本發(fā)明屬于生物醫(yī)藥領(lǐng)域，涉及一種能夠結(jié)合白細(xì)胞免疫球蛋白樣受體亞家族b成員2(lilrb2)的抗體或其抗原結(jié)合片段。本發(fā)明還涉及所述抗體或其抗原結(jié)合片段的應(yīng)用。

背景技術(shù)：

1、lilrb2是抑制性白細(xì)胞免疫球蛋白樣受體(the?leukocyte?immunoglobulin-like?receptor，lir)家族的成員，屬于lir受體的亞家族b類，又稱之為ilt4。該蛋白的胞外區(qū)有免疫球蛋白類似(ig-like)結(jié)構(gòu)域，胞內(nèi)區(qū)域有基于酪氨酸的免疫受體抑制性基序(immunoreceptor?tyrosine-based?inhibitory?motif，itim)。已發(fā)現(xiàn)在實(shí)體瘤中，lilrb2可以與其配體人白細(xì)胞抗原g(human?leukocyte?antigen?g，hla-g)相互作用，誘導(dǎo)髓系細(xì)胞產(chǎn)生耐受性表型，從而抑制t細(xì)胞的活化并導(dǎo)致腫瘤免疫逃逸。因此，阻斷l(xiāng)ilrb2和hla-g的結(jié)合能夠增強(qiáng)腫瘤免疫反應(yīng)。

2、默克開(kāi)發(fā)了lilrb2阻斷抗體mk-4830，其處于ii期臨床試驗(yàn)階段，在多種實(shí)體瘤患者中驗(yàn)證mk-4830對(duì)pd1抑制劑治療無(wú)效的患者的治療作用。目前尚未有針對(duì)lilrb2的抗體上市。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路

1、為了解決上述技術(shù)問(wèn)題，本發(fā)明的目的是提供一種抗lilrb2的抗體或其抗原結(jié)合片段，所述抗體或其抗原結(jié)合片段能夠以高親和力和特異性結(jié)合lilrb2，從而阻斷l(xiāng)ilrb2在腫瘤微環(huán)境中與癌癥免疫抑制相關(guān)的配體hla-g等的相互作用。進(jìn)一步地，基于所述抗體或其抗原結(jié)合片段對(duì)lilrb2的結(jié)合作用，本發(fā)明的另一個(gè)目的提供其在腫瘤中的治療用途。

2、本發(fā)明提供以下技術(shù)方案。

3、一方面，本發(fā)明提供一種抗體或其抗原結(jié)合片段，所述抗體或其片段能夠特異性結(jié)合lilrb2，特別是人lilrb2。根據(jù)本發(fā)明的具體實(shí)施方式，本發(fā)明的抗體為采用人lilrb2的胞外區(qū)作為免疫原而得到的鼠抗，以及在對(duì)所述鼠抗進(jìn)行人源化改造后得到的人源化抗體。

4、具體而言，本發(fā)明提供的抗體或其抗原結(jié)合片段包含重鏈互補(bǔ)決定區(qū)(hcdrs，即hcdr1、hcdr2、hcdr3)和輕鏈互補(bǔ)決定區(qū)(lcdrs，即lcdr1、lcdr2、lcdr3)，并且所述重鏈和輕鏈互補(bǔ)決定區(qū)來(lái)自以下氨基酸序列組合：

5、(1)示于seq?id?no:1的氨基酸序列；和示于seq?id?no:2的氨基酸序列；或

6、(2)示于seq?id?no:3的氨基酸序列；和示于seq?id?no:4的氨基酸序列。

7、上述各項(xiàng)的氨基酸序列分別為本發(fā)明提供的具體抗lilrb2抗體(鼠抗和人源化抗體)的重鏈可變區(qū)和輕鏈可變區(qū)的氨基酸序列；參見(jiàn)本發(fā)明的實(shí)施例部分。采用本領(lǐng)域公知或常規(guī)的抗體重鏈或輕鏈中互補(bǔ)決定區(qū)的定義工具(例如本發(fā)明實(shí)施例中采用的kabat方案)，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以容易地確定二者組合形成抗體時(shí)所包含的重鏈和輕鏈cdrs。包含這些重鏈和輕鏈cdr組合中每一個(gè)組合的抗體或其抗原結(jié)合片段均在本發(fā)明的保護(hù)范圍內(nèi)。

8、進(jìn)一步地，本發(fā)明提供的抗體或其抗原結(jié)合片段包含以下重鏈cdrs和輕鏈cdrs的組合(hcdr1、hcdr2、hcdr3；和，lcdr1、lcdr2、lcdr3)：

9、包含依次示于seq?id?no:9、seq?id?no:10、seq?id?no:11的氨基酸序列的hcdr1、hcdr2、hcdr3；和，包含依次示于seq?id?no:12、seq?id?no:13、seq?id?no:14的氨基酸序列的lcdr1、lcdr2、lcdr3。

10、本發(fā)明提供的抗體或其抗原結(jié)合片段為抗lilrb2的抗體或其抗原結(jié)合片段，優(yōu)選地，所述lilrb2為人lilrb2。

11、優(yōu)選地，本發(fā)明提供的抗體或其抗原結(jié)合片段包含重鏈可變區(qū)(vh)和輕鏈可變區(qū)(vl)。在本發(fā)明提供的抗體或其抗原結(jié)合片段中，優(yōu)選地，所述重鏈可變區(qū)包含選自以下的序列：示于seq?id?no:1或seq?id?no:3的氨基酸序列或與所述氨基酸序列具有至少75％同一性的氨基酸序列；和/或，所述輕鏈可變區(qū)包含選自以下的序列：示于seq?id?no:2或seqid?no:4的氨基酸序列或與所述氨基酸序列具有至少75％同一性的氨基酸序列。

12、更優(yōu)選地，本發(fā)明提供的抗體或其抗原結(jié)合片段包含的重鏈可變區(qū)和輕鏈可變區(qū)包含：

13、(1)示于seq?id?no:1的氨基酸序列或與示于seq?id?no:1的氨基酸序列具有至少75％同一性的氨基酸序列；和，示于seq?id?no:2的氨基酸序列或與示于seq?id?no:2的氨基酸序列具有至少75％同一性的氨基酸序列；或

14、(2)示于seq?id?no:3的氨基酸序列或與示于seq?id?no:3的氨基酸序列具有至少75％同一性的氨基酸序列；和，示于seq?id?no:4的氨基酸序列或與示于seq?id?no:4的氨基酸序列具有至少75％同一性的氨基酸序列。

15、在本發(fā)明的上下文中，“至少75％同一性”是指75％至100％之間的任何百分比數(shù)字的同一性，例如75％、80％、85％、90％，甚至91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或甚至100％同一性。

16、特別地，在本發(fā)明的抗體或其抗原結(jié)合片段中，所述重鏈可變區(qū)和輕鏈可變區(qū)均包括上述cdr以及間隔的框架區(qū)(framework?region)，各個(gè)區(qū)域的排列方式為：fr1-cdr1-fr2-cdr2-fr3-cdr3-fr4。進(jìn)一步可選地，所述“至少75％同一性”導(dǎo)致的氨基酸序列上的至多25％差異可存在于重鏈可變區(qū)或輕鏈可變區(qū)中的任意框架區(qū)中，或者存在于本發(fā)明的抗體或其抗原結(jié)合片段中重鏈可變區(qū)和輕鏈可變區(qū)以外的任意結(jié)構(gòu)域或序列中。所述差異可以由任何位置的氨基酸缺失、添加或置換產(chǎn)生。

17、就抗原而言，本發(fā)明的抗體或其抗原結(jié)合片段為抗lilrb2的抗體或其抗原結(jié)合片段。例如，所述抗體可以為鼠抗、兔抗、單克隆抗體、嵌合抗體、部分或全部人源化的抗體等任意形式；所述抗原結(jié)合片段為所述抗體的任何片段，其保留了抗體對(duì)抗原的結(jié)合能力以及相應(yīng)的生物學(xué)活性。所述片段可以為半抗體或者抗體或半抗體的任何抗原結(jié)合片段，例如scfv、bsfv、dsfv、(dsfv)2、fab、fab'、f(ab')2或fv。

18、更優(yōu)選地，本發(fā)明提供的抗體為igg。根據(jù)本發(fā)明的具體實(shí)施方式，本發(fā)明提供特異性地結(jié)合lilrb2(例如人lilrb2)的經(jīng)分離和結(jié)構(gòu)表征的鼠抗或人源化抗體，例如為單克隆抗體。

19、除了可變區(qū)之外，本發(fā)明提供的抗體或其抗原結(jié)合片段還包含恒定區(qū)，例如人或鼠的恒定區(qū)，優(yōu)選包含人或鼠的重鏈恒定區(qū)(ch)和/或輕鏈恒定區(qū)(cl)；優(yōu)選地，所述抗體或其片段包含重鏈和輕鏈；更優(yōu)選地，所述抗體或其片段包含igg、iga、igm、igd或ige的重鏈恒定區(qū)和/或κ或λ型輕鏈恒定區(qū)。

20、根據(jù)本發(fā)明的具體實(shí)施方式，所述抗體為抗lilrb2的單克隆抗體，優(yōu)選為鼠、嵌合或人源化的單克隆抗體。優(yōu)選地，所述單克隆抗體的重鏈恒定區(qū)為igg1或igg4亞型，輕鏈恒定區(qū)為κ型。優(yōu)選地，所述單克隆抗體的重鏈恒定區(qū)包含示于seq?id?no:7的氨基酸序列或者與示于seq?id?no:7的氨基酸序列具有至少75％同一性的氨基酸序列；所述單克隆抗體的輕鏈恒定區(qū)包含示于seq?id?no:8的氨基酸序列或者與示于seq?id?no:8的氨基酸序列具有至少75％同一性的氨基酸序列。

21、根據(jù)本發(fā)明的具體實(shí)施方式，本發(fā)明的抗人lilrb2抗體為單克隆抗體。優(yōu)選地，本發(fā)明提供的抗人lilrb2抗體為免疫球蛋白，例如，所述免疫球蛋白的類型為人iga、igd、ige、igg或igm。進(jìn)一步優(yōu)選地，所述抗體為人igg1或igg4亞型。

22、另一方面，本發(fā)明還提供一種核酸分子，其包含編碼本發(fā)明提供的抗體或其抗原結(jié)合片段中包含的重鏈cdr、輕鏈cdr、輕鏈可變區(qū)、重鏈可變區(qū)、重鏈或輕鏈的核苷酸序列。

23、本發(fā)明的核酸分子可以被克隆到載體中，進(jìn)而轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染宿主細(xì)胞。因此又一方面，本發(fā)明還提供一種載體，所述載體包含本發(fā)明的核酸分子。所述載體可以為真核表達(dá)載體、原核表達(dá)載體、人工染色體及噬菌體載體等。本發(fā)明的載體或核酸分子可以用于轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染宿主細(xì)胞。因此，還一方面，本發(fā)明提供一種宿主細(xì)胞，所述宿主細(xì)胞包含本發(fā)明的核酸分子和/或載體，或者所述宿主細(xì)胞被本發(fā)明的核酸分子和/或載體轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染。宿主細(xì)胞可以是任何原核或真核細(xì)胞，例如細(xì)菌或昆蟲(chóng)、真菌、植物或動(dòng)物細(xì)胞。

24、本發(fā)明提供的抗體或其抗原結(jié)合片段可以利用本領(lǐng)域已知的任何方法獲得。例如，在允許本發(fā)明提供的宿主細(xì)胞表達(dá)所述抗體的重鏈和輕鏈的情況下，培養(yǎng)所述宿主細(xì)胞。任選地，所述方法還包括回收產(chǎn)生的抗體的步驟。

25、本發(fā)明提供的抗體或其抗原結(jié)合片段、核酸分子、載體、宿主細(xì)胞和/或可以被包含在組合物中，更特別地被包含在藥物組合物例如藥物制劑中，從而根據(jù)實(shí)際需要用于各種目的。因此，在又一方面，本發(fā)明還提供一種組合物，例如藥物組合物，所述組合物包含本發(fā)明所述的抗體或其片段、核酸分子、載體和/或宿主細(xì)胞，以及任選的藥學(xué)上可接受的輔料。

26、再一方面，本發(fā)明還提供所述抗體或其抗原結(jié)合片段、核酸分子、載體、宿主細(xì)胞和/或組合物在制備用于治療疾病的藥物中的用途，所述疾病為與lilrb2高表達(dá)相關(guān)的腫瘤。優(yōu)選地，所述疾病為選自食管鱗狀細(xì)胞癌、小細(xì)胞肺癌、腎細(xì)胞癌、結(jié)直腸癌、卵巢癌和非小細(xì)胞肺癌中的一種或多種。進(jìn)一步優(yōu)選地，所述疾病為非小細(xì)胞肺癌。

27、因此相應(yīng)地，本發(fā)明還提供一種治療疾病的方法，所述方法包括給有此需要的受試者施用本發(fā)明的抗體或其抗原結(jié)合片段、核酸分子、載體、宿主細(xì)胞和/或組合物，所述疾病為與lilrb2高表達(dá)相關(guān)的腫瘤。優(yōu)選地，所述疾病為選自食管鱗狀細(xì)胞癌、小細(xì)胞肺癌、腎細(xì)胞癌、結(jié)直腸癌、卵巢癌和非小細(xì)胞肺癌中的一種或多種。進(jìn)一步優(yōu)選地，所述疾病為非小細(xì)胞肺癌。所述受試者為哺乳類動(dòng)物；優(yōu)選地，所述受試者為人。

28、還一方面，本發(fā)明還提供所述抗體或其抗原結(jié)合片段、核酸分子、載體、宿主細(xì)胞和/或組合物在制備用于診斷疾病的試劑中的用途，所述疾病為與lilrb2高表達(dá)相關(guān)的腫瘤。優(yōu)選地，所述疾病為選自食管鱗狀細(xì)胞癌、小細(xì)胞肺癌、腎細(xì)胞癌、結(jié)直腸癌、卵巢癌和非小細(xì)胞肺癌中的一種或多種。進(jìn)一步優(yōu)選地，所述疾病為非小細(xì)胞肺癌。所述診斷通過(guò)檢測(cè)來(lái)自受試者的生物學(xué)樣品中抗原lilrb2的存在(例如高表達(dá))來(lái)實(shí)現(xiàn)。所述受試者為哺乳類動(dòng)物；優(yōu)選地，所述受試者為人。

29、又一方面，本發(fā)明提供一種試劑盒，所述試劑盒包含本發(fā)明的抗體或其片段、核酸分子、載體、宿主細(xì)胞和/或組合物。所述試劑盒可以用于上述治療或診斷。取決于預(yù)期的應(yīng)用方式，所述試劑盒還包含用于治療或診斷的其他試劑。例如，所述試劑盒為用于采用elisa或facs來(lái)檢測(cè)任何生物學(xué)樣本中l(wèi)ilrb2存在(例如高表達(dá))的試劑盒。

30、本發(fā)明提供了一種能夠結(jié)合白細(xì)胞免疫球蛋白樣受體亞家族b成員2(lilrb2)的抗體或其抗原結(jié)合片段。實(shí)驗(yàn)證明，本發(fā)明提供的抗lilrb2抗體，可以以高親和力結(jié)合人lilrb2，由此阻斷l(xiāng)ilrb2與其配體hla-g的結(jié)合，阻斷l(xiāng)ilrb2下游信號(hào)，增強(qiáng)t細(xì)胞功能；特別是與已知抗lilrb2抗體mk-4830相比，本發(fā)明提供的抗lilrb2抗體具有更強(qiáng)的t細(xì)胞增強(qiáng)效果。此外，腫瘤移植動(dòng)物實(shí)驗(yàn)證明，本發(fā)明提供的抗lilrb2抗體能夠顯著抑制動(dòng)物體內(nèi)腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)，并且能夠與抗pd1抗體發(fā)揮協(xié)同抑瘤作用。