本發(fā)明涉及針對乙肝病毒表面抗原(hbsag)的抗體及其抗原結(jié)合片段，以及制備和使用所述中和抗體及其抗原結(jié)合片段的方法。

背景技術(shù)：

1、乙型肝炎病毒(hepatitis?b?virus，hbv)引起的急性和慢性感染是嚴(yán)重危害人類健康的全球性的公共衛(wèi)生問題。隨著乙肝疫苗的接種，極大的控制了病毒蔓延，但我國仍是世界上乙型肝炎患者最多的國家。目前臨床中用于治療慢乙肝的藥物，包括干擾素和核苷/核苷酸類似物，雖然可以有效抑制hbv復(fù)制，但無法徹底清除病毒從而治愈乙肝病毒慢性感染，同時(shí)還可能出現(xiàn)耐藥性。

2、hbv是一種有包膜的dna病毒，屬嗜肝病毒科。目前有9個(gè)確認(rèn)的hbv基因型a-i和一種未定基因型j型，這些基因型進(jìn)一步細(xì)分為許多具有特定地理分布的亞基因型。hbv感染后，患者的病程自然史因其感染的hbv基因型而存在差異，包括傳播方式、hbeag血清轉(zhuǎn)化的時(shí)間、肝病進(jìn)程的速度和嚴(yán)重程度，例如向肝細(xì)胞癌的進(jìn)展及hbsag清除的可能性。hbsag顆粒有大、中、小三種形式,其中小hbsag由226個(gè)氨基酸編碼，是引起機(jī)體產(chǎn)生保護(hù)性抗體的主要組成部分。hbsag蛋白擁有4個(gè)跨膜區(qū)，其中有一段長約70個(gè)氨基酸(氨基酸99-169)的胞外結(jié)構(gòu)域。這一段胞外結(jié)構(gòu)域暴露于病毒顆粒的表面，對病毒侵染宿主細(xì)胞尤為重要，同時(shí)也是機(jī)體免疫系統(tǒng)(如抗體)識別的重要位點(diǎn)。在這段胞外區(qū)域中，有一個(gè)免疫優(yōu)勢區(qū)稱為“a”抗原決定簇，位于124位-147位氨基酸，跨膜區(qū)2、3之間，是乙肝表面抗體anti-hbs所識別的重要表位。由于hbv慢性感染過程中，經(jīng)過自然選擇、適者生存的時(shí)間和空間壓力，會(huì)出現(xiàn)一系列的突變株，而上述“a”抗原決定簇是hbsag發(fā)生突變頻率較高的區(qū)域。

3、乙肝表面抗原-hbsag可來源于hbv?cccdna和/或整合hbv?dna片段，不僅作為hbv的包膜蛋白參與完整病毒顆粒的行程，還會(huì)和宿主脂質(zhì)組成非感染性亞病毒顆粒，即hbsag顆粒，其游離存在于感染者的血液中形成表面抗原血癥。越來越多的研究顯示，慢乙肝患者體內(nèi)大量存在的hbsag可能是機(jī)體免疫應(yīng)答產(chǎn)生異?；蚝慕叩脑?，并且可能影響肝臟疾病的病理生物學(xué)和癌癥的發(fā)生。因此，降低或清除乙肝表面抗原不僅可預(yù)防乙肝病毒感染，而且可有助于實(shí)現(xiàn)“功能性治愈”，從而降低并發(fā)癥(肝硬化和肝細(xì)胞癌)的發(fā)生率。而利用針對乙肝表面蛋白的單克隆抗體(anti-hbs)來降低或清除人體中的乙肝表面抗原(hbsag)蛋白是一項(xiàng)非常值得探索研發(fā)的“功能性治愈乙肝”的臨床策略。

4、目前防治乙型肝炎最經(jīng)濟(jì)有效的方法是接種乙肝疫苗，乙肝疫苗接種后產(chǎn)生的乙肝表面抗體anti-hbs為針對乙型肝炎的保護(hù)性抗體。自1992年我過施行新生兒接種乙肝疫苗政策以來，人群中乙肝病毒抗原陽性率逐年降低。截至2020年，我國人群乙肝表面抗原陽性率為6％左右，但由于人口基數(shù)大，我國依然有hbv感染人群8600萬，每年新增約100萬。

5、抗體是由b淋巴細(xì)胞所分化為的漿細(xì)胞而分泌的。每個(gè)b淋巴細(xì)胞只能產(chǎn)生專有的、針對一種特異性抗體決定簇的抗體，而從單一細(xì)胞或單一細(xì)胞株得到的抗體就被稱為單克隆抗體。隨著生物技術(shù)的發(fā)展，單克隆抗體篩選技術(shù)也不斷進(jìn)步，已有多項(xiàng)已有多項(xiàng)研究通過不同技術(shù)利用疫苗免疫者外周血b細(xì)胞獲得anti-hbs單克隆抗體，如構(gòu)建噬菌體展示fab文庫技術(shù)、eb病毒介導(dǎo)的b細(xì)胞永生化技術(shù)以及b細(xì)胞激活培養(yǎng)技術(shù)，得到可以與hbsag結(jié)合且具有一定中和活性的單克隆抗體，并且抗原識別表位都在s-hbsag的“a”決定簇。以上研究得到的單克隆抗體都有共同的弊端，就是丟失人源化抗體的天然性。已有的研究數(shù)據(jù)表明，針對乙肝病毒具有較高血清中和效力的志愿者體內(nèi)，能夠產(chǎn)生具有較高體外中和效力、并能有效抑制體內(nèi)乙肝病毒擴(kuò)增的anti-hbs單克隆抗體(1,2)。重組表達(dá)出多個(gè)天然人源化anti-hbs，在體外實(shí)驗(yàn)中，大多數(shù)抗體具有中和效力；值得一提的是，在人肝嵌合小鼠的體內(nèi)感染實(shí)驗(yàn)中，單一抗體治療數(shù)周后，小鼠體內(nèi)的病毒就會(huì)發(fā)生明顯的病毒逃逸現(xiàn)象；而利用識別不同表位、具有互補(bǔ)性的單克隆抗體治療則能更為有效地抑制小鼠的病毒血癥并防止病毒逃逸。由此可見，從乙肝疫苗接種者中分離得到的anti-hbs，在體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ椭芯哂凶钄鄅bv感染和抑制病毒復(fù)制的作用。

6、乙肝病毒雖然為dna病毒，但復(fù)制過程中涉及通過rna逆轉(zhuǎn)錄酶的中間過程，而且dna多聚酶不具備自我糾錯(cuò)的功能，相較其他dna病毒更容易產(chǎn)生基因組核苷酸突變，在此過程中生成hbv突變體。這些發(fā)生突變的新序列大多數(shù)都無法與野生型病毒有效競爭或不可生存，但當(dāng)有選擇壓力是，這些新生序列為突變體的出現(xiàn)提供了一個(gè)起點(diǎn)。提到病毒突變體，我們通常會(huì)提及新冠病毒或流感病毒等rna病毒，它們可以產(chǎn)生龐大而快速的突變，不同的是，hbv的環(huán)狀dna基因組上具有部分重疊的4個(gè)開放閱讀框(orf)，可編碼產(chǎn)生7種蛋白質(zhì)，由于基因重疊限制了病毒的變異性，因此已經(jīng)為4種基因確定了突變體或者變異形式。hbv的突變有一定的傾向性，其中hbsag上的“a”決定簇是突變概率較高的區(qū)域，而人類對hbsag的免疫反應(yīng)也主要針對“a”決定簇的二硫鍵構(gòu)象表位，當(dāng)突變發(fā)生引起相應(yīng)蛋白的氨基酸位點(diǎn)的改變及蛋白空間結(jié)構(gòu)和特性(構(gòu)象表位)的改變，就會(huì)導(dǎo)致抗體無法中和病毒感染，還有可能影響診斷檢測。已有文獻(xiàn)報(bào)道q129r(3)，m133t(4)，d144a，d144e，g145r(5)和g145k(6)等。其中g(shù)145r突變體是文獻(xiàn)中提及的最主要的一種hbsag突變體。該突變體最早是在hbv陽性母親所生小孩在接種疫苗的情況下，仍發(fā)生了突破性感染，盡管孩子對野生型病毒有anti-hbs的保護(hù)性抗體，但這個(gè)g145r突變體的dna和hbsag持續(xù)存在(5,7)。這提示我們，乙肝疫苗產(chǎn)生的抗體對野生型hbv是具有保護(hù)作用的，但對hbv的突變株的保護(hù)作用是有限的。

7、現(xiàn)有的人源乙肝表面抗體產(chǎn)品主要乙肝免疫球蛋白(hbig)，是一種濃縮的預(yù)防乙肝病毒入侵復(fù)制的被動(dòng)免疫制劑，其生產(chǎn)方式是從健康獻(xiàn)血員中篩選血漿中含有較高滴度的anti-hbs，后經(jīng)生物濃縮工藝制成高效價(jià)的乙肝免疫球蛋白。但血源性的hbig也存在一些問題，例如hbig所需的原材料是高滴度anti-hbs的血漿，產(chǎn)品的產(chǎn)量和使用規(guī)模也比較有限，同時(shí)鑒于各個(gè)批次之間血漿供應(yīng)個(gè)體的差異，不同產(chǎn)品批次之間的品質(zhì)和有效性也存在差異，特別是有效性方面來說，濃縮獲得的hbig中可能只有部分抗體具有中和hbv的作用；盡管國家對血液制品管控嚴(yán)格，但對“健康獻(xiàn)血員”檢測的各類指標(biāo)仍很有限，從生物安全角度來講，hbig的安全性較差，臨床上使用的hbig的劑量也被限制200iu；最后，接受hbig注射的患者可能產(chǎn)生過敏反應(yīng)，如igg4過敏，如在肝移植等免疫抑制狀態(tài)下的患者，還可能發(fā)生惡心、風(fēng)疹、關(guān)節(jié)痛等不良癥狀。hbig用于臨床上阻斷hbv傳播說明anti-hbs在阻斷hbv傳染方面具有可行性，但其存在的問題也提示，急需開發(fā)可用于工程化批量生產(chǎn)、高效安全，最好同時(shí)能夠阻斷突變株的anti-hbs。

8、近年來國內(nèi)外不少實(shí)驗(yàn)室采用生物技術(shù)分離乙肝疫苗接種者外周血細(xì)胞、再從b細(xì)胞克隆獲得人源抗體，存在來源單一，不能覆蓋不同基因型或臨床突變體等問題。因此，本領(lǐng)域?qū)τ诰哂懈倪M(jìn)性能的乙肝表面抗體，一直存在需要。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路

1、在本發(fā)明中，發(fā)明人篩選了具有較高血清中和活性的乙肝感染康復(fù)者和乙肝疫苗接種者，并通過分離其體內(nèi)單個(gè)b細(xì)胞，從而獲得了一系列針對hbsag的單克隆抗體。體內(nèi)體外實(shí)驗(yàn)都表明，這些單克隆抗體具有優(yōu)異的抗原結(jié)合能力、體外中和效力、以及能識別各類突變株的廣譜性。此外，通過和乙肝疫苗接種者體內(nèi)的抗體對比，發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，來自于乙肝感染康復(fù)者的抗體具有識別和中和突變株更多樣的特性。在小鼠體內(nèi)實(shí)驗(yàn)也進(jìn)一步證實(shí)了這一系列抗體具有優(yōu)異的體內(nèi)抗病毒效力，由此完成了本發(fā)明。

2、本發(fā)明提供了一種分離的抗體或其抗原結(jié)合片段，所述分離的抗體或其抗原結(jié)合片段特異性地結(jié)合乙肝表面抗原(hbsag)，其特征在于所述分離的抗體或其抗原結(jié)合片段包含重鏈可變區(qū)vh和輕鏈可變區(qū)vl，所述重鏈可變區(qū)vh包含互補(bǔ)決定區(qū)cdrh1、cdrh2和cdrh3，所述輕鏈可變區(qū)vl包含互補(bǔ)決定區(qū)cdrl1、cdrl2和cdrl3，其中cdrh1、cdrh2、cdrh3、cdrl1、cdrl2和cdrl3選自以下氨基酸序列：

3、a)seq?id?no:2的cdrh1、seq?id?no:3的cdrh2、seq?id?no:4的cdrh3、seq?id?no:6的cdrl1、seq?id?no:7的cdrl2和seq?id?no:8的cdrl3；

4、b)seq?id?no:10的cdrh1、seq?id?no:11的cdrh2、seq?id?no:12的cdrh3、seq?idno:14的cdrl1、seq?id?no:15的cdrl2和seq?id?no:16的cdrl3；

5、c)seq?id?no:18的cdrh1、seq?id?no:19的cdrh2、seq?id?no:20的cdrh3、seq?idno:22的cdrl1、seq?id?no:23的cdrl2和seq?id?no:24的cdrl3；

6、d)seq?id?no:26的cdrh1、seq?id?no:27的cdrh2、seq?id?no:28的cdrh3、seq?idno:30的cdrl1、seq?id?no:31的cdrl2和seq?id?no:32的cdrl3；

7、e)seq?id?no:34的cdrh1、seq?id?no:35的cdrh2、seq?id?no:36的cdrh3、seq?idno:38的cdrl1、seq?id?no:39的cdrl2和seq?id?no:40的cdrl3；

8、f)seq?id?no:42的cdrh1、seq?id?no:43的cdrh2、seq?id?no:44的cdrh3、seq?idno:46的cdrl1、seq?id?no:47的cdrl2和seq?id?no:48的cdrl3；

9、g)seq?id?no:50的cdrh1、seq?id?no:51的cdrh2、seq?id?no:52的cdrh3、seq?idno:54的cdrl1、seq?id?no:55的cdrl2和seq?id?no:56的cdrl3；

10、h)seq?id?no:58的cdrh1、seq?id?no:59的cdrh2、seq?id?no:60的cdrh3、seq?idno:62的cdrl1、seq?id?no:63的cdrl2和seq?id?no:64的cdrl3；

11、i)seq?id?no:66的cdrh1、seq?id?no:67的cdrh2、seq?id?no:68的cdrh3、seq?idno:70的cdrl1、seq?id?no:71的cdrl2和seq?id?no:72的cdrl3；

12、j)seq?id?no:74的cdrh1、seq?id?no:75的cdrh2、seq?id?no:76的cdrh3、seq?idno:78的cdrl1、seq?id?no:79的cdrl2和seq?id?no:80的cdrl3；

13、k)seq?id?no:82的cdrh1、seq?id?no:83的cdrh2、seq?id?no:84的cdrh3、seq?idno:86的cdrl1、seq?id?no:87的cdrl2和seq?id?no:88的cdrl3；

14、l)seq?id?no:90的cdrh1、seq?id?no:91的cdrh2、seq?id?no:92的cdrh3、seq?idno:94的cdrl1、seq?id?no:95的cdrl2和seq?id?no:96的cdrl3；

15、m)seq?id?no:98的cdrh1、seq?id?no:99的cdrh2、seq?id?no:100的cdrh3、seq?idno:102的cdrl1、seq?id?no:103的cdrl2和seq?id?no:104的cdrl3；

16、n)seq?id?no:106的cdrh1、seq?id?no:107的cdrh2、seq?id?no:108的cdrh3、seqid?no:110的cdrl1、seq?id?no:111的cdrl2和seq?id?no:112的cdrl3；

17、o)seq?id?no:114的cdrh1、seq?id?no:115的cdrh2、seq?id?no:116的cdrh3、seqid?no:118的cdrl1、seq?id?no:119的cdrl2和seq?id?no:120的cdrl3；

18、p)seq?id?no:122的cdrh1、seq?id?no:123的cdrh2、seq?id?no:124的cdrh3、seqid?no:126的cdrl1、seq?id?no:127的cdrl2和seq?id?no:128的cdrl3；

19、q)seq?id?no:130的cdrh1、seq?id?no:131的cdrh2、seq?id?no:132的cdrh3、seqid?no:134的cdrl1、seq?id?no:135的cdrl2和seq?id?no:136的cdrl3；

20、r)seq?id?no:138的cdrh1、seq?id?no:139的cdrh2、seq?id?no:140的cdrh3、seqid?no:142的cdrl1、seq?id?no:143的cdrl2和seq?id?no:144的cdrl3；

21、s)seq?id?no:146的cdrh1、seq?id?no:147的cdrh2、seq?id?no:148的cdrh3、seqid?no:150的cdrl1、seq?id?no:151的cdrl2和seq?id?no:152的cdrl3；

22、t)seq?id?no:154的cdrh1、seq?id?no:155的cdrh2、seq?id?no:156的cdrh3、seqid?no:158的cdrl1、seq?id?no:159的cdrl2和seq?id?no:160的cdrl3；

23、u)seq?id?no:162的cdrh1、seq?id?no:163的cdrh2、seq?id?no:164的cdrh3、seqid?no:166的cdrl1、seq?id?no:167的cdrl2和seq?id?no:168的cdrl3；

24、v)seq?id?no:170的cdrh1、seq?id?no:171的cdrh2、seq?id?no:172的cdrh3、seqid?no:174的cdrl1、seq?id?no:175的cdrl2和seq?id?no:176的cdrl3；

25、w)seq?id?no:178的cdrh1、seq?id?no:179的cdrh2、seq?id?no:180的cdrh3、seqid?no:182的cdrl1、seq?id?no:183的cdrl2和seq?id?no:184的cdrl3；

26、x)seq?id?no:186的cdrh1、seq?id?no:187的cdrh2、seq?id?no:188的cdrh3、seqid?no:190的cdrl1、seq?id?no:191的cdrl2和seq?id?no:192的cdrl3；

27、y)seq?id?no:194的cdrh1、seq?id?no:195的cdrh2、seq?id?no:196的cdrh3、seqid?no:198的cdrl1、seq?id?no:199的cdrl2和seq?id?no:200的cdrl3；

28、z)seq?id?no:202的cdrh1、seq?id?no:203的cdrh2、seq?id?no:204的cdrh3、seqid?no:206的cdrl1、seq?id?no:207的cdrl2和seq?id?no:208的cdrl3；

29、aa)seq?id?no:210的cdrh1、seq?id?no:211的cdrh2、seq?id?no:212的cdrh3、seqid?no:214的cdrl1、seq?id?no:215的cdrl2和seq?id?no:216的cdrl3；

30、bb)seq?id?no:218的cdrh1、seq?id?no:219的cdrh2、seq?id?no:220的cdrh3、seqid?no:222的cdrl1、seq?id?no:223的cdrl2和seq?id?no:224的cdrl3；

31、cc)seq?id?no:226的cdrh1、seq?id?no:227的cdrh2、seq?id?no:228的cdrh3、seqid?no:230的cdrl1、seq?id?no:231的cdrl2和seq?id?no:232的cdrl3；

32、dd)seq?id?no:234的cdrh1、seq?id?no:235的cdrh2、seq?id?no:236的cdrh3、seqid?no:238的cdrl1、seq?id?no:239的cdrl2和seq?id?no:240的cdrl3；

33、ee)seq?id?no:242的cdrh1、seq?id?no:243的cdrh2、seq?id?no:244的cdrh3、seqid?no:246的cdrl1、seq?id?no:247的cdrl2和seq?id?no:248的cdrl3；

34、ff)seq?id?no:250的cdrh1、seq?id?no:251的cdrh2、seq?id?no:252的cdrh3、seqid?no:254的cdrl1、seq?id?no:255的cdrl2和seq?id?no:256的cdrl3；

35、gg)seq?id?no:258的cdrh1、seq?id?no:259的cdrh2、seq?id?no:260的cdrh3、seqid?no:262的cdrl1、seq?id?no:263的cdrl2和seq?id?no:264的cdrl3；

36、hh)seq?id?no:266的cdrh1、seq?id?no:267的cdrh2、seq?id?no:268的cdrh3、seqid?no:270的cdrl1、seq?id?no:271的cdrl2和seq?id?no:272的cdrl3；

37、ii)seq?id?no:274的cdrh1、seq?id?no:275的cdrh2、seq?id?no:276的cdrh3、seqid?no:278的cdrl1、seq?id?no:279的cdrl2和seq?id?no:280的cdrl3；

38、jj)seq?id?no:282的cdrh1、seq?id?no:283的cdrh2、seq?id?no:284的cdrh3、seqid?no:286的cdrl1、seq?id?no:287的cdrl2和seq?id?no:288的cdrl3；

39、kk)seq?id?no:290的cdrh1、seq?id?no:291的cdrh2、seq?id?no:292的cdrh3、seqid?no:294的cdrl1、seq?id?no:295的cdrl2和seq?id?no:296的cdrl3；

40、ll)seq?id?no:298的cdrh1、seq?id?no:299的cdrh2、seq?id?no:300的cdrh3、seqid?no:302的cdrl1、seq?id?no:303的cdrl2和seq?id?no:304的cdrl3；

41、mm)seq?id?no:306的cdrh1、seq?id?no:307的cdrh2、seq?id?no:308的cdrh3、seqid?no:310的cdrl1、seq?id?no:311的cdrl2和seq?id?no:312的cdrl3；

42、nn)seq?id?no:314的cdrh1、seq?id?no:315的cdrh2、seq?id?no:316的cdrh3、seqid?no:318的cdrl1、seq?id?no:319的cdrl2和seq?id?no:320的cdrl3；

43、oo)seq?id?no:322的cdrh1、seq?id?no:323的cdrh2、seq?id?no:324的cdrh3、seqid?no:326的cdrl1、seq?id?no:327的cdrl2和seq?id?no:328的cdrl3；

44、pp)seq?id?no:330的cdrh1、seq?id?no:331的cdrh2、seq?id?no:332的cdrh3、seqid?no:334的cdrl1、seq?id?no:335的cdrl2和seq?id?no:336的cdrl3；

45、qq)seq?id?no:338的cdrh1、seq?id?no:339的cdrh2、seq?id?no:340的cdrh3、seqid?no:342的cdrl1、seq?id?no:343的cdrl2和seq?id?no:344的cdrl3；

46、rr)seq?id?no:346的cdrh1、seq?id?no:347的cdrh2、seq?id?no:348的cdrh3、seqid?no:350的cdrl1、seq?id?no:351的cdrl2和seq?id?no:352的cdrl3；

47、ss)seq?id?no:354的cdrh1、seq?id?no:355的cdrh2、seq?id?no:356的cdrh3、seqid?no:358的cdrl1、seq?id?no:359的cdrl2和seq?id?no:360的cdrl3；

48、tt)seq?id?no:362的cdrh1、seq?id?no:363的cdrh2、seq?id?no:364的cdrh3、seqid?no:366的cdrl1、seq?id?no:367的cdrl2和seq?id?no:368的cdrl3；

49、uu)seq?id?no:370的cdrh1、seq?id?no:371的cdrh2、seq?id?no:372的cdrh3、seqid?no:374的cdrl1、seq?id?no:375的cdrl2和seq?id?no:376的cdrl3；

50、vv)seq?id?no:378的cdrh1、seq?id?no:379的cdrh2、seq?id?no:380的cdrh3、seqid?no:382的cdrl1、seq?id?no:383的cdrl2和seq?id?no:384的cdrl3；

51、ww)seq?id?no:386的cdrh1、seq?id?no:387的cdrh2、seq?id?no:388的cdrh3、seqid?no:390的cdrl1、seq?id?no:391的cdrl2和seq?id?no:392的cdrl3；

52、xx)seq?id?no:394的cdrh1、seq?id?no:395的cdrh2、seq?id?no:396的cdrh3、seqid?no:398的cdrl1、seq?id?no:399的cdrl2和seq?id?no:400的cdrl3；

53、yy)seq?id?no:402的cdrh1、seq?id?no:403的cdrh2、seq?id?no:404的cdrh3、seqid?no:406的cdrl1、seq?id?no:407的cdrl2和seq?id?no:408的cdrl3；

54、zz)seq?id?no:410的cdrh1、seq?id?no:411的cdrh2、seq?id?no:412的cdrh3、seqid?no:414的cdrl1、seq?id?no:415的cdrl2和seq?id?no:416的cdrl3；

55、aaa)seq?id?no:418的cdrh1、seq?id?no:419的cdrh2、seq?id?no:420的cdrh3、seq?id?no:422的cdrl1、seq?id?no:423的cdrl2和seq?id?no:424的cdrl3；

56、bbb)seq?id?no:426的cdrh1、seq?id?no:427的cdrh2、seq?id?no:428的cdrh3、seq?id?no:430的cdrl1、seq?id?no:431的cdrl2和seq?id?no:432的cdrl3；

57、ccc)seq?id?no:434的cdrh1、seq?id?no:435的cdrh2、seq?id?no:436的cdrh3、seq?id?no:438的cdrl1、seq?id?no:439的cdrl2和seq?id?no:440的cdrl3；

58、ddd)seq?id?no:442的cdrh1、seq?id?no:443的cdrh2、seq?id?no:444的cdrh3、seq?id?no:446的cdrl1、seq?id?no:447的cdrl2和seq?id?no:448的cdrl3；

59、eee)seq?id?no:450的cdrh1、seq?id?no:451的cdrh2、seq?id?no:452的cdrh3、seq?id?no:454的cdrl1、seq?id?no:455的cdrl2和seq?id?no:456的cdrl3；

60、fff)seq?id?no:458的cdrh1、seq?id?no:459的cdrh2、seq?id?no:460的cdrh3、seq?id?no:462的cdrl1、seq?id?no:463的cdrl2和seq?id?no:464的cdrl3；

61、ggg)seq?id?no:466的cdrh1、seq?id?no:467的cdrh2、seq?id?no:468的cdrh3、seq?id?no:470的cdrl1、seq?id?no:471的cdrl2和seq?id?no:472的cdrl3；

62、hhh)seq?id?no:474的cdrh1、seq?id?no:475的cdrh2、seq?id?no:476的cdrh3、seq?id?no:478的cdrl1、seq?id?no:479的cdrl2和seq?id?no:480的cdrl3；

63、iii)seq?id?no:482的cdrh1、seq?id?no:483的cdrh2、seq?id?no:484的cdrh3、seq?id?no:486的cdrl1、seq?id?no:487的cdrl2和seq?id?no:488的cdrl3；和

64、jjj)seq?id?no:490的cdrh1、seq?id?no:491的cdrh2、seq?id?no:492的cdrh3、seq?id?no:494的cdrl1、seq?id?no:495的cdrl2和seq?id?no:496的cdrl3。

65、在一個(gè)實(shí)施方案中，所述重鏈可變區(qū)vh和輕鏈可變區(qū)vl選自以下氨基酸序列：

66、a)seq?id?no:1的vh和seq?id?no:5的vl；

67、b)seq?id?no:9的vh和seq?id?no:13的vl；

68、c)seq?id?no:17的vh和seq?id?no:21的vl；

69、d)seq?id?no:25的vh和seq?id?no:29的vl；

70、e)seq?id?no:33的vh和seq?id?no:37的vl；

71、f)seq?id?no:41的vh和seq?id?no:45的vl；

72、g)seq?id?no:49的vh和seq?id?no:53的vl；

73、h)seq?id?no:57的vh和seq?id?no:61的vl；

74、i)seq?id?no:65的vh和seq?id?no:69的vl；

75、j)seq?id?no:73的vh和seq?id?no:77的vl；

76、k)seq?id?no:81的vh和seq?id?no:85的vl；

77、l)seq?id?no:89的vh和seq?id?no:93的vl；

78、m)seq?id?no:97的vh和seq?id?no:101的vl；

79、n)seq?id?no:105的vh和seq?id?no:109的vl；

80、o)seq?id?no:113的vh和seq?id?no:117的vl；

81、p)seq?id?no:121的vh和seq?id?no:125的vl；

82、q)seq?id?no:129的vh和seq?id?no:133的vl；

83、r)seq?id?no:137的vh和seq?id?no:141的vl；

84、s)seq?id?no:145的vh和seq?id?no:149的vl；

85、t)seq?id?no:153的vh和seq?id?no:157的vl；

86、u)seq?id?no:161的vh和seq?id?no:165的vl；

87、v)seq?id?no:169的vh和seq?id?no:173的vl；

88、w)seq?id?no:177的vh和seq?id?no:181的vl；

89、x)seq?id?no:185的vh和seq?id?no:189的vl；

90、y)seq?id?no:193的vh和seq?id?no:197的vl；

91、z)seq?id?no:201的vh和seq?id?no:205的vl；

92、aa)seq?id?no:209的vh和seq?id?no:213的vl；

93、bb)seq?id?no:217的vh和seq?id?no:221的vl；

94、cc)seq?id?no:225的vh和seq?id?no:229的vl；

95、dd)seq?id?no:233的vh和seq?id?no:237的vl；

96、ee)seq?id?no:241的vh和seq?id?no:245的vl；

97、ff)seq?id?no:249的vh和seq?id?no:253的vl；

98、gg)seq?id?no:257的vh和seq?id?no:261的vl；

99、hh)seq?id?no:265的vh和seq?id?no:269的vl；

100、ii)seq?id?no:273的vh和seq?id?no:277的vl；jj)seq?id?no:281的vh和seq?idno:285的vl；

101、kk)seq?id?no:289的vh和seq?id?no:293的vl；

102、ll)seq?id?no:297的vh和seq?id?no:301的vl；

103、mm)seq?id?no:305的vh和seq?id?no:309的vl；

104、nn)seq?id?no:313的vh和seq?id?no:317的vl；

105、oo)seq?id?no:321的vh和seq?id?no:325的vl；

106、pp)seq?id?no:329的vh和seq?id?no:333的vl；

107、qq)seq?id?no:337的vh和seq?id?no:341的vl；

108、rr)seq?id?no:345的vh和seq?id?no:349的vl；

109、ss)seq?id?no:353的vh和seq?id?no:357的vl；

110、tt)seq?id?no:361的vh和seq?id?no:365的vl；

111、uu)seq?id?no:369的vh和seq?id?no:373的vl；

112、vv)seq?id?no:377的vh和seq?id?no:381的vl；

113、ww)seq?id?no:385的vh和seq?id?no:389的vl；

114、xx)seq?id?no:393的vh和seq?id?no:397的vl；

115、yy)seq?id?no:401的vh和seq?id?no:405的vl；

116、zz)seq?id?no:409的vh和seq?id?no:413的vl；

117、aaa)seq?id?no:417的vh和seq?id?no:421的vl；

118、bbb)seq?id?no:425的vh和seq?id?no:429的vl；

119、ccc)seq?id?no:433的vh和seq?id?no:437的vl；

120、ddd)seq?id?no:441的vh和seq?id?no:445的vl；

121、eee)seq?id?no:449的vh和seq?id?no:453的vl；

122、fff)seq?id?no:457的vh和seq?id?no:461的vl；

123、ggg)seq?id?no:465的vh和seq?id?no:469的vl；

124、hhh)seq?id?no:473的vh和seq?id?no:477的vl；

125、iii)seq?id?no:481的vh和seq?id?no:485的vl；和

126、jjj)seq?id?no:489的vh和seq?id?no:493的vl。

127、在一個(gè)實(shí)施方案中，所述分離的抗體或其抗原結(jié)合片段特異性結(jié)合hbsag胞外結(jié)構(gòu)域的s區(qū)中的表位。

128、在一個(gè)實(shí)施方案中，所述分離的抗體或其抗原結(jié)合片段特異性結(jié)合hbv以及其突變株。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述hbv突變株是天然存在的hbv突變株。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述hbv突變株選自g145r、k122r-g145r和f134l。

129、在一個(gè)實(shí)施方案中，本文所述的分離的抗體或其抗原結(jié)合片段以小于0.5μg/ml的50％抑制濃度ic50值體外中和hbv及其突變株，如通過基于本公開內(nèi)容所述的方法所測定。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述hbv突變株是天然存在的hbv突變株。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述hbv突變株選自g145r、k122r-g145r和f134l。

130、在一個(gè)實(shí)施方案中，所述分離的抗體或其抗原結(jié)合片段對hbv的不同基因型具有中和活性。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述基因型選自a基因型、b基因型、c基因型和d基因型。

131、在一個(gè)實(shí)施方案中，本文所述的分離的抗體或其抗原結(jié)合片段為單克隆抗體、多克隆抗體、重組抗體、人抗體、人源化抗體、嵌合抗體、多特異性抗體或其抗體片段。

132、在一個(gè)實(shí)施方案中，所述抗原結(jié)合片段為fab片段、fab'片段、f(ab')2片段、fv片段、雙抗體或單鏈抗體分子。

133、在一個(gè)實(shí)施方案中，本文所述的分離的抗體或其抗原結(jié)合片段為igg1型、igg2型、igg3型或igg4型。

134、本發(fā)明還提供了一種分離的多核苷酸，所述分離的多核苷酸編碼本文所述的分離的抗體或其抗原結(jié)合片段。

135、本發(fā)明還提供了一種表達(dá)載體，所述表達(dá)載體包含本文所述的多核苷酸。

136、本發(fā)明還提供了一種宿主細(xì)胞，所述宿主細(xì)胞包含本文所述的表達(dá)載體。

137、本發(fā)明還提供了一種產(chǎn)生本文所述的分離的抗體或其抗原結(jié)合片段的方法，其特征在于所述方法包括在允許所述抗體或其抗原結(jié)合片段表達(dá)的條件下培養(yǎng)本文所述的宿主細(xì)胞，以及回收由所述宿主細(xì)胞產(chǎn)生的抗體或其抗原結(jié)合片段。

138、本發(fā)明還提供了一種藥物組合物，所述藥物組合物包含本文所述的分離的抗體或其抗原結(jié)合片段以及藥學(xué)上可接受的載劑。

139、本發(fā)明還提供了所述分離的抗體或其抗原結(jié)合片段在制備用于治療或預(yù)防有需要的受試者的hbv感染的藥物中的用途。

140、本發(fā)明還提供了所述分離的抗體或其抗原結(jié)合片段在制備用于治療或預(yù)防有需要的受試者的hbv及其突變株感染的藥物中的用途。

141、在某些方面，本發(fā)明提供了用于治療或預(yù)防有需要的受試者的hbv感染的方法，所述方法包括給予受試者有效量的至少一種本文公開的分離的抗體或其抗原結(jié)合片段。

142、在某些方面，本發(fā)明提供了用于治療或預(yù)防有需要的受試者的hbv及其突變株感染的方法，所述方法包括給予受試者有效量的至少一種本文公開的分離的抗體或其抗原結(jié)合片段。

143、在某些方面，本發(fā)明提供了本文公開的分離的抗體或其抗原結(jié)合片段，用于治療或預(yù)防有需要的受試者的hbv及其突變株感染。

144、在某些方面，本發(fā)明提供了一種乙肝病毒表面抗體或其抗原結(jié)合片段，所述抗體或其抗原結(jié)合片段特異性結(jié)合hbsag胞外結(jié)構(gòu)域的s區(qū)中的表位。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述表位位于hbsag的s區(qū)的氨基酸殘基99-169中。所述表位位于hbsag的氨基酸殘基124-147中。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述hbsag具有seq?id?no:497所示的氨基酸序列。在某些實(shí)施方案中，所述抗體或其抗原結(jié)合片段結(jié)合具有與seq?id?no:497或其上述子序列至少90％同一性的氨基酸序列中的表位。