本發(fā)明屬醫(yī)用相關(guān)材料領(lǐng)域，更具體地說，本發(fā)明涉及一種用于吸附患者體內(nèi)過量的炎癥因子的炎癥因子大孔吸附劑及其制備方法。

背景技術(shù)：

細(xì)胞因子(cytokines，kc)是一大類能在細(xì)胞間傳遞信息、具有免疫調(diào)節(jié)和效應(yīng)功能的蛋白質(zhì)或小分子多肽。細(xì)胞因子來源廣泛，靶細(xì)胞眾多，生物活性復(fù)雜。細(xì)胞因子一般是分子量為6～60kd的多肽或糖蛋白，其成熟分泌型分子所含氨基酸多在200個(gè)以內(nèi)。

炎性細(xì)胞因子是一系列可以引發(fā)炎癥的細(xì)胞因子的總稱，分為促炎因子和抗炎因子。比較常見的促炎因子包括il-1，il-6，il-8，tnf，抗炎因子包括il-4，il-10，il-13。

所有損傷到一定程度(包括外科和內(nèi)科情況，如嚴(yán)重創(chuàng)傷、嚴(yán)重代謝障礙、大手術(shù)后、重癥感染、中毒等)，都可觸發(fā)大量炎性介質(zhì)和細(xì)胞因子產(chǎn)生和釋放，進(jìn)而引發(fā)全身炎癥瀑布反應(yīng)，它們的過度分泌會(huì)導(dǎo)致人體內(nèi)促炎因子和抗炎因子水平失衡，從而造成遠(yuǎn)處器官功能障礙。無論有無細(xì)菌感染，臨床表現(xiàn)和演變都驚人的一致，均可出現(xiàn)sirs(systemicinflammatoryresponsesyndrome，sirs)，嚴(yán)重時(shí)可發(fā)展為膿毒癥、膿毒癥休克以及多器官功能障礙綜合征(mods)，甚至死亡。因而，對(duì)炎癥因子的清除，降低患者體內(nèi)炎癥因子水平顯得尤為重要。

血液凈化作為去除人體致病因子的一種有效方法，主要包括血漿置換，血液濾過，血液透析，血液灌流等。血漿置換需要大量新鮮血漿，來源有限，存在交叉感染的風(fēng)險(xiǎn)，血液濾過和血液透析都只能清除體內(nèi)中小分子毒素，不能有效清除中大分子的炎癥因子。血液灌流主要利用吸附劑吸附原理，能有效清除體內(nèi)中大分子毒素，是近年來發(fā)展起來的一種新型血液凈化治療方式。

聚苯乙烯-二乙烯苯大孔吸附劑是常用的血液凈化吸附劑，它由苯乙烯、二乙烯苯在致孔劑和引發(fā)劑作用下經(jīng)自由基聚合得到具有孔結(jié)構(gòu)、交聯(lián)網(wǎng)狀的聚合體。其主要通過范德華引力、氫鍵和自身的孔結(jié)構(gòu)進(jìn)行吸附。

目前國(guó)內(nèi)外均有吸附炎癥因子吸附產(chǎn)品。美國(guó)的cytosorb灌流器是使用聚乙烯吡咯烷酮包被的聚乙烯二乙烯苯聚合物顆粒，有著良好的生物相容性和血液相容性，無毒無免疫原性。對(duì)血液中分子量為5-60kd的中大分子有良好的吸附效果，包括炎性細(xì)胞因子il-6，il-1β，il-8，il-10，tnf-a等有非常高的吸附率，但進(jìn)口產(chǎn)品價(jià)格昂貴。在國(guó)內(nèi)雖也有用于血液灌流吸附炎癥因子的產(chǎn)品，但有報(bào)道臨床研究對(duì)炎癥因子清除率不高，治療效果一般。

因此，研究新型的炎癥因子選擇性吸附劑，解決目前吸附劑對(duì)炎癥因子的吸附性能低，血液相容性差，包膜材料易脫落，進(jìn)口炎癥因子吸附產(chǎn)品價(jià)格昂貴等問題，對(duì)改善患者生活質(zhì)量，挽救重癥患者生命，有著重要的社會(huì)價(jià)值和經(jīng)濟(jì)價(jià)值。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于：克服現(xiàn)有技術(shù)中炎癥因子吸附劑存在的吸附性能低、血液相容性差、價(jià)格高昂等問題，提供一種吸附性能和血液相容性皆佳且價(jià)格合理的炎癥因子大孔吸附劑及其制備方法。

為了實(shí)現(xiàn)上述發(fā)明目的，本發(fā)明提供了一種炎癥因子大孔吸附劑的制備方法，其是以苯乙烯作為單體，二乙烯苯作為交聯(lián)劑，甲苯和正庚烷的混合溶劑作為致孔劑，油溶性過氧化物作為引發(fā)劑，經(jīng)懸浮聚合制備得到多孔微球，經(jīng)雙鍵環(huán)氧化、胺化后，利用葡萄糖酸對(duì)胺化的多孔微球表面進(jìn)行改性接枝，得到炎癥因子大孔吸附劑。

具體地，所述制備方法包括如下步驟：

(1)以苯乙烯作為單體，二乙烯苯作為交聯(lián)劑，甲苯和正庚烷的混合溶劑作為致孔劑，油溶性過氧化物作為引發(fā)劑，將單體、交聯(lián)劑、致孔劑和引發(fā)劑懸浮混合，得到多孔微球；

(2)采用二氯乙烷對(duì)步驟(1)所述多孔微球進(jìn)行溶脹，然后加入間氯過氧苯甲酸反應(yīng)、沖洗，得到環(huán)氧化樹脂；

(3)采用無水乙醇對(duì)步驟(2)所述環(huán)氧化樹脂進(jìn)行溶脹后，濾出環(huán)氧化樹脂，加入二氧六環(huán)溶劑和胺化試劑反應(yīng)、洗滌、干燥，得到胺化樹脂；

(4)依次將葡萄糖酸溶液、n-羥基琥珀酰亞胺和1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽加入到步驟(3)所述胺化樹脂中反應(yīng)、洗滌，得到炎癥因子大孔吸附劑。

作為本發(fā)明炎癥因子大孔吸附劑的制備方法的一種改進(jìn)，步驟(1)中，所述甲苯和正庚烷的混合溶劑中，甲苯和正庚烷的體積比為1:5～5:1；所述油溶性過氧化物選自過氧化二苯甲酰、過氧化二碳酸二異丙酯、過氧化苯甲酰叔丁酯或過氧化甲乙酮。

作為本發(fā)明炎癥因子大孔吸附劑的制備方法的一種改進(jìn)，步驟(2)中，所述反應(yīng)是冰水浴條件下機(jī)械攪拌反應(yīng)24h；所述沖洗是使用無水乙醇沖洗。

作為本發(fā)明炎癥因子大孔吸附劑的制備方法的一種改進(jìn)，步驟(3)中，所述胺化試劑選自乙二胺、己二胺、二乙烯三胺、三乙烯四胺和四乙烯五胺中的一種或幾種；所述反應(yīng)是在65℃下機(jī)械攪拌反應(yīng)24h；所述洗滌是用蒸餾水和無水乙醇洗滌；所述干燥是真空條件下50℃干燥24h。

作為本發(fā)明炎癥因子大孔吸附劑的制備方法的一種改進(jìn)，步驟(4)中，所述葡萄糖酸的加入量為0.1～5wt％；所述葡萄糖酸溶液、n-羥基琥珀酰亞胺和1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽的加入量為常規(guī)加入量；所述反應(yīng)是室溫震蕩反應(yīng)4h；所述洗滌是用蒸餾水和無水乙醇洗滌。

更優(yōu)選地，所述葡萄糖酸的加入量為1～4wt％。

為了實(shí)現(xiàn)上述發(fā)明目的，本發(fā)明還提供了一種炎癥因子大孔吸附劑，其是由上述制備方法制備而得。

作為本發(fā)明炎癥因子大孔吸附劑的一種改進(jìn)，所述炎癥因子大孔吸附劑的孔徑為5～60nm，比表面積為500～1200m²/g。

相對(duì)于現(xiàn)有技術(shù)，本發(fā)明具有如下優(yōu)點(diǎn)：

(1)本發(fā)明炎癥因子大孔吸附劑具有豐富的孔結(jié)構(gòu)和較大的比表面積，可有效吸附炎癥因子；

(2)本發(fā)明炎癥因子大孔吸附劑的制備過程中，首次使用葡萄糖酸對(duì)微球進(jìn)行接枝改性，利用葡萄糖酸多羥基的特性，使血液中的致病因子從接枝的外圍更容易遷移到微球的表層甚至微孔中，大大增加了炎癥因子大孔吸附劑的吸附性能，進(jìn)而提高其親水性和對(duì)人體作用的安全性，并改善了其血液相容性；

(3)本發(fā)明炎癥因子大孔吸附劑的制備過程中，通過胺化樹脂的氨基與葡萄糖酸的羧基脫水縮合形成酰胺鍵，根據(jù)相似相容原理，可提高炎癥因子大孔吸附劑對(duì)炎癥因子的選擇吸附性；

(4)本發(fā)明炎癥因子大孔吸附劑的制備方法簡(jiǎn)單易行，相對(duì)于同類進(jìn)口產(chǎn)品的生產(chǎn)成本大大降低，適合產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)，具有良好的社會(huì)價(jià)值和經(jīng)濟(jì)價(jià)值。

附圖說明

圖1為本發(fā)明實(shí)施例8中，不同條件制備的炎癥因子大孔吸附劑在pbs緩沖液中對(duì)il-6的吸附率數(shù)據(jù)圖。

圖2為本發(fā)明實(shí)施例9中，不同條件制備的炎癥因子大孔吸附劑在血漿中對(duì)il-6的吸附率數(shù)據(jù)圖。

具體實(shí)施方式

為了使本發(fā)明的目的、技術(shù)方案和有益技術(shù)效果更加清晰，以下結(jié)合實(shí)施例，對(duì)本發(fā)明進(jìn)行進(jìn)一步詳細(xì)說明。應(yīng)當(dāng)理解的是，本說明書中描述的實(shí)施例僅僅是為了解釋本發(fā)明，并非為了限定本發(fā)明，實(shí)施例的參數(shù)、比例等可因地制宜做出選擇而對(duì)結(jié)果并無實(shí)質(zhì)性影響。

實(shí)施例1炎癥因子大孔吸附劑的制備

(1)多孔微球合成：稱取5g二乙烯苯和95g苯乙烯(理論交聯(lián)度為5％)置于500ml錐形瓶中，加入0.8g過氧化二苯甲酰，充分混勻后再加入0.5ml甲苯和1ml正庚烷，再充分混勻。將混合液轉(zhuǎn)移至500ml的三口燒瓶中，通冷凝水，控制攪拌速度在100rpm左右，待升溫至50℃后，控制升溫速度為1-2℃/5min，升溫至80℃后反應(yīng)3h，再以1-2℃/5min的升溫速度緩慢升溫至90℃后，再反應(yīng)1h。反應(yīng)停止后用大量乙醇沖洗，再用純化水反復(fù)沖洗。選取粒度在300-800μm的微球，于60℃干燥過夜，得到通透性好，孔徑均一的聚苯乙烯白球。

(2)環(huán)氧化改性：稱取30g聚苯乙烯白球，加入到1l的三口燒瓶中，加入二氯乙烷充分溶脹，加入21g間氯過氧苯甲酸，冰水浴機(jī)械攪拌反應(yīng)24h。將所得樹脂用無水乙醇提取至流出的無水乙醇與純無水乙醇的折射率相同后，晾干，真空60℃干燥過夜，得到環(huán)氧化樹脂。

(3)胺化改性：稱取20g環(huán)氧化樹脂用無水乙醇進(jìn)行充分溶脹，濾出環(huán)氧化樹脂，加入20ml二氧六環(huán)溶劑和20ml乙二胺，65℃機(jī)械攪拌反應(yīng)24h，用蒸餾水和無水乙醇洗滌后，真空60℃干燥24h，得到環(huán)氧化改性的白球。

(4)接枝改性：稱取10g環(huán)氧化改性的白球，用無水乙醇充分溶脹后，將白球?yàn)V出，加入到100ml三口燒瓶中，依次加入20ml、1wt％葡萄糖酸溶液，0.5gn-羥基琥珀酰亞胺(nhs)和0.4g1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽(edc)，于室溫下震蕩反應(yīng)4h，用無水乙醇和純化水反復(fù)洗滌后，真空60℃干燥過夜。

制得的炎癥因子大孔吸附劑參數(shù)如下：比表面積730.50cm²/g，總孔容1.35ml/g，總孔平均孔徑14.86nm，大孔孔容：0.06ml/g，大孔平均孔徑30.64nm，中孔平均孔容：1.39ml/g，中孔平均孔徑15.34nm。

實(shí)施例2炎癥因子大孔吸附劑的制備

方法與步驟與實(shí)施例1基本相同，不同之處在于：將二乙烯苯和苯乙烯的加入量分別調(diào)整為6g和94g(理論交聯(lián)度為6％)，所制備的炎癥因子大孔吸附劑參數(shù)如下：比表面積1155.49cm²/g,總孔容1.33ml/g，總孔平均孔徑8.28nm，大孔孔容：0.26ml/g，大孔平均孔徑26.42nm，中孔平均孔容：0.9ml/g，中孔平均孔徑13.12nm。

實(shí)施例3炎癥因子大孔吸附劑的制備

方法與步驟與實(shí)施例1基本相同，不同之處在于：將二乙烯苯和苯乙烯的加入量分別調(diào)整為20g和80g(理論交聯(lián)度為20％)。所制備的炎癥因子大孔吸附劑參數(shù)如下：比表面積734.30m²/g,總孔容1.72ml/g，總孔平均孔徑15.3nm，大孔孔容：0.08ml/g，大孔平均孔徑30.2nm，中孔平均孔容：1.41ml/g,中孔平均孔徑15.60nm。

實(shí)施例4炎癥因子大孔吸附劑的制備

方法與步驟與實(shí)施例1基本相同，不同之處在于：將致孔劑甲苯和正庚烷的加入量分別調(diào)整為2.5ml和0.5ml。所制備的炎癥因子大孔吸附劑參數(shù)如下：比表面積1017.88cm²/g,總孔容2.07ml/g，總孔平均孔徑15.88nm，大孔孔容：0.02ml/g，大孔平均孔徑32.60nm，中孔平均孔容：2.06ml/g,中孔平均孔徑16.57nm。

實(shí)施例5炎癥因子大孔吸附劑的制備

方法與步驟與實(shí)施例1基本相同，不同之處在于：將致孔劑甲苯和正庚烷的加入量分別調(diào)整為1ml和1ml。所制備的炎癥因子大孔吸附劑參數(shù)如下：比表面積774.77cm²/g，總孔容1.85ml/g，總孔平均孔徑19.40nm，大孔孔容：0.001ml/g，大孔平均孔徑40.22nm，中孔平均孔容：1.54ml/g，中孔平均孔徑21.35nm。

實(shí)施例6炎癥因子大孔吸附劑的制備

方法與步驟與實(shí)施例1基本相同，不同之處在于：將葡萄糖酸的加入量調(diào)整為20ml2％的葡萄糖酸溶液。所制備的炎癥因子大孔吸附劑參數(shù)如下：比表面積311.30cm²/g，總孔容0.49ml/g，總孔平均孔徑8.67nm，大孔孔容：0.003ml/g，大孔平均孔徑16.83nm，中孔平均孔容：0.46ml/g，中孔平均孔徑8.46nm。但球形不是很好，發(fā)生部分粘連。

實(shí)施例7炎癥因子大孔吸附劑的制備

方法與步驟與實(shí)施例1基本相同，不同之處在于：將葡萄糖酸的加入量調(diào)整為20ml4％的葡萄糖酸溶液。所制備的聚合物球參數(shù)如下：比表面積311.30cm²/g，總孔容0.49ml/g，總孔平均孔徑8.67nm，大孔孔容：0.003ml/g，大孔平均孔徑16.83nm，中孔平均孔容：0.46ml/g，中孔平均孔徑8.46nm。

實(shí)施例8本發(fā)明炎癥因子大孔吸附劑對(duì)白介素-6(il-6)的吸附試驗(yàn)

對(duì)實(shí)施例1～7所合成的炎癥因子大孔吸附劑進(jìn)行pbs緩沖液中il-6吸附試驗(yàn)，并做出評(píng)價(jià)：

(1)吸附劑預(yù)處理：分別稱取實(shí)施例1～7所合成的炎癥因子大孔吸附劑，吸附前再用乙醇沖洗吸附劑至沖洗液澄清，再后用反滲水沖洗至中性，干燥待用；

(2)吸附試驗(yàn)：分別稱取1g干燥后的吸附劑置于干凈的錐形瓶中，按照實(shí)施例1～7樣品依次編號(hào)為kc01，kc02，kc03，kc04，kc05，kc06和kc07。然后分別加入20mlil-6濃度為600pg/ml的pbs溶液，于37℃，180rpm的條件下吸附2小時(shí)，分別應(yīng)用elisa法(elisa試劑盒：美國(guó)bd公司購(gòu)買)測(cè)得吸附前后il-6的濃度，根據(jù)公式a＝(c1-c2)/c1*100％計(jì)算il-6的吸附率，其中a為吸附率(％)，c1和c2為吸附前后il-6的濃度(pg/ml)。結(jié)果如圖1所示。由圖1可以看出，實(shí)施例5所制備的炎癥因子大孔吸附劑kc05對(duì)pbs緩沖液中的il-6吸附率最優(yōu)，高達(dá)99.29％，其次是kc01，吸附率為93.74％。

實(shí)施例9本發(fā)明炎癥因子大孔吸附劑對(duì)白介素-6(il-6)的吸附試驗(yàn)

試驗(yàn)方法與步驟基本與實(shí)施例8相同，不同之處在于：采用新鮮血漿配制成il-6濃度為600pg/ml的血漿溶液，分別加入20ml于各錐形瓶中。所測(cè)結(jié)果如圖2所示。由圖2可以看出，實(shí)施例5所制備的炎癥因子大孔吸附劑kc05對(duì)血漿中的il-6吸附率最優(yōu)，高達(dá)96.39％，其次是kc01，吸附率為88.47％。

實(shí)施例10溶血試驗(yàn)

根據(jù)gb/t16886.4-2003《醫(yī)療器械生物學(xué)評(píng)價(jià)第4部分與血液作用相互試驗(yàn)選擇》、gb/t16175-2008《醫(yī)用有機(jī)硅材料生物學(xué)評(píng)價(jià)試驗(yàn)方法》，對(duì)各實(shí)施例中所制備的吸附劑進(jìn)行溶血率測(cè)試。

取吸附劑kc05每管加入5g，再加入氯化鈉注射液10ml；陰性對(duì)照組每管加入氯化鈉注射液10ml；陽性對(duì)照組每管加入蒸餾水10ml。平行做3組。將所有試管37℃恒溫水浴30min后，每管加入0.2ml稀釋兔血，輕輕混勻，37℃恒溫水浴60min。倒出管內(nèi)液體以800g離心5min。吸取上清液用分光光度計(jì)在545nm波長(zhǎng)處測(cè)得吸光度。樣品組合對(duì)照組吸光度均取3組的平均值。陰性對(duì)照管的吸光度應(yīng)不大于0.03，陽性對(duì)照管的吸光度應(yīng)為0.8±0.3，否則應(yīng)重新試驗(yàn)。

試驗(yàn)結(jié)果：kc05的溶血率小于1％，符合國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)要求的低于5％。

根據(jù)上述說明書的揭示和教導(dǎo)，本發(fā)明所屬領(lǐng)域的技術(shù)人員還可以對(duì)上述實(shí)施方式進(jìn)行適當(dāng)?shù)淖兏托薷?。因此，本發(fā)明并不局限于上面揭示和描述的具體實(shí)施方式，對(duì)本發(fā)明的一些修改和變更也應(yīng)當(dāng)落入本發(fā)明的權(quán)利要求的保護(hù)范圍內(nèi)。此外，盡管本說明書中使用了一些特定的術(shù)語，但這些術(shù)語只是為了方便說明，并不對(duì)本發(fā)明構(gòu)成任何限制。