本發(fā)明涉及一種干柔型高類黃酮蘋果酒及其制備方法。
背景技術(shù)：
：酒的度數(shù)，又稱酒精度，指的是酒中乙醇所占的體積百分比，如無特殊說明，通常指的是20℃時(shí)酒中乙醇所占的體積百分比。酒精度一般用x％表示，有時(shí)也用x％(v/v)或x％vol或x°表示。酒精度為x％的意思是，20℃時(shí)，100單位體積的酒中含有x單位體積的乙醇。低度果酒，例如干紅葡萄酒、干白葡萄酒，由于含有類黃酮(花青苷)、人體必需的氨基酸及礦質(zhì)元素等營養(yǎng)保健成分，近幾年在中國的消費(fèi)呈明顯的上升態(tài)勢。但是，低度果酒的酒精含量低、刺激作用小，不能有效滿足習(xí)慣喝白酒的人群的需求。為了滿足習(xí)慣喝白酒人群的需求，現(xiàn)有技術(shù)中通常通過向發(fā)酵液里加糖或食用酒精的方式來增加低度果酒的酒精度。酒及酒文化，是中國飲食和社會(huì)文化的重要組成部分。白酒已滲透于整個(gè)中華五千年的文明史中，從文學(xué)藝術(shù)創(chuàng)作、文化娛樂到飲食烹飪、養(yǎng)生保健等各方面都占有重要的位置。客從遠(yuǎn)方來，無酒不足以表達(dá)深情厚意。良辰佳節(jié)，無酒不足以顯示歡快愜意。春風(fēng)得意，無酒不足以抒發(fā)豪情壯志。因此，盡管低度果酒在中國的消費(fèi)呈明顯的上升態(tài)勢，具有一定酒度的白酒在未來仍有很大的發(fā)展空間?！搬t(yī)食同源，吃營養(yǎng)，吃健康”已成為人們的共識(shí)。蘋果果實(shí)含有較多的人體容易吸收的游離多酚或類黃酮，在抗氧化、預(yù)防心腦血管疾病及抗腫瘤等方面均具有較好的作用，而酚酸(phenolicacids)是一類含有酚環(huán)的有機(jī)酸，具有醒腦提神、滋陰養(yǎng)顏、美白肌膚、清熱解火的功效，“一天一蘋果，醫(yī)生遠(yuǎn)離我”，世界上相當(dāng)多的國家都將蘋果作為主要消費(fèi)果品而大力推薦。但長期以來，由于對(duì)產(chǎn)量和外觀的過分追求，而果實(shí)多酚等一些優(yōu)良性狀在歷史的長河中逐漸被淘汰。為此，陳學(xué)森教授所在課題組率先提出了“功能型(高類黃酮)蘋果”的概念及其育種思路，為完善新品種選育方案，提高育種效率，擴(kuò)大高類黃酮蘋果的應(yīng)用范圍，采取了四項(xiàng)措施：一是在對(duì)新疆紅肉蘋果與蘋果品種雜種一代果實(shí)總酚含量等性狀遺傳變異研究的基礎(chǔ)上，提出并實(shí)施了“三選兩早一促”的蘋果育種法(專利號(hào)zl201310205419.6)，育種效率顯著提高；二是利用遺傳背景復(fù)雜的‘嘎啦’等蘋果品種與新疆紅肉蘋果(m.sieversiif.niedzwetzkyana)進(jìn)行多親本雜交與反復(fù)回交，旨在進(jìn)行品質(zhì)育種，目前已構(gòu)建雜(回)交一、二代分離群體40個(gè)，定植雜種實(shí)生苗4萬株，并申報(bào)了“果樹多種源品質(zhì)育種法”(專利申請(qǐng)?zhí)?01510428448.8)及“易著色蘋果品種培育法”(專利申請(qǐng)?zhí)?01510890141.x)2個(gè)育種技術(shù)發(fā)明專利；三是及時(shí)地以性狀基本穩(wěn)定的后代株系為試材，進(jìn)行品質(zhì)性狀評(píng)價(jià)及發(fā)育機(jī)理的研究，并已取得了諸多重要進(jìn)展；四是按照“可移動(dòng)、小型化、智能化、純天然、無添加”的理念，研制了包括一種行程式高類黃酮蘋果破碎打漿器、多功能釀酒分餾器、多效冷凝烤酒器及分離儲(chǔ)酒器等高類黃酮蘋果酒加工成套設(shè)備及加工工藝。目前，已創(chuàng)建了常規(guī)雜交與生物技術(shù)有機(jī)結(jié)合的蘋果高效育種技術(shù)體系，創(chuàng)制了一批新品種及優(yōu)異種質(zhì)，研發(fā)了蘋果新品種配套高效栽培與深加工技術(shù)體系。授權(quán)和申報(bào)發(fā)明專利30余項(xiàng)，育成新品種(系)16個(gè)；發(fā)表相關(guān)研究論文120篇，其中sci論文20余篇，這些研究成果總體處在國際同類研究的領(lǐng)先水平。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：本發(fā)明的目的是提供一種干柔型高類黃酮蘋果酒及其制備方法。本發(fā)明首先提供了一種蘋果加工品(低度酒基)的制備方法，其特征在于：以高類黃酮蘋果的成熟果實(shí)為原料，包括依次進(jìn)行的如下步驟：(1)破碎打漿；(2)滅菌；(3)加入果膠酶；(4)加入釀酒酵母并進(jìn)行發(fā)酵，直至發(fā)酵體系的酒精度不再升高；(5)收集液相，即為蘋果加工品。所述低度酒基的制備方法中，所述高類黃酮蘋果的成熟果實(shí)為唯一原料。所述低度酒基的制備方法中，所述高類黃酮蘋果的成熟果實(shí)為清洗后的果實(shí)。所述低度酒基的制備方法中，所述高類黃酮蘋果的成熟果實(shí)為用自來水清洗后的果實(shí)。所述低度酒基的制備方法中，所述高類黃酮蘋果的成熟果實(shí)為用自來水徹底清洗去雜后的果實(shí)。所述低度酒基的制備方法的所述步驟(1)中，破碎打漿至果漿粒度為1mm以下。所述低度酒基的制備方法的所述步驟(2)中，所述滅菌的條件為：80-100℃滅菌5-12小時(shí)。所述低度酒基的制備方法的所述步驟(2)中，所述滅菌的條件具體可為：100℃、5小時(shí)。所述低度酒基的制備方法的所述步驟(3)中，當(dāng)果漿溫度為45-55℃時(shí)，加入果膠酶。所述低度酒基的制備方法的所述步驟(3)中，當(dāng)果漿自然冷卻至溫度為45-55℃時(shí)，加入果膠酶。所述低度酒基的制備方法的所述步驟(3)中，當(dāng)果漿溫度為45-50℃時(shí)，加入果膠酶。所述低度酒基的制備方法的所述步驟(3)中，當(dāng)果漿自然冷卻至溫度為45-50℃時(shí)，加入果膠酶。所述低度酒基的制備方法的所述步驟(3)中，當(dāng)果漿溫度為45℃時(shí)，加入果膠酶。所述低度酒基的制備方法的所述步驟(3)中，當(dāng)果漿自然冷卻至溫度為45℃時(shí)，加入果膠酶。所述低度酒基的制備方法的所述步驟(3)中，所述果膠酶的加入量為：每千克高類黃酮蘋果的成熟果實(shí)相應(yīng)加入100萬u以上的果膠酶。所述低度酒基的制備方法的所述步驟(3)中，所述果膠酶的加入量為：每千克鮮重的高類黃酮蘋果的成熟果實(shí)相應(yīng)加入100萬u-150萬u以上的果膠酶。所述低度酒基的制備方法的所述步驟(3)中，所述果膠酶的加入量為：每千克高類黃酮蘋果的成熟果實(shí)相應(yīng)加入100萬u-150萬u的果膠酶。所述低度酒基的制備方法的所述步驟(3)中，所述果膠酶的加入量為：每千克鮮重的高類黃酮蘋果的成熟果實(shí)相應(yīng)加入100萬u-150萬u的果膠酶。所述低度酒基的制備方法的所述步驟(3)中，所述果膠酶的加入量為：每千克高類黃酮蘋果的成熟果實(shí)相應(yīng)加入2-3g果膠酶。所述低度酒基的制備方法的所述步驟(3)中，所述果膠酶的加入量為：每千克鮮重的高類黃酮蘋果的成熟果實(shí)相應(yīng)加入2-3g果膠酶。所述低度酒基的制備方法的所述步驟(4)中，當(dāng)果漿溫度為25-35℃時(shí)，加入釀酒酵母。所述低度酒基的制備方法的所述步驟(4)中，當(dāng)果漿自然冷卻至溫度為25-35℃時(shí)，加入釀酒酵母。所述低度酒基的制備方法的所述步驟(4)中，當(dāng)果漿溫度為30℃時(shí)，加入釀酒酵母。所述低度酒基的制備方法的所述步驟(4)中，當(dāng)果漿自然冷卻至溫度為30℃時(shí)，加入釀酒酵母。所述低度酒基的制備方法的所述步驟(4)中，所述釀酒酵母的加入量為：每千克高類黃酮蘋果的成熟果實(shí)相應(yīng)加入1010cfu釀酒酵母。所述低度酒基的制備方法的所述步驟(4)中，所述釀酒酵母的加入量為：每千克鮮重的高類黃酮蘋果的成熟果實(shí)相應(yīng)加入1010cfu釀酒酵母。所述發(fā)酵的過程中，從加入釀酒酵母24小時(shí)后開始持續(xù)監(jiān)測發(fā)酵體系的溫度，控制溫度為15-20℃。所述“直至發(fā)酵體系的酒精度不再升高”時(shí)，發(fā)酵體系的酒精度為9％-12％。所述釀酒酵母具體可為高類黃酮蘋果酒酵母一號(hào)。所述低度酒基的制備方法的所述步驟(5)中，所述“收集液相”具體可為“過600目篩，收集液相”。以上任一所述方法制備得到的蘋果加工品(低度酒基)也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。本發(fā)明還保護(hù)所述蘋果加工品(低度酒基)在制備蘋果酒中的應(yīng)用。本發(fā)明還保護(hù)一種蘋果酒(干柔型高類黃酮蘋果酒)的制備方法，包括如下步驟：①將1體積份高度酒基與1.8-2.2體積份低度酒基混合，先25～45℃靜置24～72小時(shí)，再0～4℃靜置24～72小時(shí)，收集液相，即為初酒；②取步驟①得到的初酒，進(jìn)行高低溫交替熟化，得到成品酒。所述步驟①中，將1體積份高度酒基與2體積份低度酒基混合，先30℃靜置24小時(shí)，再0℃靜置48小時(shí)，收集液相，即為初酒。所述步驟①中，所述“收集液相”具體可為“過600目篩，收集液相”。所述步驟②中，所述高低溫交替熟化為：先25～45℃靜置24～72小時(shí)、再-13℃～-7℃靜置24～72小時(shí)，重復(fù)進(jìn)行15次以上。所述步驟②中，所述高低溫交替熟化為：先30℃靜置24小時(shí)，再-10℃靜置48小時(shí)，重復(fù)進(jìn)行15次。所述方法制備得到的蘋果酒(干柔型高類黃酮蘋果酒)也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。所述蘋果酒的度數(shù)為30％-36％，具體可為33％。所述高度酒基以高類黃酮蘋果的成熟果實(shí)為原料，制備方法依次包括如下步驟：(1)破碎打漿；(2)滅菌；(3)加入果膠酶；(4)加入釀酒酵母并進(jìn)行發(fā)酵，直至發(fā)酵體系的酒精度不再升高；(5)蒸餾并收集85-95℃之間的餾出物，然后將餾出物再次蒸餾并收集85-95℃之間的餾出物，多次，直至得到酒精度為80％以上的餾出物，即為高度酒基。所述高度酒基的制備方法中，所述高類黃酮蘋果的成熟果實(shí)為唯一原料。所述高度酒基的制備方法中，所述高類黃酮蘋果的成熟果實(shí)為清洗后的果實(shí)。所述高度酒基的制備方法中，所述高類黃酮蘋果的成熟果實(shí)為用自來水清洗后的果實(shí)。所述高度酒基的制備方法中，所述高類黃酮蘋果的成熟果實(shí)為用自來水徹底清洗去雜后的果實(shí)。所述高度酒基的制備方法的所述步驟(1)中，破碎打漿至果漿粒度為1mm以下。所述高度酒基的制備方法的所述步驟(2)中，所述滅菌的條件為：80-100℃滅菌5-12小時(shí)。所述高度酒基的制備方法的所述步驟(2)中，所述滅菌的條件具體可為：100℃、5小時(shí)。所述高度酒基的制備方法的所述步驟(3)中，當(dāng)果漿溫度為45-55℃時(shí)，加入果膠酶。所述高度酒基的制備方法的所述步驟(3)中，當(dāng)果漿自然冷卻至溫度為45-55℃時(shí)，加入果膠酶。所述高度酒基的制備方法的所述步驟(3)中，當(dāng)果漿溫度為45-50℃時(shí)，加入果膠酶。所述高度酒基的制備方法的所述步驟(3)中，當(dāng)果漿自然冷卻至溫度為45-50℃時(shí)，加入果膠酶。所述高度酒基的制備方法的所述步驟(3)中，當(dāng)果漿溫度為45℃時(shí)，加入果膠酶。所述高度酒基的制備方法的所述步驟(3)中，當(dāng)果漿自然冷卻至溫度為45℃時(shí)，加入果膠酶。所述高度酒基的制備方法的所述步驟(3)中，所述果膠酶的加入量為：每千克高類黃酮蘋果的成熟果實(shí)相應(yīng)加入100萬u以上的果膠酶。所述高度酒基的制備方法的所述步驟(3)中，所述果膠酶的加入量為：每千克鮮重的高類黃酮蘋果的成熟果實(shí)相應(yīng)加入100萬u-150萬u以上的果膠酶。所述高度酒基的制備方法的所述步驟(3)中，所述果膠酶的加入量為：每千克高類黃酮蘋果的成熟果實(shí)相應(yīng)加入100萬u-150萬u的果膠酶。所述高度酒基的制備方法的所述步驟(3)中，所述果膠酶的加入量為：每千克鮮重的高類黃酮蘋果的成熟果實(shí)相應(yīng)加入100萬u-150萬u的果膠酶。所述高度酒基的制備方法的所述步驟(3)中，所述果膠酶的加入量為：每千克高類黃酮蘋果的成熟果實(shí)相應(yīng)加入2-3g果膠酶。所述高度酒基的制備方法的所述步驟(3)中，所述果膠酶的加入量為：每千克鮮重的高類黃酮蘋果的成熟果實(shí)相應(yīng)加入2-3g果膠酶。所述高度酒基的制備方法的所述步驟(4)中，當(dāng)果漿溫度為25-35℃時(shí)，加入釀酒酵母。所述高度酒基的制備方法的所述步驟(4)中，當(dāng)果漿自然冷卻至溫度為25-35℃時(shí)，加入釀酒酵母。所述高度酒基的制備方法的所述步驟(4)中，當(dāng)果漿溫度為30℃時(shí)，加入釀酒酵母。所述高度酒基的制備方法的所述步驟(4)中，當(dāng)果漿自然冷卻至溫度為30℃時(shí)，加入釀酒酵母。所述高度酒基的制備方法的所述步驟(4)中，所述釀酒酵母的加入量為：每千克高類黃酮蘋果的成熟果實(shí)相應(yīng)加入1010cfu釀酒酵母。所述高度酒基的制備方法的所述步驟(4)中，所述釀酒酵母的加入量為：每千克鮮重的高類黃酮蘋果的成熟果實(shí)相應(yīng)加入1010cfu釀酒酵母。所述發(fā)酵的過程中，從加入釀酒酵母24小時(shí)后開始持續(xù)監(jiān)測發(fā)酵體系的溫度，控制溫度為15-20℃。所述“直至發(fā)酵體系的酒精度不再升高”時(shí)，發(fā)酵體系的酒精度為9％-12％。所述釀酒酵母具體可為高類黃酮蘋果酒酵母一號(hào)。所述高度酒基的制備方法的所述步驟(5)中，所述“直至得到酒精度為80％以上的餾出物”，具體可為得到酒精度為80％-85％的餾出物。所述高度酒基的制備方法的所述步驟(5)中，所述“直至得到酒精度為80％以上的餾出物”，具體可為得到酒精度為80％的餾出物。所述高類黃酮蘋果為每千克鮮重成熟果實(shí)的類黃酮含量為5000mg以上的蘋果種質(zhì)。所述高類黃酮蘋果為每千克鮮重成熟果實(shí)的類黃酮含量為7000mg以上的蘋果種質(zhì)。所述高類黃酮蘋果為每千克鮮重成熟果實(shí)的類黃酮含量為10000mg以上的蘋果種質(zhì)。所述高類黃酮蘋果具體可為‘csr6r6-888’、‘csr6r6-666’或‘csr6r6-777’?！甤sr6r6-888’，又稱蘋果(malusdomestica)csr6r6-888，已于2017年6月16日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心(簡稱cgmcc，地址為：北京市朝陽區(qū)北辰西路1號(hào)院3號(hào)，中國科學(xué)院微生物研究所)，保藏登記號(hào)為cgmccno.14295?！甤sr6r6-666’，又稱蘋果(malusdomestica)csr6r6-666，已于2017年2月17日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心(簡稱cgmcc，地址為：北京市朝陽區(qū)北辰西路1號(hào)院3號(hào)，中國科學(xué)院微生物研究所)，保藏登記號(hào)為cgmccno.13783?！甤sr6r6-777’，又稱蘋果(malusdomestica)csr6r6-777，已于2016年12月08日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心(簡稱cgmcc，地址為：北京市朝陽區(qū)北辰西路1號(hào)院3號(hào)，中國科學(xué)院微生物研究所)，保藏登記號(hào)為cgmccno.12468。高類黃酮蘋果酒酵母一號(hào)，全稱為酵母菌(saccharomycessp.)高類黃酮蘋果酒酵母一號(hào)，已于2017年6月16日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心(簡稱cgmcc，地址為：北京市朝陽區(qū)北辰西路1號(hào)院3號(hào)，中國科學(xué)院微生物研究所)，保藏登記號(hào)為cgmccno.14250。有效利用高類黃酮蘋果優(yōu)異種質(zhì)及高類黃酮蘋果酒加工成套設(shè)備，研制既具有蘋果特有的功能成分、果香濃郁，又具有較強(qiáng)的刺激性和白酒口感、可以滿足不同消費(fèi)人群需求的系列高類黃酮蘋果酒，對(duì)于拉長蘋果產(chǎn)業(yè)鏈、豐富酒品市場多樣性、提高企業(yè)產(chǎn)品質(zhì)量與效益、滿足市場和消費(fèi)需求具有重要意義。本發(fā)明研制的干柔型高類黃酮蘋果酒，既含有類黃酮、酚酸及礦質(zhì)元素等蘋果特有的功能保健成分，又具有較強(qiáng)的刺激性和白酒口感，酒香純正，果香濃郁，入口清醇、爽和，飲后余香，適合喝低度白酒的人群飲用，具有重大的應(yīng)用推廣價(jià)值以及龐大的市場前景。附圖說明圖1為‘csr6r6-888’干柔型高類黃酮蘋果酒的照片。圖2為‘csr6r6-888’干柔型高類黃酮蘋果酒的照片。具體實(shí)施方式以下的實(shí)施例便于更好地理解本發(fā)明，但并不限定本發(fā)明。下述實(shí)施例中的實(shí)驗(yàn)方法，如無特殊說明，均為常規(guī)方法。下述實(shí)施例中所用的試驗(yàn)材料，如無特殊說明，均為自常規(guī)生化試劑商店購買得到的。以下實(shí)施例中的定量試驗(yàn)，均設(shè)置三次重復(fù)實(shí)驗(yàn)，結(jié)果取平均值。提及‘紅富士’蘋果和‘嘎啦’蘋果的參考文獻(xiàn)：陳學(xué)森，辛培剛等，元帥和金帥在蘋果新品種選育中的作用，山東農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，1994，25(2)：236—248。0.5％鹽酸甲醇溶液的制備方法：將0.5體積份35％濃鹽酸與99.5體積份甲醇混合。實(shí)施例中所用的果膠酶均為購自寧夏和氏璧生物技術(shù)有限公司的果膠酶，相關(guān)參數(shù)為：固體粉末，酶活≥50萬u/g,建議使用條件為“ph3.2-5.0，10-50℃”。50.0℃、ph3.5條件下，1min催化果膠水解生成1μg半乳糖醛酸的酶量為一個(gè)果膠酶活力單位(1u)。實(shí)施例1、蘋果優(yōu)異種質(zhì)‘csr6r6-888’的獲得和鑒定鑒定蘋果植株為r1r1基因型、r6r6基因型還是r6r1基因型的方法如下：從待測蘋果植株上取蘋果，提取蘋果果肉的基因組dna，以基因組dna為模板，采用f3和r3組成的引物對(duì)進(jìn)行pcr擴(kuò)增，然后按如下標(biāo)準(zhǔn)判讀基因型：如果pcr擴(kuò)增產(chǎn)物為一條帶且為497bp，待測蘋果植株為r6r6基因型；如果pcr擴(kuò)增產(chǎn)物為一條帶且為386bp，待測蘋果植株為r1r1基因型；如果pcr擴(kuò)增產(chǎn)物為兩條帶且分別為497bp和386bp，待測蘋果植株為r6r1基因型。f3(序列1)：5’-ggtggtcaaagatgtgtgttgt-3’；r3(序列2)：5’-tttgcctgctacccacttca-3’。經(jīng)檢測，‘紅富士’蘋果和‘嘎啦’蘋果均為r1r1基因型。一、‘csr6r6-888’的獲得新疆紅肉蘋果作為親本，與‘紅富士’等白肉栽培蘋果品種雜交。按照孟德爾遺傳定律，新疆紅肉蘋果(r6r1基因型)與‘紅富士’(r1r1基因型)等白肉栽培蘋果品種雜交,其后代群體應(yīng)為紅肉表型(r6r1基因型):白肉表型(r1r1基因型)＝1:1。但是，在雜交f1代群體中發(fā)現(xiàn)了r6r6基因型的單株。將一株r6r6基因型的單株命名為‘csr6r6-888’。‘csr6r6-888’具有如下表型：莖、葉、花、果皮和果肉等各部分及各個(gè)發(fā)育階段均為深紫紅色?！甤sr6r6-888’的果實(shí)鮮食品質(zhì)：酸甜適口，酥脆多汁，鮮食品質(zhì)優(yōu)良。通過嫁接枝條或組培的方式，將‘csr6r6-888’擴(kuò)繁。二、‘csr6r6-888’的保藏‘csr6r6-888’，又稱蘋果(malusdomestica)csr6r6-888，已于2017年6月16日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心(簡稱cgmcc，地址為：北京市朝陽區(qū)北辰西路1號(hào)院3號(hào)，中國科學(xué)院微生物研究所)，保藏登記號(hào)為cgmccno.14295。三、‘csr6r6-666’的保藏‘csr6r6-666’是發(fā)明人所在的實(shí)驗(yàn)室前期選育出來的另一株r6r6基因型的單株?！甤sr6r6-666’具有如下表型：莖、葉、花、果皮和果肉等各部分及各個(gè)發(fā)育階段均為紫紅色?！甤sr6r6-666’，又稱蘋果(malusdomestica)csr6r6-666，已于2017年2月17日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心(簡稱cgmcc，地址為：北京市朝陽區(qū)北辰西路1號(hào)院3號(hào)，中國科學(xué)院微生物研究所)，保藏登記號(hào)為cgmccno.13783。四、‘csr6r6-777’的保藏‘csr6r6-777’是發(fā)明人所在的實(shí)驗(yàn)室前期選育出來的另一株r6r6基因型的單株?！甤sr6r6-777’，又稱蘋果(malusdomestica)csr6r6-777，已于2016年12月08日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心(簡稱cgmcc，地址為：北京市朝陽區(qū)北辰西路1號(hào)院3號(hào)，中國科學(xué)院微生物研究所)，保藏登記號(hào)為cgmccno.12468。五、類黃酮組分含量分析分別將‘csr6r6-888’、‘csr6r6-666’和‘csr6r6-777’作為待測植株。1、取待測植株上的成熟蘋果，取蘋果果肉。2、取步驟1得到的果肉，在液氮中研磨得到粉末。3、稱取2g步驟2得到的粉末，加入5ml0.5％鹽酸甲醇溶液，4℃靜置提取2h，然后8000rpm離心20min，分別收集上清液和殘?jiān)?、取步驟3得到的殘?jiān)?，加?ml0.5％鹽酸甲醇溶液，4℃靜置提取1h，然后8000rpm離心20min，收集上清液。5、將步驟3得到的上清液和步驟4得到的上清液混合，得到混合液。6、取步驟5得到的混合液，37℃旋蒸除去甲醇，殘留物用2-3ml甲醇溶解，然后8000rpm離心20min，收集上清液。7、取步驟6得到的上清液，用甲醇定容至5ml，然后用0.45μm濾膜過濾，收集濾液。8、將步驟7得到的濾液進(jìn)行hplc-ms分析。液相色譜條件：采用watersacquityuplc色譜儀，色譜柱為behc18柱(100mm×2.1mm)，填料粒徑1.7μm；柱溫45℃；進(jìn)樣體積1μl；流動(dòng)相為a液和b液的混合液，流速為0.3ml/min；a液為乙腈，b液為含0.2％(體積分?jǐn)?shù))甲酸的水溶液；0-0.1min，a液占流動(dòng)相的體積分?jǐn)?shù)為5％；0.1-20min，a液占流動(dòng)相的體積分?jǐn)?shù)由5％線性上升至20％；20-22min，a液占流動(dòng)相的體積分?jǐn)?shù)由20％線性上升至80％；22-22.1min，a液占流動(dòng)相的體積分?jǐn)?shù)由80％線性下降至5％；22.1-25min，a液占流動(dòng)相的體積分?jǐn)?shù)為5％。質(zhì)譜條件：質(zhì)譜儀為watersmaldisynaptq-tofms，esi電離源，電噴霧離子化正離子采集模式(esi+)；掃描范圍100-1500m/z；毛細(xì)管電壓3.5kv，錐孔電壓30v；源溫度100℃，脫溶溫度300℃；脫溶劑氣流量500l/h。9種特定黃酮醇物質(zhì)的含量見表1。表1中的9種特有物質(zhì)的檢測方法均屬于類黃酮組分及含量檢測方法，參考文獻(xiàn)(陳學(xué)森,張晶,劉大亮,等.新疆紅肉蘋果雜種一代的遺傳變異及功能型蘋果優(yōu)株評(píng)價(jià)[j].中國農(nóng)業(yè)科學(xué),2014,47(11):2193-2204.。表1以上結(jié)果表明，‘csr6r6-888’、‘csr6r6-666’和‘csr6r6-777’均具有很強(qiáng)的類黃酮合成能力，果肉富含類黃酮，并且含有特殊的黃酮醇類組分，為高類黃酮蘋果品種的優(yōu)異種質(zhì)?！甤sr6r6-888’優(yōu)于‘csr6r6-666’，‘csr6r6-666’優(yōu)于‘csr6r6-777’。六、類黃酮含量測定分別將‘csr6r6-888’、‘csr6r6-666’和‘csr6r6-777’作為待測植株。(1)取待測植株上的成熟蘋果果實(shí)，取蘋果果肉。(2)取1g果肉，液氮研磨，然后加入10ml4℃預(yù)冷的65％(體積百分含量)乙醇水溶液并混勻，4℃避光靜置提取4h，然后12000g離心20min，收集上清液。(3)取試管，加入0.5ml步驟(2)得到的上清液，然后依次加入1ml5g/100mlnano2水溶液、1ml10g/100mlal(no3)3水溶液、4ml2mnaoh水溶液，混勻后靜置15min，8000rpm離心10min，取上清，然后在510nm下測定吸光值。以蘆丁(rutin,sigmachemical,st,loiuis,usa)為標(biāo)樣做標(biāo)準(zhǔn)曲線?！甤sr6r6-888’的蘋果果實(shí)的類黃酮含量為11358.7mg/kg鮮重?！甤sr6r6-666’的蘋果果實(shí)的類黃酮含量為9134.6mg/kg鮮重?！甤sr6r6-777’的蘋果果實(shí)的類黃酮含量為7555.1mg/kg鮮重。實(shí)施例2、酵母菌株的獲得一、天然酵母的馴化和分離‘csr6r6-888’植株上生長的蘋果成熟時(shí)，在果園中選擇優(yōu)良的蘋果帶回?zé)o菌室，將果皮切成小塊放入已殺過菌的裝有果汁的試管中，塞好棉塞置于25～28℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)5～8d。采用平板劃線分離法分離酵母菌株，每個(gè)發(fā)酵醪液做3個(gè)平板，28℃恒溫箱中培養(yǎng)3d。對(duì)菌落進(jìn)行形態(tài)觀察,從平板上挑取分離良好、具有典型性的單菌落，分別接種于試管斜面和經(jīng)滅菌的大試管蘋果汁中，每個(gè)發(fā)酵醪液的3個(gè)平板上只挑選3個(gè)單菌落，并編號(hào)標(biāo)記,以示菌株來源。試管斜面置于28℃培養(yǎng)3d,檢查菌苔是否單純,菌苔單純的好菌株置冰箱中貯存。二、酵母篩選1、杜氏管發(fā)酵篩選。采用杜氏管發(fā)酵法，在相同的培養(yǎng)條件下，測定酵母菌株產(chǎn)氣泡的快慢及在規(guī)定時(shí)間內(nèi)產(chǎn)氣泡的多少，初步比較各株酵母菌的起酵能力和發(fā)酵能力，篩選出發(fā)酵性能優(yōu)良的酵母菌株。試驗(yàn)平行重復(fù)3次。菌株活化條件：25℃于10°brix的蘋果汁中恒溫培養(yǎng)24h。發(fā)酵條件：20℃于15°brix的蘋果汁中靜止發(fā)酵48h。2、酵母菌發(fā)酵力測試(co2失重法)。3、酵母菌凝聚性比較(酵母數(shù)比較法)。4、酵母菌的耐乙醇、耐so2試驗(yàn)。采用杜氏管發(fā)酵法,將酵母菌分別接入不同乙醇濃度(6％、8％、10％、12％,v/v)和不同so2濃度(50mg/l、100mg/l、150mg/l、200mg/l)的蘋果汁中，在相同條件下進(jìn)行培養(yǎng)，觀察杜氏管中的氣泡產(chǎn)生情況，比較各酵母菌株對(duì)乙醇、so2的耐受程度，進(jìn)一步確定適合蘋果酒釀造的菌株。試驗(yàn)平行重復(fù)3次。菌株活化條件：25℃于10°brix的蘋果汁中恒溫培養(yǎng)24h。發(fā)酵條件：20℃于15°brix的蘋果汁中靜止發(fā)酵96h(由于乙醇或so2的存在，對(duì)酵母菌的發(fā)酵在不同程度上會(huì)產(chǎn)生抑制作用，故產(chǎn)氣觀察時(shí)間延長為96h)。接種量：(6～8)×107個(gè)/ml。5、酵母菌釀制蘋果酒發(fā)酵試驗(yàn)。取500ml三角瓶,加入400ml蘋果汁(糖度20°brix)，按20ml/l的接種量接入菌濃度為(3～3.6)×106個(gè)/ml的酵母菌種子液，20℃發(fā)酵。發(fā)酵至第15d進(jìn)行倒罐，去除酒腳，再陳釀10d后，測定蘋果酒的理化指標(biāo)并進(jìn)行感官分析。通過酵母發(fā)酵力比較、凝聚力比較、耐so2、耐乙醇能力比較和對(duì)其發(fā)酵所得蘋果酒的理化指標(biāo)分析及感官品質(zhì)評(píng)價(jià)，篩選出三株最佳蘋果酒釀酒酵母，分別命名為高類黃酮蘋果酒酵母一號(hào)、高類黃酮蘋果酒酵母二號(hào)、高類黃酮蘋果酒酵母三號(hào)。三、比較步驟二得到的三株酵母菌生產(chǎn)蘋果酒的性能待測酵母分別為：高類黃酮蘋果酒酵母一號(hào)、高類黃酮蘋果酒酵母二號(hào)或高類黃酮蘋果酒酵母三號(hào)。1、取‘csr6r6-888’無腐爛的成熟果實(shí)，用自來水徹底清洗。2、完成步驟1后，取果實(shí)，進(jìn)行破碎打漿，直至果漿粒度為1mm以下。3、完成步驟2后，將果漿進(jìn)行滅菌(80℃，12小時(shí))。4、完成步驟3后，自然冷卻，當(dāng)果漿溫度為50℃時(shí)加入果膠酶(每1000g鮮重的果實(shí)，加入2-3g果膠酶)。5、完成步驟4后，繼續(xù)自然冷卻，當(dāng)果漿溫度為30℃時(shí)，加入待測酵母(每1000g鮮重的果實(shí)，加入1010cfu的待測酵母)，進(jìn)行發(fā)酵。發(fā)酵過程中持續(xù)監(jiān)測發(fā)酵體系的酒精度，當(dāng)酒精度不再升高時(shí)停止發(fā)酵(此時(shí)體系的酒精度為9％-12％)。發(fā)酵過程中，從加入待測酵母24小時(shí)后開始持續(xù)監(jiān)測發(fā)酵體系的溫度，控制溫度為15-20℃。對(duì)得到的蘋果酒進(jìn)行理化指標(biāo)分析及感官品質(zhì)評(píng)價(jià)，高類黃酮蘋果酒酵母一號(hào)的各項(xiàng)指標(biāo)最理想，可耐12％的乙醇,其發(fā)酵的原酒酒精度達(dá)11.9％，酒體澄清透明,具有蘋果酒的典型風(fēng)味。四、高類黃酮蘋果酒酵母一號(hào)的鑒定形態(tài)特征：呈橢圓球形，有明顯的細(xì)胞核和大小不等的液泡。生理生化特征：可以利用葡萄糖、麥芽糖、果糖、可溶性淀粉、蔗糖、半乳糖發(fā)酵產(chǎn)氣，可以同化葡萄糖、麥芽糖、果糖、可溶性淀粉、蔗糖、半乳糖、鼠李糖、纖維二糖、檸檬酸，不能產(chǎn)酸及類淀粉化合物，可以產(chǎn)酯香味物質(zhì)。生長特征：最適生長ph5.5-6.5,最適生長溫度29-31℃。五、高類黃酮蘋果酒酵母一號(hào)的保藏高類黃酮蘋果酒酵母一號(hào)，全稱為酵母菌(saccharomycessp.)高類黃酮蘋果酒酵母一號(hào)，已于2017年6月16日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心(簡稱cgmcc，地址為：北京市朝陽區(qū)北辰西路1號(hào)院3號(hào)，中國科學(xué)院微生物研究所)，保藏登記號(hào)為cgmccno.14250。采用高類黃酮蘋果酒酵母一號(hào)作為釀酒酵母進(jìn)行實(shí)施例3和實(shí)施例4。實(shí)施例3、高度酒基的制備分別采用‘csr6r6-888’上的蘋果、‘csr6r6-666’上的蘋果和‘csr6r6-777’上的蘋果果實(shí)制備高度酒基。1、取無腐爛的成熟蘋果果實(shí)，用自來水徹底清洗去雜。2、完成步驟1后，取果實(shí)，進(jìn)行破碎打漿，直至果漿粒度為1mm以下。3、完成步驟2后，將果漿進(jìn)行滅菌(100℃、5小時(shí)；實(shí)際應(yīng)用中可采用80-100℃滅菌5-12小時(shí)，當(dāng)溫度較低時(shí)采用較長的滅菌時(shí)間，當(dāng)溫度較高時(shí)采用較短的滅菌時(shí)間，例如當(dāng)80℃時(shí)采用10-12小時(shí)的滅菌時(shí)間，當(dāng)100℃時(shí)采用5小時(shí)的滅菌時(shí)間)。4、完成步驟3后，自然冷卻，當(dāng)果漿溫度為45℃(實(shí)際應(yīng)用中，可采用45-55℃，具體可采用45-50℃)時(shí)，加入果膠酶(每1000g鮮重的果實(shí)，加入2-3g果膠酶；2-3g果膠酶的酶活為100萬u-150萬u以上)。5、完成步驟4后，繼續(xù)自然冷卻，當(dāng)果漿溫度為30℃(實(shí)際應(yīng)用中，可采用25-35℃)時(shí)，加入釀酒酵母(每1000g鮮重的果實(shí)，加入1010cfu釀酒酵母)，進(jìn)行發(fā)酵。發(fā)酵過程中持續(xù)監(jiān)測發(fā)酵體系的酒精度，當(dāng)酒精度不再升高時(shí)停止發(fā)酵(此時(shí)體系的酒精度為9％-12％)。發(fā)酵過程中，從加入釀酒酵母24小時(shí)后開始持續(xù)監(jiān)測發(fā)酵體系的溫度，控制溫度為15-20℃。6、完成步驟5后，進(jìn)行蒸餾，收集85-95℃之間的餾出物。該餾出物的酒精度約為20％。7、取步驟6得到的餾出物，進(jìn)行多次蒸餾，每次均收集收集85-95℃之間的餾出物，直至得到酒精度為80％以上的餾出物，即為高度酒基?！甤sr6r6-888’得到的高度酒基命名為‘csr6r6-888’高度酒基。本實(shí)施例得到的‘csr6r6-888’高度酒基的酒精度為80％。‘csr6r6-666’得到的高度酒基命名為‘csr6r6-666’高度酒基。本實(shí)施例得到的‘csr6r6-666’高度酒基的酒精度為80％?！甤sr6r6-777’得到的高度酒基命名為‘csr6r6-777’高度酒基。本實(shí)施例得到的‘csr6r6-777’高度酒基的酒精度為80％。實(shí)施例4、低度酒基的制備分別采用‘csr6r6-888’上的蘋果、‘csr6r6-666’上的蘋果和‘csr6r6-777’上的蘋果果實(shí)制備低度酒基。1、取無腐爛的成熟蘋果果實(shí)，用自來水徹底清洗去雜。2、完成步驟1后，取果實(shí)，進(jìn)行破碎打漿，直至果漿粒度為1mm以下。3、完成步驟2后，將果漿進(jìn)行滅菌(100℃、5小時(shí)；實(shí)際應(yīng)用中可采用80-100℃滅菌5-12小時(shí)，當(dāng)溫度較低時(shí)采用較長的滅菌時(shí)間，當(dāng)溫度較高時(shí)采用較短的滅菌時(shí)間，例如當(dāng)80℃時(shí)采用10-12小時(shí)的滅菌時(shí)間，當(dāng)100℃時(shí)采用5小時(shí)的滅菌時(shí)間)。4、完成步驟3后，自然冷卻，當(dāng)果漿溫度為45℃(實(shí)際應(yīng)用中，可采用45-55℃，具體可采用45-50℃)時(shí)，加入果膠酶(每1000g鮮重的果實(shí)，加入2-3g果膠酶；2-3g果膠酶的酶活為100萬u-150萬u以上)。5、完成步驟4后，繼續(xù)自然冷卻，當(dāng)果漿溫度為30℃(實(shí)際應(yīng)用中，可采用25-35℃)時(shí)，加入釀酒酵母(每1000g鮮重的果實(shí)，加入1010cfu釀酒酵母)，進(jìn)行發(fā)酵。發(fā)酵過程中持續(xù)監(jiān)測發(fā)酵體系的酒精度，當(dāng)酒精度不再升高時(shí)停止發(fā)酵(此時(shí)體系的酒精度為9％-12％)。發(fā)酵過程中，從加入釀酒酵母24小時(shí)后開始持續(xù)監(jiān)測發(fā)酵體系的溫度，控制溫度為15-20℃。6、完成步驟5后，過600目篩，收集液相，即為低度酒基。‘csr6r6-888’得到的低度酒基命名為‘csr6r6-888’低度酒基。本實(shí)施例得到的‘csr6r6-888’低度酒基的酒精度為10％。‘csr6r6-666’得到的低度酒基命名為‘csr6r6-666’低度酒基。本實(shí)施例得到的‘csr6r6-666’低度酒基的酒精度為10％。‘csr6r6-777’得到的低度酒基命名為‘csr6r6-777’低度酒基。本實(shí)施例得到的‘csr6r6-777’低度酒基的酒精度為10％。實(shí)施例5、干柔型高類黃酮蘋果酒的制備1、將1體積份高度酒基與2體積份低度酒基混合，先30℃靜置24小時(shí)，再0℃靜置48小時(shí)，然后過600目篩，收集液相，即為初酒。實(shí)際應(yīng)用中，可先25至45℃靜置24至72小時(shí)，再0至4℃靜置24至72小時(shí)。2、取步驟1得到的初酒，進(jìn)行高低溫交替熟化(先30℃靜置24小時(shí)，再-10℃靜置48小時(shí)，重復(fù)進(jìn)行15次)，得到成品酒。實(shí)際應(yīng)用中，可先25至45℃靜置24至72小時(shí)、再-13℃至-7℃靜置24至72小時(shí)，重復(fù)進(jìn)行15次以上。采用實(shí)施例3制備的‘csr6r6-888’高度酒基和實(shí)施例4制備的‘csr6r6-888’低度酒基制備得到的成品酒命名為‘csr6r6-888’干柔型高類黃酮蘋果酒?！甤sr6r6-888’干柔型高類黃酮蘋果酒的照片見圖1和圖2。采用實(shí)施例3制備的‘csr6r6-666’高度酒基和實(shí)施例4制備的‘csr6r6-666’低度酒基制備得到的成品酒命名為‘csr6r6-666’干柔型高類黃酮蘋果酒。采用實(shí)施例3制備的‘csr6r6-777’高度酒基和實(shí)施例4制備的‘csr6r6-777’低度酒基制備得到的成品酒命名為‘csr6r6-777’干柔型高類黃酮蘋果酒。實(shí)施例6、酒精度檢測和感官描述取實(shí)施例5制備的三種干柔型高類黃酮蘋果酒，檢測酒精度和感官指標(biāo)。結(jié)果見表2。酒精度為33％的干柔型高類黃酮蘋果酒，外觀為橙紅色、澄清透明，酒香純正、果香濃郁，入口清醇、爽和，飲后余香。表2實(shí)施例7、食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)相關(guān)指標(biāo)檢測取實(shí)施例5制備的三種干柔型高類黃酮蘋果酒，根據(jù)食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)gb2757-2012和gb2760-2014檢測甲醇和重金屬含量。結(jié)果表明，實(shí)施例5制備的三種干柔型高類黃酮蘋果酒中的甲醇含量符合食品安全指標(biāo)的國家標(biāo)準(zhǔn)，實(shí)施例5制備的三種干柔型高類黃酮蘋果酒中的鋁、錳等重金屬含量均符合食品安全指標(biāo)的國家標(biāo)準(zhǔn)。實(shí)施例8、營養(yǎng)保健成分檢測以山東泰安酒廠生產(chǎn)的38°泰山特曲白酒為對(duì)照。分別檢測實(shí)施例5制備的三種干柔型高類黃酮蘋果酒和對(duì)照酒的類黃酮含量、酚酸含量和礦質(zhì)元素含量。一、提取1、取20ml待測酒，用1mol/lnaoh調(diào)ph值至7，用乙酸乙酯萃取3次(每次加入20ml乙酸乙酯，充分混合后靜置分層，然后收集有機(jī)相),將三次萃取收集的有機(jī)相混合，然后40℃旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)溶劑，此時(shí)得到的殘留物即為類黃酮(中性酚)，加入2ml甲醇溶解殘留物，然后用0.22μm濾膜過濾，然后進(jìn)行hplc測定。2、取步驟1中3次萃取后剩余的酒液，用2mol/lhcl調(diào)ph值至2，用乙酸乙酯萃取3次(每次加入20ml乙酸乙酯，充分混合后靜置分層，然后收集有機(jī)相),將三次萃取收集的有機(jī)相混合，然后40℃旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)溶劑，此時(shí)得到的殘留物即為酚酸(酸性酚)，加入2ml甲醇溶解殘留物，然后用0.22μm濾膜過濾，然后進(jìn)行hplc測定。二、hplc檢測1、hplc檢測類黃酮的相關(guān)參數(shù)高效液相色譜裝置型號(hào)為2695(waters，milford，ma，usa)，二極管陣列檢測器(pda2998waters，milford，ma，usa)，季泵和自動(dòng)采樣器；分離柱為對(duì)稱c18(4.6×150毫米，3.5μm)柱(waters，milford，ma，usa)，柱溫20℃。進(jìn)樣量為10μl。流動(dòng)相由溶劑a(含體積比為2.5％的乙酸的水溶液)和溶劑b(乙腈)組成，或者，流動(dòng)相為溶劑b。洗脫過程(流速1ml/min)：0-5min，溶劑b占流動(dòng)相的體積分?jǐn)?shù)由3％線性上升至9％；6-15min，溶劑b占流動(dòng)相的體積分?jǐn)?shù)由9％線性上升至16％；16-33min，溶劑b占流動(dòng)相的體積分?jǐn)?shù)由16％線性上升至36.4％；34-38min溶劑b占流動(dòng)相的體積分?jǐn)?shù)保持100％；最后柱子修復(fù)10分鐘(溶劑b占流動(dòng)相的體積分?jǐn)?shù)為3％)。黃烷醇和二氫查爾酮的檢測波長為280nm，黃酮醇的檢測波長為360nm。黃烷醇包括兒茶素、表兒茶素、原花青素b2。二氫查耳酮包括根皮苷。黃酮醇包括山奈酚、蘆丁、異槲皮苷(槲皮素-3-葡萄糖苷)、番石榴苷(槲皮素-3-o-α-l-吡喃阿拉伯糖苷)、金絲桃苷(槲皮素-3-o-β-d-吡喃半乳糖苷)、槲皮素鼠李糖苷。兒茶素標(biāo)準(zhǔn)品的出峰時(shí)間為12.52min。表兒茶素標(biāo)準(zhǔn)品的出峰時(shí)間為16.06min。原花青素b2標(biāo)準(zhǔn)品的出峰時(shí)間為13.83min。根皮苷標(biāo)準(zhǔn)品的出峰時(shí)間為27.76min。山奈酚標(biāo)準(zhǔn)品的出峰時(shí)間為36.86min。蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品的出峰時(shí)間為21.37min。異槲皮苷標(biāo)準(zhǔn)品的出峰時(shí)間為23.25min。番石榴苷標(biāo)準(zhǔn)品的出峰時(shí)間為24.39min。金絲桃苷標(biāo)準(zhǔn)品的出峰時(shí)間為22.64min。槲皮素鼠李糖苷標(biāo)準(zhǔn)品的出峰時(shí)間為25.35min。以上標(biāo)準(zhǔn)品均購自sigma-aldrichco。2、hplc檢測酚酸的相關(guān)參數(shù)高效液相色譜裝置型號(hào)為2695(waters，milford，ma，usa)，二極管陣列檢測器(pda2998waters，milford，ma，usa)，季泵和自動(dòng)采樣器；分離柱為對(duì)稱c18(4.6×150毫米，3.5μm)柱(waters，milford，ma，usa)，柱溫30℃。進(jìn)樣量為10μl。流動(dòng)相由乙腈和0.6％(體積比)乙酸水溶液組成。洗脫過程(流速0.5ml/min)：0-35min，乙腈占流動(dòng)相的體積分?jǐn)?shù)由5％線性上升至35％；36-40min，乙腈占流動(dòng)相的體積分?jǐn)?shù)保持35％；41-42min，乙腈占流動(dòng)相的體積分?jǐn)?shù)由35％線性下降至5％。檢測波長280nm。沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)品的出峰時(shí)間為6.51min。對(duì)羥基苯甲酸標(biāo)準(zhǔn)品的出峰時(shí)間為15.33min。兒茶酸標(biāo)準(zhǔn)品的出峰時(shí)間為15.55min。綠原酸標(biāo)準(zhǔn)品的出峰時(shí)間為15.60min。咖啡酸標(biāo)準(zhǔn)品的出峰時(shí)間為17.29min。丁香酸標(biāo)準(zhǔn)品的出峰時(shí)間為17.3min。香蘭素標(biāo)準(zhǔn)品的出峰時(shí)間為21.66min。香豆酸標(biāo)準(zhǔn)品的出峰時(shí)間為22.35min。阿魏酸標(biāo)準(zhǔn)品的出峰時(shí)間為24.09min。苯甲酸標(biāo)準(zhǔn)品的出峰時(shí)間為28.35min。香豆素標(biāo)準(zhǔn)品的出峰時(shí)間為30.69min。肉桂酸標(biāo)準(zhǔn)品的出峰時(shí)間為37.21min。根皮素標(biāo)準(zhǔn)品的出峰時(shí)間為38.49min。以上標(biāo)準(zhǔn)品均購自sigma-aldrichco。三、礦質(zhì)元素檢測儀器：電感藕合等離子質(zhì)譜(icp-ms，美國thermofisherscientific公司)；wx-8000微波消解儀(上海屹堯儀器科技發(fā)展有限公司)；duraseries超純水處理系統(tǒng)；儀器的工作參數(shù)見表3。表3項(xiàng)目參數(shù)項(xiàng)目參數(shù)射頻功率(w)1050模擬電壓(v)-1900霧化氣流量(l/min)0.86脈沖電壓(v)900樣品提升速率(l/min)1.2數(shù)據(jù)采集模式跳峰離子透鏡電壓(v)8.25駐留時(shí)間(ms)50冷卻氣流量(l/min)13.8每質(zhì)量數(shù)采集數(shù)據(jù)點(diǎn)3載氣流量(l/min)0.98積分時(shí)間(ms)500各個(gè)單元素標(biāo)準(zhǔn)溶液(國家有色金屬及電子材料分析測試中心，1000μg/ml)。標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制(采用5％hno3水溶液為溶劑)：吸取單元素標(biāo)準(zhǔn)溶液，稀釋為20mg/l的儲(chǔ)備液，再稀釋為200μg/l、400μg/l的儲(chǔ)備液，再依次配制得到8μg/l、16μg/l、24μg/l、32μg/l、48μg/l、64μg/l的系列標(biāo)準(zhǔn)溶液，搖勻待用。采用5％hno3水溶液作為0濃度標(biāo)注溶液。將標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行質(zhì)譜檢測，制作標(biāo)準(zhǔn)曲線。稱取0.2-1g待測酒樣品至聚四氟乙烯消解罐中(精確至0.1mg)，加入5ml濃硝酸(濃硝酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)約為68％)，然后將消解罐放入微波消解儀中，消解程序見表4。然后自然冷卻，待溫度冷卻至50℃以下后，取出消解罐放入通風(fēng)櫥中，打開消解罐，用超純水潤洗，然后將消解罐中的液相轉(zhuǎn)移至50ml容量瓶中，用超純水稀釋定容至刻度，然后進(jìn)行質(zhì)譜檢測。對(duì)照標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算待測酒樣品中各個(gè)單元素的含量。表4步驟溫度(℃)保溫時(shí)間(min)11003214033160341803519015四、結(jié)果三種干柔型高類黃酮蘋果酒以及對(duì)照酒中的類黃酮組分含量見表5。三種干柔型高類黃酮蘋果酒以及對(duì)照酒中的酚酸組分含量見表6。三種干柔型高類黃酮蘋果酒以及對(duì)照酒中的礦質(zhì)元素含量見表7。以高類黃酮優(yōu)異種質(zhì)csr6r6-666、csr6r6-777和csr6r6-888的成熟蘋果果實(shí)為原料制成的3種干柔型高類黃酮蘋果酒的類黃酮組分含量、酚酸組分含量及礦質(zhì)元素含量均顯著高于相似度數(shù)的對(duì)照酒，其中csr6r6-888的成熟蘋果果實(shí)為原料制成的干柔型高類黃酮蘋果酒中類黃酮組分含量、酚酸組分含量及礦質(zhì)元素含量最高。表5類黃酮組分含量表6酚酸組分含量表7礦質(zhì)元素含量sequencelisting<110>山東農(nóng)業(yè)大學(xué)<120>干柔型高類黃酮蘋果酒及其制備方法<130>gncyx171210<160>2<170>patentinversion3.5<210>1<211>22<212>dna<213>人工序列<400>1ggtggtcaaagatgtgtgttgt22<210>2<211>20<212>dna<213>人工序列<400>2tttgcctgctacccacttca20當(dāng)前第1頁12