本發(fā)明屬于生物，具體涉及琥珀酰輔酶a乙酸輔酶a轉(zhuǎn)移酶活性增強(qiáng)在生產(chǎn)谷氨酸中的應(yīng)用。

背景技術(shù)：

1、l-谷氨酸，化學(xué)名稱為α-氨基戊二酸，是生物機(jī)體內(nèi)氮代謝的基本氨基酸之一，在生物體內(nèi)的蛋白質(zhì)代謝過程中占重要地位，主要用于生產(chǎn)味精、香料、以及用作代鹽劑、營養(yǎng)增補(bǔ)劑和生化試劑等，在醫(yī)藥、化工、畜牧等領(lǐng)域應(yīng)用廣泛，因此，l-谷氨酸也是世界上產(chǎn)量最大的氨基酸。

2、當(dāng)前，l-谷氨酸的工業(yè)化大規(guī)模生產(chǎn)主要使用微生物發(fā)酵法生產(chǎn)，其中，最主要的微生物為谷氨酸棒桿菌。在谷氨酸棒桿菌中，tca循環(huán)的中間產(chǎn)物α-酮戊二酸在谷氨酸脫氫酶的催化下合成l-谷氨酸。作為起始tca循環(huán)的乙酰輔酶a的積累對(duì)于l-谷氨酸的合成至關(guān)重要。琥珀酰輔酶a乙酸輔酶a轉(zhuǎn)移酶(succinyl-coa:acetate?coa-transferase，scact，acta基因編碼)可以催化琥珀酰輔酶a和乙酸合成乙酰輔酶a(biochemistry,51(42),8422-8434.)，對(duì)谷氨酸合成中減少副產(chǎn)物積累以及碳原子回收利用可能有效。目前，尚未有該酶的改造提升l-谷氨酸生產(chǎn)能力的報(bào)道。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路

1、本發(fā)明通過對(duì)野生型acta的過表達(dá)，發(fā)現(xiàn)其過表達(dá)可以提高谷氨酸棒桿菌l-谷氨酸的產(chǎn)量。同時(shí)，經(jīng)過酶的結(jié)構(gòu)模擬，發(fā)現(xiàn)acta的第372位氨基酸殘基位于c端輔酶a的結(jié)合區(qū)，推測該位點(diǎn)可能對(duì)結(jié)構(gòu)和功能具有重要的作用，進(jìn)而對(duì)372位氨基酸殘基進(jìn)行了飽和突變，獲得了一系列活性增強(qiáng)的突變體，這些突變體以及突變體的過表達(dá)可以提高菌株的谷氨酸產(chǎn)量，進(jìn)而可以提升谷氨酸的生產(chǎn)效率，降低生產(chǎn)成本。在此基礎(chǔ)上，完成本發(fā)明。

2、第一方面，本發(fā)明提供了一種提高的l-谷氨酸生產(chǎn)能力的菌株，所述菌株中琥珀酰輔酶a乙酸輔酶a轉(zhuǎn)移酶活性增強(qiáng)。優(yōu)選地，所述琥珀酰輔酶a乙酸輔酶a轉(zhuǎn)移酶活性增強(qiáng)是氨基酸序列如seq?id?no：1所示的多肽的表達(dá)增強(qiáng)，或者含有氨基酸序列如seq?id?no：1所示的多肽的突變體，所述突變體是seq?id?no：1所示的多肽的372位絲氨酸被半胱氨酸、丙氨酸、天冬酰胺、天冬氨酸、谷氨酰胺、谷氨酸、甘氨酸、異亮氨酸、賴氨酸、蛋氨酸、苯丙氨酸、蘇氨酸、色氨酸、纈氨酸、酪氨酸、亮氨酸、脯氨酸中的任一個(gè)取代。

3、更具體地，所述菌株是細(xì)菌，優(yōu)選腸桿菌或棒桿菌，更優(yōu)選谷氨酸棒桿菌，更具體如谷氨酸棒桿菌atcc?13869、谷氨酸棒桿菌atcc?13032、谷氨酸棒桿菌b253、谷氨酸棒桿菌atcc?14067，以及由上述菌株制備的產(chǎn)生l-谷氨酸的突變體或菌株。

4、進(jìn)一步優(yōu)選地，所述菌株是在谷氨酸棒桿菌atcc?13032、谷氨酸棒桿菌atcc13869基礎(chǔ)上改造獲得的菌株，這些改造包括但不限于選自以下的一個(gè)或多個(gè)基因被增強(qiáng)或過表達(dá)：

5、a.編碼機(jī)械敏感通道蛋白的yggb基因；

6、b.編碼磷酸轉(zhuǎn)酮酶的fxpk基因；

7、c.編碼丙酮酸羧化酶的pyc基因；

8、d.編碼谷氨酸脫氫酶的gdh基因；

9、e.編碼碳酸酐酶的基因。

10、還優(yōu)選地，所述l-谷氨酸生產(chǎn)菌株中還可以包括但不限于選自以下的一個(gè)或多個(gè)基因被弱化或表達(dá)降低：

11、d.編碼α-酮戊二酸脫氫酶的odha基因；

12、e.編碼轉(zhuǎn)錄調(diào)控基因的amtr基因；

13、f.編碼轉(zhuǎn)錄抑制子的acnr基因。

14、特別優(yōu)選地，所述谷氨酸棒桿菌進(jìn)一步地經(jīng)過改良，其中的ncgl1221同源基因中引入a111v突變，glta編碼基因中引入c361y突變。

15、所述菌株具體通過轉(zhuǎn)化來實(shí)現(xiàn)。此處“轉(zhuǎn)化”具有本領(lǐng)域技術(shù)人員普遍理解的意思，即將外源性的dna導(dǎo)入宿主的過程。所述轉(zhuǎn)化的方法包括任何將核酸導(dǎo)入細(xì)胞的方法，這些方法包括但不限于電穿孔法、磷酸鈣(capo4)沉淀法、氯化鈣(cacl2)沉淀法、微注射法、聚乙二醇(peg)法、deae-葡聚糖法、陽離子脂質(zhì)體法以及乙酸鋰-dmso法。

16、本發(fā)明所述“菌株”是具有本領(lǐng)域普通技術(shù)人員通常理解的含義，即，能夠?qū)氡景l(fā)明的具有啟動(dòng)子活性的核酸的細(xì)胞，導(dǎo)入之后稱為重組菌株。換言之，本發(fā)明可以利用任何菌株，只要其菌株中的生物素蛋白連接酶活性增強(qiáng)。本發(fā)明的菌株可以是細(xì)菌，優(yōu)選腸桿菌或棒桿菌，更優(yōu)選谷氨酸棒桿菌，包括但不限于谷氨酸棒桿菌atcc?13869、谷氨酸棒桿菌atcc?13032、谷氨酸棒桿菌b253、谷氨酸棒桿菌atcc?14067，以及由上述菌株制備的產(chǎn)生l-谷氨酸的突變體或菌株。

17、在本發(fā)明中，所述菌株的培養(yǎng)可以根據(jù)本領(lǐng)域的常規(guī)方法進(jìn)行，包括但不限于孔板培養(yǎng)、搖瓶培養(yǎng)、批次培養(yǎng)、連續(xù)培養(yǎng)和分批補(bǔ)料培養(yǎng)等，并可以根據(jù)實(shí)際情況適當(dāng)?shù)卣{(diào)整各種培養(yǎng)條件如溫度、時(shí)間和培養(yǎng)基的ph值等。其中，本文所述的“琥珀酰輔酶a乙酸輔酶a轉(zhuǎn)移酶”及其縮寫名稱“acta”是指能可以催化琥珀酰輔酶a和乙酸合成乙酰輔酶a的酶。如本文所使用，琥珀酰輔酶a乙酸輔酶a轉(zhuǎn)移酶不被具體限制，只要其具有相應(yīng)的活性，并且其可以是衍生自棒狀桿菌屬——具體地，谷氨酸棒狀桿菌——的微生物的琥珀酰輔酶a乙酸輔酶a轉(zhuǎn)移酶，但是不限于此。例如，琥珀酰輔酶a乙酸輔酶a轉(zhuǎn)移酶可以是seq?id?no:1的氨基酸序列或者與seq?id?no:1的氨基酸序列具有至少75％，具體地至少80％，更具體地85％，并且甚至更具體地90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、或者99％或更高的同源性的氨基酸序列。

18、第二方面，本發(fā)明提供琥珀酰輔酶a乙酸輔酶a轉(zhuǎn)移酶突變體，所述突變體為氨基酸序列如seq?id?no：1所示，且372位的絲氨酸被其他氨基酸取代。

19、優(yōu)選地，所述其他氨基酸為半胱氨酸、丙氨酸、天冬酰胺、天冬氨酸、谷氨酰胺、谷氨酸、甘氨酸、異亮氨酸、賴氨酸、蛋氨酸、苯丙氨酸、蘇氨酸、色氨酸、纈氨酸、酪氨酸、亮氨酸、脯氨酸。

20、所述“野生型的”指在自然界中可以找到的對(duì)象。例如，一種存在于生物體中，可以從自然界的一個(gè)來源中分離出來并且在實(shí)驗(yàn)室中沒有被人類有意修改的多肽或多核苷酸序列是天然存在的。如本公開所用的，“天然存在的”和“野生型的”是同義詞。在一些實(shí)施方式中，本公開中野生型的琥珀酰輔酶a乙酸輔酶a轉(zhuǎn)移酶是指野生型acta蛋白，也即如seqid?no：1所示氨基酸序列的多肽。

21、在一些實(shí)施方式中，所述的“突變”包含在seq?id?no：1所示序列的第372位絲氨酸被其他氨基酸取代，與seq?id?no：1所示序列的琥珀酰輔酶a乙酸輔酶a轉(zhuǎn)移酶相比，突變體能夠提高谷氨酸的產(chǎn)量。

22、第三方面，本發(fā)明提供了編碼所述琥珀酰輔酶a乙酸輔酶a轉(zhuǎn)移酶突變體的編碼多核苷酸。

23、所述“多核苷酸”指由核苷酸組成的聚合物。多核苷酸可以是單獨(dú)片段的形式，也可以是更大的核苷酸序列結(jié)構(gòu)的一個(gè)組成部分，其是從至少在數(shù)量或濃度上分離一次的核苷酸序列衍生而來的，能夠通過標(biāo)準(zhǔn)分子生物學(xué)方法(例如，使用克隆載體)識(shí)別、操縱以及恢復(fù)序列及其組分核苷酸序列。當(dāng)一個(gè)核苷酸序列通過一個(gè)dna序列(即a、t、g、c)表示時(shí)，這也包括一個(gè)rna序列(即a、u、g、c)，其中“u”取代“t”。換句話說，“多核苷酸”指從其他核苷酸(單獨(dú)的片段或整個(gè)片段)中去除的核苷酸聚合物，或者可以是一個(gè)較大核苷酸結(jié)構(gòu)的組成部分或成分，如表達(dá)載體或多順反子序列。多核苷酸包括dna、rna和cdna序列。

24、具體地，本發(fā)明的琥珀酰輔酶a乙酸輔酶a轉(zhuǎn)移酶突變體的編碼多核苷酸包括seqidno:2所示的多核苷酸，且在其1114-1116位突變的多核苷酸。此外，本發(fā)明的多核苷酸還包括與seq?id?no:2所示多核苷酸具有75％或更高，具體地80％或更高，更具體地85％或更高，并且甚至更具體地90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、和99％或更高的同源性的任何多核苷酸。

25、本發(fā)明的術(shù)語“同源性”指的是兩個(gè)多核苷酸或多肽部分之間的同一性的百分比。一個(gè)部分與另一個(gè)部分的序列之間的同源性可以通過本領(lǐng)域中已知的技術(shù)測定。例如，同源性可以通過使用容易可獲得的計(jì)算機(jī)程序直接排列兩個(gè)多核苷酸分子或兩個(gè)多肽分子的序列信息來測定。計(jì)算機(jī)程序的實(shí)例可以包括blast(ncbi)、clc?main?workbench(clcbio)、megaligntm(dnastar?inc.)等。另外，多核苷酸之間的同源性可以通過如下步驟來測定：在同源區(qū)之間形成穩(wěn)定雙鏈的條件下雜交多核苷酸，利用單鏈特異性核酸酶分解，然后對(duì)分解的片段進(jìn)行大小測定。

26、第四方面，本發(fā)明提供了含有所述琥珀酰輔酶a乙酸輔酶a轉(zhuǎn)移酶突變體的編碼核苷酸的載體，尤其是重組表達(dá)載體。

27、本發(fā)明的術(shù)語“表達(dá)”包括涉及rna產(chǎn)生及蛋白產(chǎn)生的任何步驟，包括但不限于：轉(zhuǎn)錄、轉(zhuǎn)錄后修飾、翻譯、翻譯后修飾和分泌。

28、本發(fā)明的術(shù)語“載體”指的是dna構(gòu)建體，其含有與合適的控制序列可操作地連接的dna序列，從而在合適的宿主中表達(dá)目標(biāo)基因?！爸亟M表達(dá)載體”指用于表達(dá)例如編碼所需多肽的多核苷酸的dna結(jié)構(gòu)。重組表達(dá)載體可包括，例如包含i)對(duì)基因表達(dá)具有調(diào)控作用的遺傳元素的集合，例如啟動(dòng)子和增強(qiáng)子；ii)轉(zhuǎn)錄成mrna并翻譯成蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)或編碼序列；以及iii)適當(dāng)?shù)霓D(zhuǎn)錄和翻譯起始和終止序列的轉(zhuǎn)錄亞單位。重組表達(dá)載體以任何合適的方式構(gòu)建。載體的性質(zhì)并不重要，并可以使用任何載體，包括質(zhì)粒、病毒、噬菌體和轉(zhuǎn)座子。用于本公開的可能載體包括但不限于染色體、非染色體和合成dna序列，例如細(xì)菌質(zhì)粒、噬菌體dna、酵母質(zhì)粒以及從質(zhì)粒和噬菌體dna的組合中衍生的載體，來自如牛痘、腺病毒、雞痘、桿狀病毒、sv40和偽狂犬病等病毒的dna。

29、第五方面，本發(fā)明提供所述琥珀酰輔酶a乙酸輔酶a轉(zhuǎn)移酶表達(dá)增強(qiáng)或琥珀酰輔酶a乙酸輔酶a轉(zhuǎn)移酶372位突變體在生產(chǎn)l-谷氨酸中的應(yīng)用。

30、第六方面，本發(fā)明提供了一種生產(chǎn)l-谷氨酸的方法，所述方法包括培養(yǎng)第四方面的菌株使之生產(chǎn)l-谷氨酸，進(jìn)一步包括從培養(yǎng)基中分離提取或回收l-谷氨酸的步驟。

31、本發(fā)明的有益效果：本發(fā)明提供的琥珀酰輔酶a乙酸輔酶a轉(zhuǎn)移酶活性增強(qiáng)或者琥珀酰輔酶a乙酸輔酶a轉(zhuǎn)移酶372位突變體，可以提高菌l-谷氨酸的產(chǎn)量和轉(zhuǎn)化率，可降低l-谷氨酸的生產(chǎn)成本，為大規(guī)模生產(chǎn)提供了新的選擇策略。