本發(fā)明涉及中藥鑒別，尤其涉及一種鑒別川貝母的試劑盒及其應(yīng)用。

背景技術(shù)：

1、川貝母為百合科植物川貝母fritillaria?cirrhosa?d.don、暗紫貝母fritillaria?unibracteata?hsiao?et?k.c.hsia、甘肅貝母fritillaria?przewalskiimaxim.、梭砂貝母fritillaria?delavayi?franch.、太白貝母fritillaria?taipaiensisp.y.li或瓦布貝母fritillaria?unibracteata?hsiao?et?k.c.hsia?var.waubonsie(sy.tang?et?s?c.yue)z.d.liu,s.wanget?s.c.chen的干燥鱗莖。其具有清熱潤肺，化痰止咳等主要功效。然而，川貝母的年產(chǎn)量較低，價格昂貴，導(dǎo)致市場中不乏以其他低價的近緣品種(如平貝母、伊貝母和浙貝母)充當(dāng)川貝母以及多物種基原混合摻偽的問題。在含川貝母的中成藥中，也存在摻偽問題。

2、性狀鑒定、顯微鑒定和理化鑒定等傳統(tǒng)鑒定方法主要以中藥的外觀形態(tài)、顯微特征或化學(xué)成分作為鑒定依據(jù)，易受到生長環(huán)境、采收時間、人類活動及加工炮制等諸多因素的影響。為保證川貝母藥材及其中成藥的質(zhì)量控制以及用藥的安全性，亟需更快捷、準確、高效且穩(wěn)定的方法對其進行鑒定。

3、pcr-rflp(pcr-restriction?fragment?length?polymorphisms)采用pcr技術(shù)擴增目標dna片段，然后利用限制性內(nèi)切酶識別特異性dna位點進行切割，最后使用凝膠電泳技術(shù)對酶切產(chǎn)物進行分析，通過比對酶切片段長度多態(tài)性，實現(xiàn)對不同來源基因序列的差異性分析。藥典收載的pcr-rflp技術(shù)只能根據(jù)單一酶切位點的變異將樣品區(qū)分為非酶切組(包括平貝母、浙貝母及伊犁貝母)與酶切組(包括濃蜜貝母、中華貝母、康定貝母、長腺貝母與川貝母)，無法進一步區(qū)分。并且在現(xiàn)實情況下，樣本中雜質(zhì)(如中成藥中的輔料)干擾酶促反應(yīng)，會導(dǎo)致酶切反應(yīng)徹底進行后仍有dna無法被剪切而通過電泳檢出，即出現(xiàn)誤判為摻偽的假陰性。當(dāng)樣本dna降解嚴重時，用pcr-rflp方法檢測川貝母也會遇到困難。

技術(shù)實現(xiàn)思路

1、針對以上技術(shù)問題，本發(fā)明提供了一種鑒別川貝母的試劑盒及其應(yīng)用。本發(fā)明提供的試劑盒具有高度的專屬性，能夠快速、準確鑒別川貝母及其偽品。

2、為達到上述發(fā)明目的，本發(fā)明采用了如下的技術(shù)方案：

3、第一方面，本發(fā)明提供一種鑒別川貝母的試劑盒，包括由seq?id?no.1所示的上游引物和seq?id?no.2所示的下游引物組成的引物對，由seq?id?no.3所示的上游引物和seqid?no.4所示的下游引物組成的引物對以及由seq?id?no.5所示的上游引物和seq?id?no.6所示的下游引物組成的引物對中的至少一個引物對。

4、seq?id?no.1的序列為：5′-attcgaatgtatcaac-3′；

5、seq?id?no.2的序列為：5′-gagataatttgtcctc-3′；

6、seq?id?no.3的序列為：5′-gctggtgctccgtccac-3′；

7、seq?id?no.4的序列為：5′-ttgcgagaygrcacgccct-3′。

8、seq?id?no.5的序列為：5′-cggatgacaccgtgtc-3′；

9、seq?id?no.6的序列為：5′-gtcatatgttccttgg-3′。

10、通過對川貝母、平貝母、伊貝母和浙貝母的標準物質(zhì)粉末擴增測序驗證，上述引物對的擴增區(qū)域變異位點較為穩(wěn)定，可以有效地將川貝母與其他常見貝母區(qū)分開。

11、以上由seq?id?no.1所示的上游引物和seq?id?no.2所示的下游引物組成的引物對是基于對貝母葉綠體matk基因組的研究經(jīng)人工設(shè)計得到的。通過對川貝母、平貝母、伊貝母和浙貝母的標準物質(zhì)粉末擴增測序驗證，上述引物對不僅能夠?qū)⒋ㄘ惸概c其他常見貝母區(qū)分開，還能從混偽品中同時鑒定出川貝母與平貝母、浙貝母和伊貝母，即使是在物種占比差異極大的情況下也具有適用性，定量能力表現(xiàn)良好，不僅能夠用于川貝母藥材及其偽品、混偽品的鑒別，還能用于中成藥中川貝母及其偽品的鑒別。

12、以上由seq?id?no.3所示的上游引物和seq?id?no.4所示的下游引物組成的引物對是基于對貝母屬物種的its2區(qū)域dna序列經(jīng)人工設(shè)計得到的，可通過dna宏條形碼技術(shù)區(qū)分川貝母藥材及其偽品區(qū)分開，并能區(qū)分出中成藥中的川貝母及其偽品。

13、上述由seq?id?no.1所示的上游引物和seq?id?no.2所示的下游引物組成的引物對和由seq?id?no.3所示的上游引物和seq?id?no.4所示的下游引物組成的引物對與全長its2的物種分辨率相當(dāng)，與傳統(tǒng)條形碼相比對川貝母擴增效率更高。

14、以上由seq?id?no.5所示的上游引物和seq?id?no.6所示的下游引物組成的引物對是基于對貝母屬物種的its區(qū)域dna序列經(jīng)人工設(shè)計得到的，既可以通過pcr-rflp法區(qū)分川貝母及其偽品，也可以通過dna宏條形碼技術(shù)區(qū)分川貝母藥材及其偽品。相對于藥典中的引物，該引物對的擴增能力較強。利用該引物對進行pcr擴增，并結(jié)合smai酶切和sanger測序技術(shù)，即可準確實現(xiàn)川貝母藥材的鑒定。

15、結(jié)合第一方面，所述試劑盒包括由seq?id?no.1所示的上游引物和seq?id?no.2所示的下游引物組成的引物對。該引物對的分辨能力更強，不僅能判斷出待測物質(zhì)中是否有偽品混入，還能判斷出偽品的具體品種。

16、結(jié)合第一方面，所述試劑盒包括由seq?id?no.3所示的上游引物和seq?id?no.4所示的下游引物組成的引物對。

17、結(jié)合第一方面，所述試劑盒還包括pcr緩沖液、dna聚合酶和模板dna，所述pcr緩沖液中含有鎂離子和脫氧核苷三磷酸(dntp)。

18、結(jié)合第一方面，所述試劑盒包括由seq?id?no.5所示的上游引物和seq?idno.6所示的下游引物組成的引物對。

19、優(yōu)選地，所述試劑盒還包括限制性核酸內(nèi)切酶sma?i。

20、優(yōu)選地，所述試劑盒還包括pcr緩沖液、dna聚合酶、模板dna和限制性核酸內(nèi)切酶sma?i；所述pcr緩沖液中含有鎂離子和脫氧核苷三磷酸。

21、以上pcr緩沖液、dna聚合酶和酶切緩沖液均可選擇用于pcr擴增和酶切的市售試劑，例如，可選用寶日醫(yī)生物技術(shù)有限公司的gflextm?buffer、tks?gflextm?dnapolymerase和10×t?buffer。模板dna為待測樣品的總dna。

22、第二方面，本發(fā)明還提供了上述試劑盒在鑒別川貝母及其偽品中的應(yīng)用。

23、結(jié)合第二方面，所述應(yīng)用的具體步驟包括：

24、s1、提取待測樣品的總dna；

25、s2、以所述總dna為模板dna，用上述引物進行pcr擴增，根據(jù)擴增結(jié)果鑒別川貝母及其偽品。

26、優(yōu)選地，所述pcr擴增的反應(yīng)體系為：

27、

28、對于由seq?id?no.1所示的上游引物和seq?id?no.2所示的下游引物組成的引物對，擴增反應(yīng)條件為：98℃，1min；98℃，10s，48℃，15s，68℃，30s，40個循環(huán)；68℃，5min；

29、對于由seq?id?no.3所示的上游引物和seq?id?no.4所示的下游引物組成的引物對，擴增反應(yīng)條件為：98℃，1min；98℃，10s，62℃，15s，68℃，30s，40個循環(huán)；68℃，5min；

30、對于由seq?id?no.5所示的上游引物和seq?id?no.6所示的下游引物組成的引物對，擴增反應(yīng)條件為：98℃，1min；98℃，10s，45℃，15s，68℃，30s，40個循環(huán)；68℃，5min。

31、在該pcr擴增的反應(yīng)體系中，模板dna的濃度可根據(jù)pcr擴增的效果進行常規(guī)調(diào)整。

32、結(jié)合第二方面，所述應(yīng)用為鑒別中成藥中川貝母及其偽品的應(yīng)用，所述試劑盒中包括由seq?id?no.1所示的上游引物和seq?id?no.2所示的下游引物組成的引物對和由seqid?no.3所示的上游引物和seq?id?no.4所示的下游引物組成的引物對中的至少一個引物對。

33、結(jié)合第二方面，所述應(yīng)用包括鑒別偽品的具體品種，所述試劑盒中包括由seq?idno.1所示的上游引物和seq?id?no.2所示的下游引物組成的引物對。

34、優(yōu)選地，所述應(yīng)用的具體步驟還包括使用限制性核酸內(nèi)切酶sma?i對pcr擴增產(chǎn)物進行酶切，通過酶切結(jié)果進行鑒別：pcr擴增產(chǎn)物能夠被酶切的待測樣品為川貝母，否則為偽品。

35、優(yōu)選地，所述酶切的反應(yīng)體系為：

36、

37、酶切反應(yīng)條件為：30℃水浴兩個小時。