本發(fā)明涉及作為磷脂氫谷胱甘肽過氧化物酶激活劑的一系列化合物，以及這些化合物在治療和預(yù)防各種炎癥、氧化損傷、神經(jīng)退行性病變、及鐵死亡相關(guān)疾病的藥物中的應(yīng)用。

背景技術(shù)：

磷脂氫谷胱甘肽過氧化物酶(gpx4，或phgpx)能還原細(xì)胞內(nèi)的各種活性氧物種(ros)，是最主要的保護(hù)細(xì)胞膜免受脂質(zhì)過氧化物損傷的酶。激活gpx4的保護(hù)作用對于治療炎癥、氧化損傷、神經(jīng)退行性病變、及其它鐵死亡參與的疾病有很好的效果。

gpx4與炎癥。炎癥的發(fā)生與發(fā)展是一個(gè)多分子參與的復(fù)雜過程，花生四烯酸(arachidonicacid,aa)代謝網(wǎng)絡(luò)是其中的核心網(wǎng)絡(luò)，gpx4在aa代謝中發(fā)揮重要作用(yang,k.etal.dynamicsimulationsonthearachidonicacidmetabolicnetwork.ploscomput.biol.3,523-530(2007).；yang,k.etal.findingmultipletargetoptimalinterventionindisease-relatedmolecularnetwork.mol.syst.biol.4,228(2008).)。aa通過三條脂氧合酶(lox)通路被轉(zhuǎn)化為對應(yīng)的羥基過氧化二十碳四烯酸(hpete)之后，gpx4催化還原h(huán)pete生成羥基二十碳四烯酸(hete)。當(dāng)gpx4高效還原5-hpete時(shí)，下游白三烯類促炎因子的產(chǎn)量會明顯降低，從而達(dá)到抗炎的效果。另外，gpx4催化還原生成的15-hete會進(jìn)一步被代謝為脂氧素(lxs)類分子，可以抑制中性粒細(xì)胞的趨化運(yùn)動，促進(jìn)炎癥的消除(kuhn,h.etal.regulationofenzymaticlipidperoxidation:theinterplayofperoxidizingandperoxidereducingenzymes.freeradic.biol.med.33,154-172(2002).；schnurr,k.etal.theselenoenzymephospholipidhydroperoxideglutathioneperoxidasecontrolstheactivityofthe15-lipoxygenasewithcomplexsubstratesandpreservesthespecificityoftheoxygenationproducts.j.biol.chem.271,4653-4658(1996).)。

gpx4與鐵死亡。鐵死亡是一種依賴于細(xì)胞內(nèi)鐵離子存在的非凋亡式細(xì)胞死亡方式，在2012年首次報(bào)道。鐵死亡與神經(jīng)退行性變、組織缺血再灌注損傷、中風(fēng)、心血管、腎衰竭以及糖尿病并發(fā)癥等疾病的發(fā)生和發(fā)展密切相關(guān)(yang,w.s.etal.ferroptosis:deathbylipidperoxidation.trendscellbiol.26,165-176(2016).)。2014年，yang等人發(fā)現(xiàn)gpx4是鐵死亡的核心調(diào)控者(yang,w.s.etal.regulationofferroptoticcancercelldeathbygpx4.cell156,317-331(2014).)，gpx4激活劑可以抑制鐵死亡的發(fā)生，被用于治療鐵死亡相關(guān)的疾病。

目前還沒有報(bào)道可以直接激活gpx4酶活性的化合物，也沒有g(shù)px4激活劑進(jìn)入臨床試驗(yàn)。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的是提供一系列有機(jī)雜環(huán)化合物作為磷脂氫谷胱甘肽過氧化物酶(gpx4)激活劑。

本發(fā)明的目的還在于提供上述有機(jī)雜環(huán)化合物在制備治療和預(yù)防各種炎癥、氧化損傷、神經(jīng)退行性病變、及鐵死亡相關(guān)疾病等各種gpx4活性相關(guān)疾病的藥物中的應(yīng)用。

本發(fā)明通過使用蛋白表面口袋探測程序cavity對gpx4的別構(gòu)位點(diǎn)進(jìn)行預(yù)測，發(fā)現(xiàn)了適合小分子結(jié)合的潛在別構(gòu)位點(diǎn)，并針對其進(jìn)行了虛擬篩選。通過體外活性測試，一系列分子被證實(shí)為gpx4激活劑。借助液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)分析，激活劑分子在人多形核細(xì)胞的炎癥模型展現(xiàn)出減少炎癥因子生成，提高抑炎因子濃度的效果。另外，在人纖維肉瘤細(xì)胞ht-1080的鐵死亡模型中，我們發(fā)現(xiàn)使用gpx4激活劑可以抑制鐵死亡誘導(dǎo)劑erastin誘導(dǎo)的鐵死亡發(fā)生。

本發(fā)明提供的化合物具有如下結(jié)構(gòu)通式：

其中x代表直鏈或支鏈烷基、取代或未取代的環(huán)烷基、取代或未取代的芳基、取代或未取代的雜環(huán)基；y代表氫、胺基、烷基或環(huán)烷基取代的胺基、取代或未取代的含1-2個(gè)氮原子的雜環(huán)基、或者取代或未取代的同時(shí)含氮及氧原子的雜環(huán)基。

對于x：

上述直鏈或支鏈烷基優(yōu)選為c1～c6的直鏈或支鏈烷基，更優(yōu)選為c1～c3的烷基，例如甲基、乙基、丙基、異丙基等。

上述環(huán)烷基優(yōu)選c3～c7的環(huán)烷基，更優(yōu)選為c5～c6的環(huán)烷基，例如環(huán)戊基、環(huán)己基。

上述芳基優(yōu)選為c6～c7的芳基，例如芐基、苯基等。

上述雜環(huán)基包括脂雜環(huán)基和芳雜環(huán)基，優(yōu)選c2～c6的脂雜環(huán)基和芳雜環(huán)基。

所述脂雜環(huán)基包括但不限于雜環(huán)烷基、內(nèi)酯基、內(nèi)酰胺基、環(huán)形二酸酐基、環(huán)形酰亞胺基等。

所述雜環(huán)烷基優(yōu)選為c2～c6的雜環(huán)烷基，可以是含1-2個(gè)o、s和/或n原子的三元至六元的雜環(huán)烷基，例如環(huán)乙氧基、環(huán)硫乙基、氮丙啶基、四氫呋喃基、四氫吡咯基、四氫噻吩基、哌啶基、哌嗪基、嗎啉基等。

所述內(nèi)酯基優(yōu)選為c2～c5的內(nèi)酯基，例如丙內(nèi)酯基(即β內(nèi)酯基，四元環(huán))、丁內(nèi)酯基(即γ內(nèi)酯基，五元環(huán))等。

所述內(nèi)酰胺基優(yōu)選為c2～c5的內(nèi)酰胺基，例如丙內(nèi)酰胺基(即β內(nèi)酰胺基，四元環(huán))、丁內(nèi)酰胺基(即γ內(nèi)酰胺基，五元環(huán))等。

所述環(huán)形二酸酐基優(yōu)選為c2～c5的環(huán)形二酸酐基，例如馬來酸酐基、丁二酸酐基、戊二酸酐基等。

所述環(huán)形酰亞胺基優(yōu)選為c2～c5的環(huán)形酰亞胺基，例如海因基(乙內(nèi)酰脲基)、馬來酰亞胺基、琥珀酰亞胺基、戊二酰亞胺基、尿嘧啶基等。

上述芳雜環(huán)基優(yōu)選為c2～c6的含有1-2個(gè)o、s和/或n原子的雜環(huán)芳基，更優(yōu)選為c3～c5的雜環(huán)芳基，例如呋喃基、噻吩基、吡咯基、噁唑基、噻唑基、咪唑基、吡啶基、嘧啶基等。

所述環(huán)烷基、芳基和雜環(huán)基上的取代基優(yōu)選為鹵素、c1～c4的烷基、c1～c4的烯基、c1～c4的含氮或氧原子的基團(tuán)，例如氯、氟、甲基、甲氧基、氰基、羧酸甲脂、硝基等。

對于y：

上述烷基或環(huán)烷基取代的胺基優(yōu)選為c1～c5烷基或環(huán)烷基取代的胺基，更優(yōu)選為c1～c3烷基取代的胺基，例如2-氨基乙基。

上述含1-2個(gè)氮原子的雜環(huán)基例如哌嗪基、哌啶基等，雜環(huán)基上可具有一個(gè)或多個(gè)c1～c4的烷基取代基，例如甲基取代的哌嗪基。

上述同時(shí)含氮及氧原子的雜環(huán)基例如噁唑烷基，氧雜哌嗪基，雜環(huán)基上可具有一個(gè)或多個(gè)c1～c4的烷基取代基，例如1-甲基-3-氧代哌嗪基等。

上述通式化合物的具體例子有：

1)4-(3-(4-氯芐基)硫脲基)苯磺酰胺；

2)4-(3-(4-甲基哌嗪-1基)硫脲基)苯磺酰胺；

3)4-(3-(2-羥乙基)硫脲基)苯磺酰胺；

4)4-(3-芐基硫脲基)苯磺酰胺；

5)4-(3-叔丁基硫脲基)苯磺酰胺；

6)4-(3-環(huán)戊基硫脲基)苯磺酰胺；

7)4-(3-環(huán)己基硫脲基)苯磺酰胺；

8)4-(3-苯基硫脲基)苯磺酰胺；

9)4-(3-環(huán)己基甲基硫脲基)苯磺酰胺；

10)4-(3-環(huán)庚基硫脲基)苯磺酰胺；

11)4-(3-((1r，4r)-4-甲基環(huán)己基)硫脲基)苯磺酰胺；

12)4-(3-(2-甲基環(huán)己基)硫脲基)苯磺酰胺；

13)4-(哌啶-1-硫代甲酰胺基)苯磺酰胺；

14)4-(3-(吡啶-3-基)硫脲基)苯磺酰胺；

15)4-(3-(2-羥基環(huán)己基)硫脲基)苯磺酰胺；

16)4-(3-(2，4-氧雜咪唑基)硫脲基)苯磺酰胺；

17)n-(2-氨基乙基)-4-(3-環(huán)戊基硫脲基)苯磺酰胺鹽酸鹽；

18)n-(2-氨基乙基)-4-(3-環(huán)己基硫脲基)苯磺酰胺鹽酸鹽。

本發(fā)明包括任何具有激活gpx4活性的、分離的消旋或光學(xué)活性形式的式i化合物。

本發(fā)明的化合物或其藥用鹽在gpx4的體外活性測試中均顯示出了激活活性，說明其為gpx4的激活劑。

本發(fā)明的化合物或其藥用鹽在人多形核細(xì)胞的炎癥模型實(shí)驗(yàn)中，展現(xiàn)出減少炎癥因子生成，提高抑炎因子濃度的效果。

本發(fā)明的化合物或其藥用鹽在人纖維肉瘤細(xì)胞ht-1080的鐵死亡模型中，顯示出抑制鐵死亡誘導(dǎo)劑erastin誘導(dǎo)的鐵死亡發(fā)生的作用。

將本發(fā)明的化合物或其藥用鹽作為有效成分，添加常規(guī)藥物載體，可制備用于治療或預(yù)防各種炎癥、氧化損傷、神經(jīng)退行性病變、及鐵死亡相關(guān)疾病等各種gpx4活性相關(guān)疾病的藥物。

上述藥用鹽為所述化合物與無機(jī)酸或有機(jī)酸形成的鹽，所述無機(jī)酸包括鹽酸、硫酸、磷酸、硝酸等；所述有機(jī)酸包括檸檬酸、琥珀酸、枸櫞酸、醋酸、酒石酸、甲磺酸等。

上述藥物載體包括無毒固態(tài)、半固態(tài)或液態(tài)的填充劑、稀釋劑、佐劑、包裹材料等制劑輔料，根據(jù)治療目的、給藥途徑的需要將藥物組合物制成各種劑型。

附圖說明

圖1顯示了蛋白表面探測程序cavity預(yù)測出的gpx4別構(gòu)位點(diǎn)，所預(yù)測的潛在別構(gòu)位點(diǎn)(圖中蛋白結(jié)構(gòu)的右側(cè)所示)位于已知底物結(jié)合位點(diǎn)(圖中蛋白結(jié)構(gòu)的左側(cè)所示)的對側(cè)。

圖2是pkumdl-lc-101與gpx4分子對接圖，圖中分子與蛋白間的氫鍵以虛線表示。

圖3顯示實(shí)施例4中pkumdl-lc-101在人多形核細(xì)胞的炎癥模型中的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，pkumdl-lc-101在人多形核細(xì)胞中使得5-hete∶ltb4的濃度比例升高(a)，并使12-lox和15-lox通路下游的12-hete和15-hete的含量升高(b)。

圖4顯示實(shí)施例5中pkumdl-lc-101對人纖維肉瘤細(xì)胞ht-1080的鐵死亡模型的影響，pkumdl-lc-101在ht-1080細(xì)胞中能夠抑制erastin誘導(dǎo)的鐵死亡。

具體實(shí)施方式

以下實(shí)施例用于說明本發(fā)明，表示實(shí)踐本發(fā)明的方法，其對本發(fā)明的范圍無任何限制。本領(lǐng)域技術(shù)人員可能找到對于他們而言顯而易見的實(shí)現(xiàn)本發(fā)明的其他方法，均應(yīng)認(rèn)為那些方法被包括在本發(fā)明的范圍之內(nèi)。

實(shí)施例1、gpx4激活劑的發(fā)現(xiàn)

一、gpx4別構(gòu)位點(diǎn)的預(yù)測

我們使用蛋白表面口袋探測程序cavity對gpx4的別構(gòu)位點(diǎn)進(jìn)行了預(yù)測，尋找蛋白表面適合小分子結(jié)合的位點(diǎn)。cavity程序的計(jì)算流程為：第一步，通過純幾何的擦除球方法對蛋白質(zhì)表面進(jìn)行探測，尋找蛋白質(zhì)表面可能的配體結(jié)合位點(diǎn)；第二步，結(jié)合幾何結(jié)構(gòu)與物理化學(xué)性質(zhì)信息，根據(jù)經(jīng)驗(yàn)公式對蛋白結(jié)合小分子的能力進(jìn)行打分。我們采用默認(rèn)參數(shù)對gpx4突變體u46c的結(jié)構(gòu)(pdb編號2obi)進(jìn)行了分析，最終確定了一個(gè)適合結(jié)合小分子的可能的別構(gòu)口袋，如圖1所示，該別構(gòu)位點(diǎn)位于圖中所示蛋白結(jié)構(gòu)的右側(cè)，在已知底物結(jié)合位點(diǎn)(左側(cè))的對側(cè)。

二、gpx4別構(gòu)分子的虛擬篩選

針對預(yù)測的別構(gòu)位點(diǎn)，采用分子對接的方法，對包含197,276個(gè)化合物的specs數(shù)據(jù)庫進(jìn)行虛擬篩選。我們使用glide程序的sp(standardprecision)模式先進(jìn)行粗略的剛性對接，從197,276個(gè)化合物中選出打分排名前10,000的化合物。之后使用glide程序xp(extraprecision)模式，考慮化合物和蛋白質(zhì)殘基的側(cè)鏈柔性再次精細(xì)對接，從10,000個(gè)化合物中選出打分排名前2,000的化合物。最后，對排名前2,000的化合物，根據(jù)它們的預(yù)測結(jié)合構(gòu)象進(jìn)行人工挑選。選出的251個(gè)化合物在體外酶活性測試中進(jìn)一步驗(yàn)證活性。化合物pkumdl-lc-101即為篩選得到的活性化合物之一。

實(shí)施例2、激活劑分子的設(shè)計(jì)合成

一、pkumdl-ld-101類似物的設(shè)計(jì)

根據(jù)活性化合物pkumdl-ld-101與gpx4結(jié)合的對接模型(見圖2)和分子二維結(jié)構(gòu)，我們進(jìn)一步對化合物的芳香環(huán)進(jìn)行替換或?qū)⒒酋０诽鎿Q為n-取代磺酰胺，設(shè)計(jì)一系列化合物。

二、pkumdl-ld-101類似物的合成根據(jù)設(shè)計(jì)，我們從specs庫中購買了4-(3-(4-甲基哌嗪-1基)硫脲基)苯磺酰胺(pkumdl-ld-102)和4-(3-(2-羥基乙基)硫脲基)苯磺酰胺(pkumdl-ld-103)兩個(gè)類似物。對于購買不到的設(shè)計(jì)分子，通過化學(xué)合成得到。

1.以pkumdl-ld-104為例，描述部分類似物的合成。

我們參考已報(bào)道的方法，合成4-異硫氰酸酯基苯磺酰胺(mohameds.a.el-gabyetal.synthesis,characterizationandinvitroantimicrobialactivityofnovel2-thioxo-4-thiazolidinonesand4,4′-bis(2-thioxo-4-thiazolidinone-3-yl)diphenylsulfones.eurjmedchem.2009,44,4148-4152)。然后，用4-異硫氰酸酯基苯磺酰胺與芐胺加成，得到4-(3-芐基硫脲基)苯磺酰胺。

4-氨基苯磺酰胺(17.20g,100mmol)溶于200ml水中，加入50ml濃鹽酸，室溫下加入硫光氣(11.50g,100mmol)反應(yīng)30分鐘，過濾得到4-異硫氰酸酯基苯磺酰胺，水洗干燥，得到產(chǎn)品18.62g，產(chǎn)率87％

214mg(1mmol)4-異硫氰酸酯基苯磺酰胺溶于5mletoh，加入1mmol芐胺，室溫?cái)嚢瑁由V(tlc)監(jiān)測反應(yīng)進(jìn)程，直到原料消失，過濾不溶物即得到pkumdl-ld-104，真空干燥得到產(chǎn)品289mg。產(chǎn)率為90％。

采用上述方法可制備如下化合物：

pkumdl-ld-105：4-(3-叔丁基硫脲基)苯磺酰胺；

pkumdl-ld-106：4-(3-環(huán)戊基硫脲基)苯磺酰胺；

pkumdl-ld-107：4-(3-環(huán)己基硫脲基)苯磺酰胺；

pkumdl-ld-108：4-(3-苯基硫脲基)苯磺酰胺；

pkumdl-ld-109：4-(3-環(huán)己基甲基硫脲基)苯磺酰胺；

pkumdl-ld-110：4-(3-環(huán)庚基硫脲基)苯磺酰胺；

pkumdl-ld-111：4-(3-((1r，4r)-4-甲基環(huán)己基)硫脲基)苯磺酰胺；

pkumdl-ld-112：4-(3-(2-甲基環(huán)己基)硫脲基)苯磺酰胺；

pkumdl-ld-113：4-(哌啶-1-硫代甲酰胺基)苯磺酰胺；

pkumdl-ld-114：4-(3-(吡啶-3-基)硫脲基)苯磺酰胺；

pkumdl-ld-115：4-(3-(2-羥基環(huán)己基)硫脲基)苯磺酰胺；

pkumdl-ld-116：4-(3-(2，4-氧雜咪唑基)硫脲基)苯磺酰胺。

所得化合物的產(chǎn)率為70％～90％。

同樣的合成方法，也用于放大量制備化合物pkumdl-ld-101，產(chǎn)率為92％。

2.以pkumdl-ld-117為例，描述其余化合物的合成。

n-boc-乙二胺2.40g(15mmol)溶于250ml二氯甲烷中，0℃下加入2ml三乙胺和2.33g(10mmol)4-乙酰氨基苯磺酰氯。室溫反應(yīng)1小時(shí)，減壓蒸餾除去溶劑，殘留物中加入50ml水，50mletoh，1.60g(40mmol)naoh，回流反應(yīng)3h；2m的鹽酸調(diào)ph到7，乙酸乙酯萃取反應(yīng)液，有機(jī)相飽和食鹽水洗滌，na2so4干燥,濾除干燥劑，旋蒸除去溶劑，得到粗產(chǎn)物，經(jīng)柱色譜分離，得到n-(n-boc-氨基乙基)-4-氨基苯磺酰胺1.70g,¹hnmr(400mhz,dmso-d6)δ7.39(d,j＝8.7hz,2h),7.13(t,j＝5.8hz,1h),6.76(t,j＝5.8hz,1h),6.67–6.55(m,2h),5.93(s,2h),2.93(q,j＝6.7hz,2h),2.65(q,j＝6.7hz,2h),1.35(s,9h).

取1.57gn-(n-boc-氨基乙基)-4-氨基苯磺酰胺溶于20mlthf，加入0.5ml硫光氣，室溫反應(yīng)8h，過濾干燥得到n-(n-boc-氨基乙基)-4-異硫氰酸基苯磺酰胺1.20g。

n-(n-boc-氨基乙基)-4-異硫氰酸基苯磺酰胺357mg溶于5mletoh，加入1mmol環(huán)戊胺室溫反應(yīng)直到原料消失，過濾得到n-(n-boc-氨基乙基)-4-(3-環(huán)戊基硫脲基)苯磺酰胺410mg，產(chǎn)率93％。

400mgn-(n-boc-氨基乙基)-4-(3-環(huán)戊基硫脲基)苯磺酰胺溶于5mletoh，加入0.5ml1m的氯化氫乙醇溶液，室溫?cái)嚢?h，過濾得到白色固體，真空干燥得到產(chǎn)品pkumdl-ld-117298mg，產(chǎn)率85％。

采用上述方法制備了pkumdl-ld-118。

化合物的表征數(shù)據(jù)列入表1，其中在核磁共振波譜儀varianmercury400m(氘代dmso，tms參比)上得到¹hnmr光譜數(shù)據(jù)，在brukersolarixxr得到質(zhì)譜數(shù)據(jù)。購買的pkumdl-ld-102與pkumdl-ld-103的核磁氫譜是specs網(wǎng)站提供的。

表1.目標(biāo)化合物表征數(shù)據(jù)

實(shí)施例3、gpx4的體外活性測試

gpx4酶活性的測定是通過監(jiān)測反應(yīng)動力學(xué)實(shí)現(xiàn)的。gpx4催化還原型谷胱甘肽還原叔丁基過氧化物，自身被氧化成氧化型谷胱甘肽。氧化型谷胱甘肽可以在谷胱甘肽還原酶存在時(shí)被nadph還原，同時(shí)nadph被消耗。我們檢測nadph在460nm處的熒光發(fā)射譜的下降(激發(fā)波長為335nm)。實(shí)驗(yàn)的具體做法為：將小分子的dmso溶液10μl與純化后的gpx4蛋白孵育，gpx4蛋白置于185μl測活緩沖液中(tris-hcl，100mm，ph7.4；edta，5mm；tritonx-100，0.1％；nadph，0.2mm；還原型谷胱甘肽，3mm；谷胱甘肽還原酶，1unit/ml)。使用恒溫振蕩培養(yǎng)器在37℃以650rpm的轉(zhuǎn)速振蕩孵育5min。加入5μl叔丁基過氧化物(終濃度25μm)的水溶液，啟動反應(yīng)，并用熒光酶標(biāo)儀監(jiān)測460nm下nadph的消耗量隨時(shí)間的變化。使用60s以內(nèi)反應(yīng)初速率對蛋白活性進(jìn)行評估，此時(shí)nadph消耗隨時(shí)間增長呈線性。

我們對所有化合物進(jìn)行g(shù)px4的體外活性測試，表現(xiàn)出激活gpx4效果的列入表2。

表2.化合物對gpx4激活

實(shí)施例4、化合物在人多形核細(xì)胞的炎癥模型實(shí)驗(yàn)中對花生四烯酸網(wǎng)絡(luò)代謝產(chǎn)物的影響

抽取2周未服用非甾類抗炎藥物的健康志愿者靜脈血液。通過ficoll密度離心法，從新鮮血液中分離出多形核細(xì)胞(純度95％)，重懸于pbs緩沖液中，使細(xì)胞濃度在1×10⁶個(gè)每毫升左右。小分子溶解于dmso中并加入到細(xì)胞懸浮液中，dmso終濃度為0.25％。多形核細(xì)胞與小分子在37℃先孵育15分鐘(空白對照組與dmso孵育)，之后，加入終濃度為10μm的鈣離子載體a23187，2mmca²⁺以及2mmmg²⁺，120分鐘之后在300μl樣品加入700μl冷甲醇中終止反應(yīng)。加入前列腺素b2作為內(nèi)標(biāo)。溶液在氮吹儀下吹干，固體用甲醇重懸，離心之后通過液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用檢測各種代謝產(chǎn)物濃度。

在未加任何gpx4激活劑時(shí)，人多形核細(xì)胞被a23187刺激炎癥以后，5-lox，12-lox，15-lox通路流量上漲，aa、5-hete、白三烯b4(ltb4)、eoxinc4(exc4)、12-hete、15-hete、20-hete等化合物的濃度顯著上升。當(dāng)gpx4的活性被激活時(shí)，12-lox和15-lox通路下游的12-hete和15-hete的含量應(yīng)該升高。另一方面，在5-lox通路中，gpx4和lta4h會競爭同一個(gè)底物5-hpete，因此gpx4的活性被激活時(shí)5-hete∶ltb4的比例會升高。gpx4激活劑pkumdl-lc-101可以在人多形核細(xì)胞中濃度依賴的激活gpx4的酶活性，使得代謝物5-hete∶ltb4的比例升高，同時(shí)12-hete和15-hete的含量升高(見圖3)。

這些結(jié)果說明本發(fā)明的化合物展現(xiàn)出減少炎癥因子生成，提高抑炎因子濃度，促進(jìn)炎癥消退的效果。

實(shí)施例5、gpx4激活劑對人纖維肉瘤細(xì)胞ht-1080的鐵死亡模型的影響

最近，gpx4被發(fā)現(xiàn)是一種新型細(xì)胞死亡方式——鐵死亡的核心調(diào)控者。為了證明使用gpx4激活劑可以達(dá)到抑制鐵死亡發(fā)生的目的，我們測試了gpx4激活劑pkumdl-lc-101對erastin誘導(dǎo)的鐵死亡的影響。在人纖維肉瘤細(xì)胞ht-1080中加入eratin(era)會限制細(xì)胞中還原型谷胱甘肽的產(chǎn)生，進(jìn)而抑制依賴于還原型谷胱甘肽的gpx4的活性，誘發(fā)鐵死亡。實(shí)驗(yàn)中，將ht-1080細(xì)胞與gpx4激活劑預(yù)先孵育30分鐘，然后加入致死量的erastin(終濃度10μm)。二十四小時(shí)之后，使用mts方法測定細(xì)胞的存活率。

ht-1080細(xì)胞培養(yǎng)在含有10％fbs，1％非必需氨基酸和1％pen-strep的dmem培養(yǎng)基中，在含有5％co2的37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。實(shí)驗(yàn)前一天，以2,000個(gè)細(xì)胞每孔的密度將細(xì)胞種到96孔板中。實(shí)驗(yàn)當(dāng)天，將培養(yǎng)基換成含有不同濃度gpx4激活劑的新鮮dmem培養(yǎng)基，在37℃培養(yǎng)箱中孵育30分鐘。孵育結(jié)束后，加入終濃度為10μm的erastin誘導(dǎo)鐵死亡發(fā)生。二十四小時(shí)后，使用promegamts試劑盒測定細(xì)胞存活率。流程如下：在每孔中加入10μlcelltiteraqueousone溶液，之后在含有5％co2的37℃培養(yǎng)箱中孵育1～4小時(shí)。孵育結(jié)束后，使用bioteksynergy4多功能酶標(biāo)儀測定490nm波長處的吸收。

在ht-1080細(xì)胞中加入gpx4激活劑pkumdl-lc-101，提高了細(xì)胞存活率，阻止鐵死亡的發(fā)生(見圖4)。激活劑濃度達(dá)到125μm時(shí)能拯救40％的細(xì)胞。

這些結(jié)果說明激活gpx4確實(shí)可以阻止鐵死亡的發(fā)生，我們發(fā)現(xiàn)的gpx4激活劑在細(xì)胞中可以保護(hù)細(xì)胞不發(fā)生鐵死亡。

本發(fā)明化合物可激活gpx4活性。細(xì)胞實(shí)驗(yàn)中，化合物激活gpx4后，展現(xiàn)出減少致炎因子生成，提高抑炎因子濃度的效果，使得花生四烯酸代謝網(wǎng)絡(luò)整體向有利于炎癥消除的狀態(tài)調(diào)整。同時(shí)，本發(fā)明化合物在細(xì)胞實(shí)驗(yàn)中，顯示出抑制鐵死亡發(fā)生的作用。