不局限于pet30a+。

5.含有如權(quán)利要求3所述的編碼核酸或如權(quán)利要求4所述的表達載體的重組菌株，具體地，其是真菌或細菌。

6.如權(quán)利要求5所述的重組菌株，其特征在于，所述真菌是畢赤酵母，所述細菌是乳酸乳球菌、枯草芽孢桿菌、葡萄球菌和鏈球菌或大腸桿菌。

7.如權(quán)利要求6所述的重組菌株，其特征在于，所述大腸桿菌大腸桿菌bl21（de3）。

8.如權(quán)利要求1或2所述的溶葡萄球菌酶突變體，含有如權(quán)利要求3所述的編碼核酸，如權(quán)利要求4所述的表達載體，如權(quán)利要求5或6所述的重組菌株在制備抗葡萄球菌的制品中的應(yīng)用。

9.如權(quán)利要求8所述的應(yīng)用，其特征在于，所述葡萄球菌包括但不限于表皮葡萄球菌、溶血性葡萄球菌、盧格敦葡萄球菌、腐生葡萄球菌或金黃色葡萄球菌。

10.如權(quán)利要求8或9所述的應(yīng)用，其特征在于，所述制品是食品、飼料、洗滌用品、藥品、化妝品和醫(yī)療器械。

技術(shù)總結(jié)
本發(fā)明提供了一系列具有高熱穩(wěn)定性的溶葡萄球菌酶突變體及其制備方法和應(yīng)用，屬于生物技術(shù)領(lǐng)域和酶工程技術(shù)領(lǐng)域?；诮Y(jié)構(gòu)分析，并結(jié)合多種熱穩(wěn)定性分析軟件，以熱穩(wěn)定性為評價指標，對野生型溶葡萄球菌酶進行理性設(shè)計和改造，獲得了一系列熱穩(wěn)定性明顯提高的突變體。其中，有益突變體在60℃條件下的酶活損失減少5.8%?37.9%，Tm值提高0.3?7.0℃，酶活與野生型相當。因此本發(fā)明提供的溶葡萄球菌酶突變體相較野生型具有更好的熱穩(wěn)定性，具有更好的工業(yè)應(yīng)用場景。

技術(shù)研發(fā)人員：張曉云,張曉立,張慧澤,朱銘薇,李華珍,章家泉
受保護的技術(shù)使用者：百葵銳（深圳）生物科技有限公司
技術(shù)研發(fā)日：
技術(shù)公布日：2024/12/26