本發(fā)明屬于基因生物工程領域，涉及構建重組腺病毒的方法，具體說，是一種利用牛腸道病毒vp1基因重組腺病毒的構建方法及重組腺病毒和應用。

背景技術：

1、牛腸道病毒(bovine?enterovirus，bev)是廣泛存在于動物機體內(nèi)的一種以消化道和呼吸道為主要癥狀的流行性傳染病。感染后會引起牛腹瀉、流涕、發(fā)熱、咳嗽、胃腸炎、呼吸困難甚至突然死亡等，部分牛群感染bev后，呈隱性感染，不表現(xiàn)出明顯的臨床癥狀，常因此引起繼發(fā)性感染，造成嚴重的損失。在我國由于缺乏對牛腸道病毒病防控措施和有效疫苗接種，飼養(yǎng)動物環(huán)境條件也有所限制，只得從國外大量引進新鮮品種牛群進行雜交，因此也使得牛腸道病毒病毒得以迅速的擴散。bev正在中國的養(yǎng)牛業(yè)中被廣泛傳播，極大地阻礙了中國養(yǎng)牛業(yè)的發(fā)展，因為它不僅在牛身上產(chǎn)生腹瀉等癥狀，而且還與其他病毒聯(lián)合起來感染牛群，產(chǎn)生更嚴重的臨床癥狀。

2、近年來，國內(nèi)臨床上以腹瀉為主要特征的疫病與日俱增，如果不進行控制，局面將無法挽回。目前市面上針對bev的治療方法大多是采用藥物治療，但其實目前接種疫苗是預防傳染病最經(jīng)濟有效的手段，疾病病原體或其相關的蛋白質(zhì)、多糖或核酸構成了大多數(shù)疫苗，它們可以直接或通過某些載體在體內(nèi)引起特定的體液和細胞免疫。而目前常用的疫苗存在諸多問題例如安全性低、免疫原性差等，所以研制一種安全又高效的新型疫苗勢在必行。vp1是bev的結構蛋白，可誘導被感染動物產(chǎn)生中和抗體，能夠參與細胞識別和吸附，在vp1蛋白上有最主要的抗原抗體結合位點，在免疫領域具有無可比擬的優(yōu)勢。重組腺病毒載體疫苗是一類新型的載體疫苗，它是一種通過將載體與基因蛋白重組后在體內(nèi)表達特定抗原能力的疫苗，并使用病毒作為載體。重組腺病毒載體疫苗較傳統(tǒng)疫苗具有安全性更好、重組病毒滴度更高、產(chǎn)量更大、免疫原性更強等優(yōu)點，同時有多種給藥途徑，可以侵染不同類型的細胞和組織，非常適用于基因工程疫苗及基因治療研究。

3、如何提供一種方便大規(guī)模生產(chǎn)、技術成熟和配方穩(wěn)定性良好并且具有良好的免疫效果的牛腸道病毒vp1基因重組腺病毒構建方法，對于獲得的有效疫苗來給予bev更有效的保護，對bev進行預防和控制bev，以及促進畜牧業(yè)生產(chǎn)及其產(chǎn)品的健康和可持續(xù)增長是至關重要的。

技術實現(xiàn)思路

1、針對現(xiàn)有技術中針對牛腸道病毒感染相關疫苗安全性低、免疫原性差，安全又高效的新型疫苗鮮有報道的技術問題，本發(fā)明旨在提供一種牛腸道病毒vp1基因重組腺病毒的構建方法及重組腺病毒和應用，將bev的vp1基因與腺病毒載體系統(tǒng)高效穩(wěn)定表達外源基因的特性結合起來，構建出能夠表達上述基因的重組腺病毒，對免疫后的小鼠進行bev攻毒試驗，通過熒光定量pcr檢測各組織的bev病毒載量評價該疫苗抑制bev體內(nèi)感染效果驗證其免疫原性。通過免疫小鼠初步驗證其免疫原性及安全性，旨在為后期該疫苗的應用提供材料，為bev病毒活載體疫苗研究提供基礎。

2、為了解決上述技術問題，本發(fā)明采用的技術方案是：一種牛腸道病毒vp1基因重組腺病毒的構建方法，包括以下步驟：

3、(1)從牛腸道病毒毒株中分別擴增出vp1基因序列；

4、所述的vp1基因的擴增包括：以vp1-f?seq?id?no.1和vp1-rseq?id?no.2為引物，以牛腸道病毒毒株bl311的cdna為模板，pcr擴增獲得vp1基因seq?id?no.3；pcr反應擴增體系為：2×taq?pcr?mix?10.0μl、vp1-f?0.5μl、vp1-r?0.5μl、cdna模板2.0μl、ddh2o?7.0μl；pcr反應程序：94℃預變性5min，94℃變性30s，68℃退火30s，72℃延伸1min，38個循環(huán)；72℃延伸10min；

5、(2)用限制性內(nèi)切酶ecor?i與sal?i-hf將腺病毒空載體pdc316-cmv-copgfp進行酶切，反應體系為：ecor?i?1.0μl、sal?i-hf?1.0μl、cutsmart?buffer?1.0μl、pdc316-cmv-copgfp?0.6μl、ddh2o6.4μl；反應程序：37℃孵育4h，85℃滅活15min；

6、(3)分別將步驟(1)中擴增獲得的vp1基因即步驟(2)中腺病毒空載pdc316-cmv-copgfp進行連接，反應體系為10×ligase?buffer?1.0μl、t4?dna?ligase?1.0μl、pdc316-cmv-copgfp?1.0μl、vp17.0μl，配制混勻并置于4℃過夜連接,獲得重組穿梭質(zhì)粒pdc316-vp1-copgfp；

7、(3)將重組穿梭質(zhì)粒pdc316-vp1-copgfp與腺病毒大骨架質(zhì)粒pbhglox-△e1，3cre共轉染293lp細胞，重組并包裝獲得重組腺病毒radv-vp1。

8、優(yōu)選的，所述大骨架質(zhì)粒和穿梭質(zhì)粒以(1-4)：1的比例進行共轉染。

9、更優(yōu)選的，所述大骨架質(zhì)粒和穿梭質(zhì)粒以4：1的比例進行共轉染。

10、優(yōu)選的，所述轉染過程中，胎牛血清濃度為2-5％。

11、更優(yōu)選的，所述轉染過程中，胎牛血清濃度為2％。

12、所述的牛腸道病毒vp1基因重組腺病毒的構建方法制備的重組腺病毒。

13、所述的牛腸道病毒vp1基因重組腺病毒的構建方法制備的重組腺病毒在防治牛腸道病毒感染中的應用。

14、所述的牛腸道病毒vp1基因重組腺病毒的構建方法制備的重組腺病毒在制備防治牛腸道病毒感染相關疫苗、藥物中的應用。

15、所述帶防治牛腸道病毒感染疫苗的劑型包括注射劑、滴鼻劑或噴霧劑。

16、與現(xiàn)有技術相比，本發(fā)明具有如下有益效果：

17、(1)通過采用本技術提供的技術方案進行小鼠腺病毒病毒免疫，bvdv攻毒后10d和15d，與對照組相比，重組腺病毒免疫組與對照組的bev相對拷貝數(shù)差異逐漸形成，免疫組中各組織的bev拷貝數(shù)顯著性低于對照組(p<0.0001)。結果表明，在bev攻毒后10d和15d開始，radv-vp1免疫組較對照組而言能顯著性降低bev拷貝數(shù)，表明使用radv-vp1免疫小鼠能顯著性抑制bev體內(nèi)復制。

18、(2)用重組腺病毒radv-vp1和radv-copgfp免疫后實驗組小鼠和pbs接種的對照組小鼠之間體重差異不顯著(p﹥0.05)，在攻毒后腺病毒免疫組小鼠體重無明顯變化，未免疫組與空載組小鼠體重增長趨勢有所降低，這表明接種重組腺病毒疫苗沒有副作用，且能較好的保護小鼠免受bev病毒的攻擊。

19、(3)與空載組和pbs對照組相比，重組腺病毒radv-vp1組均能在一免1-2周后檢測到相應的特異性抗體，小鼠經(jīng)過三次免疫，重組腺病毒免疫組抗體效價逐步升高，在14d二免和21d三免后的產(chǎn)生更高的抗體水平，顯著性高于對照組(p<0.01)。

20、(4)3次免疫后，重組腺病毒組抗體水平極顯著提高(p<0.05)，其中，腺病毒空載組和pbs對照組誘導抗體趨勢相近，兩組誘導抗體產(chǎn)生的能力無顯著性差異(p>0.05)；第三次免疫后重組腺病毒疫苗組誘導vp1抗體水平最高，極顯著高于腺病毒空載組和pbs對照組(p<0.01)。

21、(5)第二免疫后，腺病毒免疫組的細胞因子水平和空載組以及對照組差異開始顯著，腺病毒免疫組radv-vp1的ifn-γ水平顯著高于其他組(p<0.05)，三免后濃度可達到13.85pg/ml，免疫組radv-vp1的ifn-γ水平極顯著高于腺病毒空載組和pbs對照組(p<0.01)；同樣，腺病毒免疫組radv-vp1的il-4水平也是極顯著高于其他組(p<0.01)。