本實用新型涉及面向生物單細胞檢測應用的微米結構基底，特別是一種輔助單細胞可視化、藥物篩選、毒性檢測的生物明膠材料微米結構芯片。

主要是通過兩次壓印工藝，在生物活性材料薄膜的表面加工出高精度的微米級結構圖形，在這些微米結構上培養(yǎng)觀察微生物個體，可以實現生物單細胞檢測，還可以對大分子藥物進行篩選，檢測毒性。

背景技術：

自然界中不同種類的微生物一般都是以群體的形式存在，個體之間通過某些特殊方法進行信息交流和溝通。近年來，研究人員對微生物種群中的個體之間信息交流方法的研究越來越廣泛。由于這種個體間信息交流方法在自然界中普遍存在和廣泛應用，因此通過研究微生物個體間的行為特征和信息交流，可以實現藥物篩選、毒性檢測等，參見Parsek,M.R.and E.P.Greenberg, Sociomicrobiology:the connections between quorum sensing and biofilms.Trends in Microbiology,2005.13(1):p.27-33.。隨著生物微操作技術的快速發(fā)展，3D打印，參見Connell,J.L.,et al.,3D printing of microscopic bacterial communities. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 2013.110(46):p.18380-18385.、微流道、微腔和微滴發(fā)生器等技術，被廣泛應用于生物單細胞檢測領域，這些技術實現了對微生物個體間的信息交流和行為特征變化的高精度觀察。以上所述技術盡管實現了生物單細胞檢測，但是都需要昂貴的設備和較高的加工成本，難以應用在需要高通量的生物單細胞檢測領域，并且在后期對微生物個體的行為特性進行觀察統(tǒng)計時也不具備可視化的優(yōu)點。

隨著MEMS技術的快速發(fā)展，其被廣泛應用在各個領域。微納加工為單細胞生物檢測領域提供了一種新的方法，而微納壓印由于其成本低廉、操作簡單等優(yōu)點，有很好的應用前景。熱壓印工藝是在微納米尺度獲得并行復制結構的一種成本低而速度快的方法，僅需一個模具，完全相同的結構可以按需復制到大的表面上。熱壓印由Stephen Y.Chou于1995年首次提出并申請專利，參見專利US5772905“Nanoimprint lithography”。

目前，基于生物活性材料的微壓印工藝，在技術實現上還是遇到非常大的難題，這是因為微壓印工藝及脫模過程中溫度、壓力條件單一且壓印模板固定，很容易損壞生物材料的活性，不利于后續(xù)細菌或細胞的培養(yǎng)。

技術實現要素：

本實用新型為了克服上述細胞檢測過程中所遇到的困難與缺點，針對基于生物活性材料的微壓印工藝難以實現這一技術難題，采用了成本低廉、操作簡單的兩步壓印技術，研制出了一種基于微結構的生物單細胞檢測芯片。

本實用新型技術方案：

一種單細胞生物檢測芯片，包括生物檢測芯片；

包括生物檢測芯片表面帶有的微米圖形結構；

其中所述的微米圖形結構為倒金字塔、錐形或孔柱、溝槽陣列；

所述的圖形結構之間為等間隔或為變間隔分布。生物檢測芯片及其表面帶有的微米圖形結構為一體結構。

本實用新型生物檢測芯片材料為生物明膠薄膜。

其實現步驟如下：

第1、在基底表面采用刻蝕法、生長法、電鍍法、光刻法或沉積法制備微米結構作為模板，所制備的微米結構為倒金字塔、錐形或孔柱陣列；所述的基底材料為硅、鎳、銅或鋅等硬質薄板；

第2、熱壓印工藝前，為使脫模簡單，在上述微米結構模板表面采用旋涂法、噴涂法、浸潤法、蒸發(fā)法或濺射法制備疏水涂層，疏水涂層材料為本征靜態(tài)接觸角大于90度的任意疏水材料，得到帶有疏水涂層的微米結構模板；

第3、基于上述第2步所述帶有疏水涂層的微米結構模板，進行熱塑性聚合物材料的一次熱壓印工藝，壓印溫度略高于熱塑性聚合物材料的熔點，且在壓印過程中通過晶圓鑷子手動施加壓力，并保持所施加壓力的均勻性，經過 2min-6min的壓印時間，對模板和聚合物材料迅速冷卻至室溫，然后進行脫模工藝，經歷一次熱壓印工藝的圖形復刻，得到表面帶有微結構的聚合物材料。

第4、以上述第3步帶有微結構的聚合物材料為模板，進行生物活性材料的二次涂覆壓印工藝。以旋涂、噴涂或浸潤方法在聚合物模板表面涂覆一層配置好的生物活性材料，這種生物活性材料是用于實現生物單細胞檢測過程中的細菌或細胞培養(yǎng)基，經過2℃-8℃低溫環(huán)境冷藏8h-14h后，進行脫模工藝，聚合物材料的微米結構被復刻到生物活性材料薄膜表面。

本實用新型的有益效果是：本實用新型創(chuàng)新性地使用了一種兩步壓印工藝和圖形復刻的技術，即一次熱壓印工藝和二次涂覆壓印工藝。由于直接基于帶有微結構的硅模板或者金屬硬質模板的生物活性材料的單次壓印方法中，脫模工藝比較困難，且容易損壞生物材料的活性，因此，根據本實用新型所采用的技術，先進行基于帶有微結構的硅模板或者金屬硬質模板的熱塑性聚合物材料的一次熱壓印工藝，把模板上的微結構圖形復刻到熱塑性聚合物薄膜上，然后以制得的聚合物薄膜為模板，進行生物活性材料的二次壓印和脫模工藝，以此把硅模板或者金屬硬質模板上的微結構完整地復刻到生物活性材料薄膜上。本實用新型實現簡單方便，圖形復刻精度高，經濟效益好，且不損壞生物材料的活性，實現的單細胞生物檢測具有高通量、可控、可視化的優(yōu)點，應用前景廣闊。

附圖說明

圖1(a)-(f)為倒金字塔硅模板制備工藝流程圖。

圖2(a)-(f)為兩次壓印工藝流程圖。

圖3(a)-(c)為3維結構示意圖，其中(a)為倒金字塔結構硅模板，(b)為脫模后 Teflon FEP模板，(c)為脫模后明膠薄膜。

圖4(a)-(c)為刻蝕和兩次壓印工藝的SEM結果，其中(a)為倒金字塔硅模板SEM 圖，(b)為熱壓印后的聚合物Teflon FEP表面的SEM圖，(c)為涂覆壓印后的生物明膠材料表面的SEM圖。

圖中，1硅基底，2倒金字塔結構，3 Teflon FEP基底，4正金字塔結構，5 生物明膠基底，6倒金字塔結構。

具體實施方式

為使本實用新型的目的、技術方案和優(yōu)點更加清晰明白的說明，下面就結合具體實施例對本實用新型進行解釋說明，并不旨在表示可以構建或使用本實用新型示例的唯一形式。應當理解，此處所描述的具體實施例僅僅用以解釋本實用新型，闡述本實用新型示例的功能，以及用以構建和操作本實用新型示例的步驟的序列，并不用于限定本實用新型的范圍。

實施例1

一種單細胞生物檢測芯片，實現步驟如下：

(1)在硅基底1表面采用刻蝕法局部制備微米結構，所述基底1材料為硅片，所制備的微米結構為倒金字塔結構2，制備工藝具體如下：①清洗，將四寸硅片和掩膜板分別放入丙酮中，超聲清洗15分鐘，然后放入異丙醇中，繼續(xù)超聲清洗10分鐘，最后將硅片和掩膜板放入去離子水超聲清洗10分鐘，用氮氣槍吹干備用；②采用LPCVD工藝在上述硅片表面生長一層二氧化硅作為掩膜，厚度為1微米，如圖1(a)中所示；③采用蒸發(fā)法在硅片表面涂覆黏附劑，將清洗干凈的上述②中硅片放入黏附劑HDMS箱體中，設置時間10分鐘；④光刻，將涂有黏附劑的硅片放在涂膠機上，滴入光刻膠，光刻膠采用AZ5214，轉速4000r/s，旋涂30s，然后放在熱板上烘90s，溫度為95℃；曝光機曝光6.5s，然后放入3038顯影液中顯影45s，取出用去離子水清洗并用氮氣吹干后，放在熱板上烘2min，溫度為110℃，如圖1(b)(c)中所示；⑤采用RIE工藝刻蝕20min，刻蝕掉生長的二氧化硅層，如圖1(d)中所示；⑥清洗，將上述經過RIE刻蝕的硅片放入丙酮中，超聲清洗15分鐘，然后倒出丙酮，加入異丙醇，繼續(xù)超聲清洗15分鐘，最后將硅片取出，用去離子水超聲清洗5-15分鐘，用氮氣槍吹干；⑦KOH刻蝕，將上述清洗完的硅片放入濃度為30％的KOH溶液中刻蝕20min，溫度保持在80℃，如圖1(e)中所示；⑧清洗，將上述經過KOH刻蝕的硅片放入丙酮中，超聲清洗15分鐘，然后倒出丙酮，加入異丙醇，繼續(xù)超聲清洗15 分鐘，最后將硅片取出，用去離子水超聲清洗5-15分鐘，用氮氣槍吹干；⑨去膠，將上述刻蝕好的硅片依次放入丙酮和異丙醇中分別浸泡10min，然后用去離子水清洗，并用氮氣吹干，將清洗干凈的硅片放入等離子去膠機中干法清洗，功率為600w，時間15min，制得倒金字塔微米結構，所得倒金字塔結構硅模板結構如圖3(a)所示，其SEM如圖4(a)中所示。

(2)在上述所得倒金字塔硅模板的表面采用旋涂法制備疏水涂層，其中疏水涂層的材料為濃度0.05wt％的Teflon AF1600溶液，得到帶有疏水涂層的倒金字塔硅模板，具體方法如下：首先，將質量為50mg的溶質Teflon AF1600和100g 的溶劑FC40混合均勻，配比得到濃度為0.05wt％的Teflon AF1600溶液，使用磁力攪拌器攪拌24h，然后將步驟1)中得到的倒金字塔硅模板裁剪為長寬均為 1cm的方片，將配置得到的濃度為0.05wt％的Teflon AF1600溶液旋涂在經過裁剪的倒金字塔硅模板的表面，最后進行烘干操作，將其在溫度為170℃的熱板上烘干5min，之后溫度升高至340℃繼續(xù)烘干30min，這樣混合溶液中的FC40被蒸發(fā)，Teflon AF1600均勻的涂覆在倒金字塔硅模板的表面，以使后續(xù)脫模工藝容易操作。

(3)根據上述倒金字塔硅模板的尺寸，同樣裁剪厚度為3.5mm的聚合物 Teflon FEP薄膜為1cm*1cm的方片，首先將Teflon FEP薄膜夾在倒金字塔硅模板和玻璃片之間，這樣使得壓印過程中Teflon FEP薄膜受力受熱均勻，然后把夾好的Teflon FEP薄膜放在熱板上，溫度設定在280℃，在加熱的過程中手動通過晶圓鑷子施加一個恒定的中等壓力在玻璃片上，并保持所施加壓力的均勻性，這樣使得處于玻璃態(tài)的Teflon FEP能完全滲入到倒金字塔硅模板表面的倒金字塔結構的槽內，如圖2(c)中所示。經過5min的熱壓印過程，迅速使用平口鉗把Teflon FEP轉移到不銹鋼冷臺上，經過充分的降溫處理，再進行脫模工藝，由于倒金字塔硅模板表面的倒金字塔的V型結構，又因本實用新型在步驟2) 中進行的疏水涂層的預處理，使得本方法脫模工藝相對簡單，得到的Teflon FEP 基底3表面的正金字塔結構4平整光滑，脫模后Teflon FEP模板結構如圖3(b) 所示，其SEM如圖4(b)所示。

(4)首先稱量3g的明膠顆粒和0.3g的牛血清蛋白，然后混合在10ml的蒸餾水中，攪拌均勻，然后100℃水浴加熱20min，并且期間不斷攪拌混合溶液，使得明膠和牛血清蛋白混合均勻，接著使用攪拌棒蘸取三滴明膠混合溶液，涂覆在步驟(3)中的熱壓印后的聚合物Teflon FEP材料的表面，涂覆均勻，如圖 2(e)中所示，最后把Teflon FEP低溫冷藏12h，溫度設置在4℃。明膠混合溶液固化后進行脫模，由于聚合物材料的低粘附性和明膠材料的彈性，因此脫模工藝相對簡單。由此制得與生物明膠基底5為一體的表面具有倒金字塔結構6 的生物明膠材料，倒金字塔結構復刻完整，其結構如圖3(c)所示，其SEM如圖4(c)中所示，可以用于下一步的單細胞生物檢測技術中。在后續(xù)進行單細胞生物培養(yǎng)和觀察的實驗中，本實用新型制備的倒金字塔結構明膠培養(yǎng)基底非常好的實現了單細胞生物檢測，實驗成功率接近100％。

此處實施例的描述只是作為示例給出并且本領域的技術人員可以做出各種修改。以上說明、示例和數據提供了對本實用新型的各示例性實施例的結構和使用的全面描述。本實施方式中僅僅以倒金字塔結構作為實施例對本實用新型做出進一步的說明，但本實用新型生物檢測芯片上的微米圖形結構不限于倒金字塔結構，同樣可為錐形或孔柱、溝槽陣列，其效果及制備與本實施例中的倒金字塔結構完全相同，在此不一一贅述。雖然上文以一定的詳細度或參考一個或多個單個實施例描述了本實用新型的各實施例，但是，在不偏離本實用新型的精神或范圍的情況下，本領域的技術人員可以對所公開的實施例做出很多修改。