本發(fā)明涉及一種生物工程技術(shù)，尤其涉及一種花生蛋白多肽及其應(yīng)用。
背景技術(shù)：
花生中的蛋白質(zhì)含量約為25％-36％，高于芝麻和油菜，僅次于大豆?；ㄉ鞍资且环N營養(yǎng)價值很高的完全蛋白，屬于食用植物蛋白質(zhì)，其生物價(bv)為58，效率值為117，含有人體所需的8種必需氨基酸,尤其富含精氨酸(9％)，而精氨酸具有免疫促進(jìn)功能，對維護(hù)人體健康和幼兒發(fā)育具有重要作用。研究發(fā)現(xiàn),蛋白質(zhì)經(jīng)水解制得的肽有比蛋白質(zhì)更好的營養(yǎng)性能,實(shí)驗(yàn)證實(shí)肽的吸收率比氨基酸高，比氨基酸更易、更快通過小腸黏膜被人體吸收利用?；ㄉ鞍谆钚远嚯脑跔I養(yǎng)保健領(lǐng)域具有多種卓越的生理功能，一是多肽可由腸道不經(jīng)降解直接吸收，吸收速度和吸收率比蛋白質(zhì)和氨基酸都高，因而可作為腸道營養(yǎng)劑和流質(zhì)食物的形式提供給處于特殊身體狀況下的人群；二是它不僅提供人體必須的蛋白營養(yǎng)，還能有效降低血液中膽固醇和甘油三脂的含量，加快體內(nèi)耗能，燃燒脂肪，抵抗肥胖；三是花生蛋白活性多肽能夠?yàn)槿梭w提供豐富的氨基酸，促進(jìn)蛋白質(zhì)合成，抑制核糖核酸酶活性下降，清除人體內(nèi)的自由基與重金屬，改善細(xì)胞代謝，為免疫系統(tǒng)制備對抗細(xì)菌和感染的抗體，提高人體免疫功能。
花生本身藥用價值高，高蛋白，是一種潛在的植物蛋白資源，但是目前對花生蛋白的研究主要集中在花生蛋白抗氧化性能、免疫功能等方面，而對具有降脂功能的花生蛋白的研究卻報道尚少。因此利用現(xiàn)代食品生物技術(shù)對花生降脂蛋白進(jìn)行深度開發(fā)，制備出具有保健作用的功能食品，不僅可提高現(xiàn)有資源的利用率，為花生蛋白的深度研究提供一條新的途徑，增加農(nóng)民的經(jīng)濟(jì)效益；而且可增強(qiáng)花生種植和食品加工企業(yè)的科技含量和市場競爭力，對提高我國水產(chǎn)品現(xiàn)代化綜合加工技術(shù)水平和發(fā)展保健食品工業(yè)具有重要的社會意義和經(jīng)濟(jì)效益。
公開于該背景技術(shù)部分的信息僅僅旨在增加對本發(fā)明的總體背景的理解，而不應(yīng)當(dāng)被視為承認(rèn)或以任何形式暗示該信息構(gòu)成己為本領(lǐng)域一般技術(shù)人員所公知的現(xiàn)有技術(shù)。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：
為了克服現(xiàn)有技術(shù)的不足，本發(fā)明的目的之一在于提供一種花生蛋白多肽。通過改進(jìn)花生蛋白多肽的酶解工藝與技術(shù)，采用超波輔助酶解技術(shù)，制備具有降脂活性的多肽，本發(fā)明制備的花生降脂肽的肽得率高，純度高。
本發(fā)明的目的之二在于一種花生蛋白多肽在復(fù)方花生蛋白多肽酒中的應(yīng)用。本發(fā)明的復(fù)方花生蛋白多肽以花生蛋白多肽為主要添加的降脂成分，山楂為輔助添加的降脂成分，兩者配合使用，能夠起到協(xié)同增效的作用。
本發(fā)明的目的之一采用如下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)：
一種花生蛋白多肽，為分子量介于3000-6000da的花生降脂肽，該花生降脂肽釆用微波輔助酶解技術(shù)制備而得，該制備方法包括如下步驟：
前處理的步驟：
將花生加水潤濕，在121℃下蒸煮15min，冷卻，粉碎攪拌，制成花生泥；
蛋白質(zhì)改性的步驟：
稱取花生泥，按照固液比1:10加入堿液，然后調(diào)ph值至8.2-8.5，在45-55℃下，微波處理10分鐘，之后保溫20min，ph值保持在8.5以下，離心，取上層清液，加入酸液，調(diào)ph值至4-4.5，微波處理10分鐘，之后保溫20min，ph值保持在4.5以下，離心，取下層沉淀，溶解，得到改性花生蛋白溶液；
一次酶解的步驟：
以改性花生蛋白溶為底物，用鹽酸調(diào)ph值至7.5，按照底物質(zhì)量百分比為0.5-0.8％加入自制蛋白酶拌勻，然后在55℃下，微波處理20分鐘，ph值保持在7.5以下；
二次酶解的步驟：
經(jīng)過第一次酶解處理后，將第一次酶解液降至常溫，再次調(diào)節(jié)ph值至7.5，按照底物質(zhì)量百分比為0.8-1.2％加入自制蛋白酶拌勻，在55℃下，微波處理20分鐘，ph值保持在7.5以下，酶解結(jié)束；
滅酶的步驟：
酶解結(jié)束后再次啟動微波加溫至90℃，維持10min，得到滅酶水解液；
分離純化的步驟：
將滅酶活的水解液降至室溫，采用sephadexg-15凝膠過濾色譜分離純化滅酶活的水解液；
高壓蒸汽滅菌的步驟：
經(jīng)分離純化的水解液在溫度為121℃，壓力為0.1mpa的條件下高壓蒸汽滅菌15min；
濃縮干燥的步驟：
將高壓蒸汽滅菌后的水解液調(diào)ph值至7.0，進(jìn)行濃縮低溫真空干燥，即得花生降脂肽。
進(jìn)一步地，在蛋白質(zhì)改性的步驟中，所述堿液為3mol/lnaoh；所述酸液為3mol/l檸檬酸。
進(jìn)一步地，在一、二次酶解的步驟中，所述自制蛋白酶為由花生粕作為基礎(chǔ)培養(yǎng)基誘導(dǎo)米曲霉分泌的復(fù)合蛋白酶。
進(jìn)一步地，在一、二次酶解的步驟中，所述復(fù)合蛋白酶的制作過程如下：過80目篩的麩皮20g，過80目花生粕粉8.0g，面粉2.5g、氯化鈣0.028g混入30g純凈水中，裝入三角瓶，加塞扎口后于濕熱滅菌鍋中在121℃下滅菌30min，取出后趁熱搖散培養(yǎng)基熟料，自然冷卻至室溫；然后從米曲霉試管菌種中接種到三角瓶培養(yǎng)基中，30℃恒溫培養(yǎng)，每天搖瓶一次，54h結(jié)束培養(yǎng)；采用ph值為7.0的0.2m磷酸鹽緩沖液在40℃下攪拌1h提取蛋白酶；4℃下離心30min，收集上清液，濃縮冷凍干燥后即得復(fù)合蛋白酶。
進(jìn)一步地，在一、二次酶解的步驟中，所述自制蛋白酶的活力為4.5×105u/g。
進(jìn)一步地，在蛋白質(zhì)改性的步驟、一次酶解的步驟、二次酶解的步驟中所述微波的頻率為1800mhz，功率為10kw。
進(jìn)一步地，所述分離純化的步驟具體如下：用去離子水平衡凝膠層析柱，柱子尺寸為1.6cm×70cm，填料為葡聚糖凝膠樹脂sephadexg-15，流速為1.0ml/min；將滅酶活的水解液溶于去離子水配置成20mg/ml的溶液，2ml上柱，用去離子水進(jìn)行洗脫，洗脫流速為2ml/min，并用分步收集器收集洗脫液，4ml/管，于214nm下檢測吸光值，將屬于同一峰的收集液混合，然后進(jìn)行濃縮。
本發(fā)明的目的之二采用如下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)：
一種復(fù)方花生蛋白多肽酒的制備方法，由如上所述的花生蛋白多肽釀制而成。包括如下步驟：
輔料中藥浸提液的步驟：
取山楂，加入10倍量80℃的純凈水浸泡1h，煮沸1.5h，過濾，濾渣加入8倍量純凈水再次煮沸1h，用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀減壓濃縮至稠膏，備用；
勾兌的步驟：
以濃度為35％米酒為基液，加入40-45％基酒重量的所述花生蛋白多肽以及5-8％基酒重量的山楂稠膏，攪拌均勻，并密封儲存2個月；
雙頻超波陳化的步驟：
在兩種超波頻率條件下進(jìn)行輪流超波陳化處理，第一種超波條件：300w、35khz的超波15min；第二種超波條件：300w、45khz的超波15min；共超聲2h；
調(diào)配檢驗(yàn)的步驟：
調(diào)整酒精濃度和糖度，儲藏，確保酒體清亮透明；然后檢驗(yàn)合格后灌裝，即得復(fù)方花生蛋白多肽酒。
相比現(xiàn)有技術(shù)，本發(fā)明的有益效果在于：
(1)通過改進(jìn)花生蛋白多肽的酶解工藝與技術(shù)，采用超波輔助酶解技術(shù)，制備具有降脂活性的多肽，本發(fā)明制備的花生降脂肽的肽得率高，純度高，可以作為添加劑或活性藥物添加至到人類食品、醫(yī)藥、保健品等多種行業(yè)和領(lǐng)域，無疑對延長泥鰍產(chǎn)業(yè)鏈，全面提高泥鰍產(chǎn)業(yè)綜合效益，實(shí)現(xiàn)農(nóng)業(yè)增效農(nóng)民增收農(nóng)村繁榮，對推動一帶一路建設(shè)有重大意義。
(2)本發(fā)明整個工藝流程短、時間短，能耗低、污染少、不使用有毒試劑、無污染物排放，達(dá)到清潔生產(chǎn)目標(biāo)。
(3)在控制酶解過程中酶的選擇是關(guān)鍵，它不僅影響最后產(chǎn)品的生理功能、原料利用率、反應(yīng)速度，而且也直接影響產(chǎn)品的風(fēng)味和物理化學(xué)特性。酶的選擇、酶解過程的控制是酶解法制備活性肽的關(guān)鍵技術(shù)。本發(fā)明采用由花生粕作為基礎(chǔ)培養(yǎng)基誘導(dǎo)米曲霉分泌的復(fù)合蛋白酶進(jìn)行酶解同時配合微波進(jìn)行輔助酶解，使花生水解產(chǎn)物的水解度和肽得率都較高，而且酶解得到的花生多肽的分子量介于3000-6000da，具有降脂作用。
(4)由本發(fā)明sephadexg-15凝膠層析過濾色譜分離純化得到的花生蛋白多肽的分子量介于3000-6000da，該花生蛋白多肽組分降脂作用強(qiáng)，研究發(fā)現(xiàn)，并非肽分子量越小或越大其降脂活性越強(qiáng)，肽的活性也受其氨基酸的組成、排序或肽的空間結(jié)構(gòu)等因素的影響，由本發(fā)明純化得到的分子量介于3000-6000da花生蛋白多肽其降脂活性最強(qiáng)。另外，本發(fā)明的分離條件溫和、樣品回收率高、實(shí)驗(yàn)結(jié)果重現(xiàn)性高、設(shè)備簡便經(jīng)濟(jì)。
具體實(shí)施方式
下面，結(jié)合具體實(shí)施方式，對本發(fā)明做進(jìn)一步描述，需要說明的是，在不相沖突的前提下，以下描述的各實(shí)施例之間或各技術(shù)特征之間可以任意組合形成新的實(shí)施例。
在本發(fā)明中，若非特指，所有的份、百分比均為重量單位，所采用的設(shè)備和原料等均可從市場購得或是本領(lǐng)域常用的。下述實(shí)施例中的方法，如無特別說明，均為本領(lǐng)域的常規(guī)方法。
一種花生蛋白多肽，為分子量介于3000-6000da的花生降脂肽，該花生降脂肽釆用微波輔助酶解技術(shù)制備而得，該制備方法包括如下步驟：
前處理的步驟：
將花生加水潤濕，在121℃下蒸煮15min，冷卻，粉碎攪拌，制成花生泥；
蛋白質(zhì)改性的步驟：
稱取花生泥，按照固液比1:10加入堿液，然后調(diào)ph值至8.2-8.5，在45-55℃下，微波處理10分鐘，之后保溫20min，ph值保持在8.5以下，離心，取上層清液，加入酸液，調(diào)ph值至4-4.5，微波處理10分鐘，之后保溫20min，ph值保持在4.5以下，離心，取下層沉淀，溶解，得到改性花生蛋白溶液；堿液為3mol/lnaoh；酸液為3mol/l檸檬酸。微波的頻率為1800mhz，功率為10kw。
一次酶解的步驟：
以改性花生蛋白溶為底物，用鹽酸調(diào)ph值至7.5，按照底物質(zhì)量百分比為0.5-0.8％加入自制蛋白酶拌勻，然后在55℃下，微波處理20分鐘，ph值保持在7.5以下；微波的頻率為1800mhz，功率為10kw。
二次酶解的步驟：
經(jīng)過第一次酶解處理后，將第一次酶解液降至常溫，再次調(diào)節(jié)ph值至7.5，按照底物質(zhì)量百分比為0.8-1.2％加入自制蛋白酶拌勻，在55℃下，微波處理20分鐘，ph值保持在7.5以下，酶解結(jié)束；微波的頻率為1800mhz，功率為10kw。
在一、二次酶解的步驟中，自制蛋白酶為由花生粕作為基礎(chǔ)培養(yǎng)基誘導(dǎo)米曲霉分泌的復(fù)合蛋白酶。自制蛋白酶的活力為4.5×105u/g。復(fù)合蛋白酶的制作過程如下：過80目篩的麩皮20g，過80目花生粕粉8.0g，面粉2.5g、氯化鈣0.028g混入30g純凈水中，裝入三角瓶，加塞扎口后于濕熱滅菌鍋中在121℃下滅菌30min，取出后趁熱搖散培養(yǎng)基熟料，自然冷卻至室溫；然后從米曲霉試管菌種中接種到三角瓶培養(yǎng)基中，30℃恒溫培養(yǎng)，每天搖瓶一次，54h結(jié)束培養(yǎng)；采用ph值為7.0的0.2m磷酸鹽緩沖液在40℃下攪拌1h提取蛋白酶；4℃下離心30min，收集上清液，濃縮冷凍干燥后即得復(fù)合蛋白酶。
蛋白質(zhì)酶解是指蛋白質(zhì)在蛋白酶的作用下降解成肽或者氨基酸的過程。酶解是改造蛋白質(zhì)，提高蛋白質(zhì)價值的最有效途徑之一。但不同的蛋白酶作用相同的蛋白源，獲得的蛋白酶解液產(chǎn)物的特性相差甚遠(yuǎn)，這是因?yàn)椴煌牡鞍酌妇哂胁煌拇呋瘷C(jī)制和蛋白酶功能基團(tuán)。
花生含有大量的碳水化合物，其中有部分水溶性多糖，這些多糖會與花生蛋白發(fā)生蛋白-多糖接枝反應(yīng)，生成聚合物，降低蛋白酶與蛋白質(zhì)的接觸機(jī)率，降低酶解效率；同時水不溶性纖維容易吸收膨脹，減少水解體系中的溶劑，增加黏度，除了會降低蛋白酶與蛋白質(zhì)的接觸幾率，還會因黏度過高而降低體系中的氧含量，增加感染微生物的可能，從而影響酶解效果。
本發(fā)明在制備自制蛋白酶的過程中，花生粕作為氮源促進(jìn)米曲霉的生長，米曲霉不能直接利用花生粕中的蛋白質(zhì)，必須分泌出蛋白酶將蛋白質(zhì)降解成小分子肽或氨基酸才能吸收利用，在米曲霉生長過程中，為了從培養(yǎng)基中獲取營養(yǎng)，米曲霉除了會分泌蛋白酶外，還會分泌一系列其他的酶，如糖化酶和纖維素酶。
在花生水解的過程中，蛋白酶、糖化酶和纖維素酶會將結(jié)合在蛋白上面的多糖水解成寡糖或單糖，從蛋白質(zhì)中分離開來，還會將體系中的纖維素水解成多糖或寡糖，降低體系的黏度，加速蛋白質(zhì)水解的進(jìn)行。可見，本發(fā)明采用由花生粕作為基礎(chǔ)培養(yǎng)基誘導(dǎo)米曲霉分泌的復(fù)合蛋白酶進(jìn)行酶解同時配合微波進(jìn)行輔助酶解，使花生水解產(chǎn)物的水解度和肽得率都較高，而且酶解得到的花生多肽的分子量介于3000-6000da，具有降脂作用。
滅酶的步驟：
酶解結(jié)束后再次啟動微波加溫至90℃，維持10min，得到滅酶水解液；
分離純化的步驟：
將滅酶活的水解液降至室溫，采用sephadexg-15凝膠過濾色譜分離純化滅酶活的水解液；分離純化的步驟具體如下：用去離子水平衡凝膠層析柱，柱子尺寸為1.6cm×70cm，填料為葡聚糖凝膠樹脂sephadexg-15，流速為1.0ml/min；將滅酶活的水解液溶于去離子水配置成20mg/ml的溶液，2ml上柱，用去離子水進(jìn)行洗脫，洗脫流速為2ml/min，并用分步收集器收集洗脫液，4ml/管，于214nm下檢測吸光值，將屬于同一峰的收集液混合，然后進(jìn)行濃縮。
凝膠過濾色譜是利用具網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的凝膠的分子篩作用，據(jù)被分離物的分子量大小不同來進(jìn)行分離。當(dāng)混合肽溶液通過凝膠柱時，由于凝膠含有大量微孔，只允許緩沖液和相對分子質(zhì)量較小的肽進(jìn)入其中，而相對分子質(zhì)量較大的肽卻被排阻在凝膠顆粒外部，在填料間隙中流動，比相對分子質(zhì)量較小的肽更早地被洗脫下來，待分離的肽組分就按不同相對分子質(zhì)量被篩分開來。
由本發(fā)明sephadexg-15凝膠層析過濾色譜分離純化得到的花生蛋白多肽的分子量介于3000-6000da，該花生蛋白多肽組分降脂作用強(qiáng)，研究發(fā)現(xiàn)，并非肽分子量越小或越大其降脂活性越強(qiáng)，肽的活性也受其氨基酸的組成、排序或肽的空間結(jié)構(gòu)等因素的影響，由本發(fā)明純化得到的分子量介于3000-6000da花生蛋白多肽其降脂活性最強(qiáng)。另外，本發(fā)明的分離條件溫和、樣品回收率高、實(shí)驗(yàn)結(jié)果重現(xiàn)性高、設(shè)備簡便經(jīng)濟(jì)。
高壓蒸汽滅菌的步驟：
經(jīng)分離純化的水解液在溫度為121℃，壓力為0.1mpa的條件下高壓蒸汽滅菌15min；殺菌處理是肽類物質(zhì)在加工過程中的關(guān)鍵環(huán)節(jié)，恰當(dāng)?shù)臍⒕に嚥粌H能殺滅微生物、鈍化酶的活性，延長肽類物質(zhì)的保質(zhì)時間，另外，還能生成一些特殊的活性物質(zhì)，對降脂作用有一定輔助作用。
濃縮干燥的步驟：
將高壓蒸汽滅菌后的水解液調(diào)ph值至7.0，進(jìn)行濃縮低溫真空干燥，即得花生降脂肽。
一種復(fù)方花生蛋白多肽酒的制備方法，由如上的花生蛋白多肽釀制而成。包括如下步驟：
輔料中藥浸提液的步驟：
取山楂，加入10倍量80℃的純凈水浸泡1h，煮沸1.5h，過濾，濾渣加入8倍量純凈水再次煮沸1h，用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀減壓濃縮至稠膏，備用；
勾兌的步驟：
以濃度為35％米酒為基液，加入40-45％基酒重量的花生蛋白多肽以及5-8％基酒重量的山楂稠膏，攪拌均勻，并密封儲存2個月；
雙頻超波陳化的步驟：
在兩種超波頻率條件下進(jìn)行輪流超波陳化處理，第一種超波條件：300w、35khz的超波15min；第二種超波條件：300w、45khz的超波15min；共超聲2h；
調(diào)配檢驗(yàn)的步驟：
調(diào)整酒精濃度和糖度，儲藏，確保酒體清亮透明；然后檢驗(yàn)合格后灌裝，即得復(fù)方花生蛋白多肽酒。
本發(fā)明的多肽酒的檢測指標(biāo)包括企標(biāo)感官與理化指標(biāo)，如表1-2：
表1感官要求
表2檢驗(yàn)理化指標(biāo)
山楂為薔薇科植物山楂的干燥成熟果實(shí)。味酸甘，性微溫。山楂果實(shí)含山楂酸、蘋果酸、枸櫞酸、咖啡酸、內(nèi)脂、脂肪、金絲桃苷、解脂酶、鞣質(zhì)、蛋白質(zhì)、槲皮素、核黃素、胡蘿卜素、糖類及維生素類等多種成分。經(jīng)臨床研究證實(shí)，山楂能夠顯著地降低血脂和膽固醇、抗脂質(zhì)過氧化，有效地防治動脈粥樣硬化?；ㄉ鞍锥嚯呐c山楂均有降脂的作用，本發(fā)明以花生蛋白多肽為主要添加的降脂成分，山楂為輔助添加的降脂成分，兩者配合使用，能夠起到協(xié)同增效的作用。
另外，超波陳化采用雙頻條件下進(jìn)行陳化，由于雙頻率的超聲波使酒液內(nèi)部出現(xiàn)兩種波的加強(qiáng)點(diǎn)和減弱點(diǎn)，在兩種不同波的減弱點(diǎn)處，由于其相對壓力較小，因此容易形成不同微小的氣泡，而當(dāng)這些氣泡運(yùn)動到兩種不同波的加強(qiáng)點(diǎn)時，由于壓力較大，而使這些氣泡破裂。在氣泡的生成和破裂過程中產(chǎn)生了兩種巨大的能量，加速了酒液中各成分分子健的斷裂和生成，提高了分子間的有效碰撞率，增強(qiáng)了極性分子間的親合力，不僅增強(qiáng)了酒精分子與水分子之間的締合度，而且可能形成更大且牢固的極性分子間的締合群，從而使酒液中醇類、醛類、酸類以及酯類獲得巨大的能量，加速發(fā)生聚合、醛化、酸化、酯化以及裂解等一系列復(fù)雜反應(yīng)，令體系中的酯類分子產(chǎn)生，某些酯類及酸類等成分也可能奉與這種締合群，加速酒液的熟化，使酒在香氣、口感上都能更加上乘。
實(shí)施例1
一種花生蛋白多肽，為分子量介于3000-6000da的花生降脂肽，該花生降脂肽釆用微波輔助酶解技術(shù)制備而得，該制備方法包括如下步驟：
前處理的步驟：
將花生加水潤濕，在121℃下蒸煮15min，冷卻，粉碎攪拌，制成花生泥；
蛋白質(zhì)改性的步驟：
稱取花生泥，按照固液比1:10加入堿液，然后調(diào)ph值至8.3，在45-55℃下，微波處理10分鐘，之后保溫20min，ph值保持在8.5以下，離心，取上層清液，加入酸液，調(diào)ph值至4.3，微波處理10分鐘，之后保溫20min，ph值保持在4.5以下，離心，取下層沉淀，溶解，得到改性花生蛋白溶液；堿液為3mol/lnaoh；酸液為3mol/l檸檬酸。微波的頻率為1800mhz，功率為10kw。
一次酶解的步驟：
以改性花生蛋白溶為底物，用鹽酸調(diào)ph值至7.5，按照底物質(zhì)量百分比為0.5-0.8％加入自制蛋白酶拌勻，然后在55℃下，微波處理20分鐘，ph值保持在7.5以下；微波的頻率為1800mhz，功率為10kw。
二次酶解的步驟：
經(jīng)過第一次酶解處理后，將第一次酶解液降至常溫，再次調(diào)節(jié)ph值至7.5，按照底物質(zhì)量百分比為0.8-1.2％加入自制蛋白酶拌勻，在55℃下，微波處理20分鐘，ph值保持在7.5以下，酶解結(jié)束；微波的頻率為1800mhz，功率為10kw。
在一、二次酶解的步驟中，自制蛋白酶為由花生粕作為基礎(chǔ)培養(yǎng)基誘導(dǎo)米曲霉分泌的復(fù)合蛋白酶。自制蛋白酶的活力為4.5×105u/g。復(fù)合蛋白酶的制作過程如下：過80目篩的麩皮20g，過80目花生粕粉8.0g，面粉2.5g、氯化鈣0.028g混入30g純凈水中，裝入三角瓶，加塞扎口后于濕熱滅菌鍋中在121℃下滅菌30min，取出后趁熱搖散培養(yǎng)基熟料，自然冷卻至室溫；然后從米曲霉試管菌種中接種到三角瓶培養(yǎng)基中，30℃恒溫培養(yǎng)，每天搖瓶一次，54h結(jié)束培養(yǎng)；采用ph值為7.0的0.2m磷酸鹽緩沖液在40℃下攪拌1h提取蛋白酶；4℃下離心30min，收集上清液，濃縮冷凍干燥后即得復(fù)合蛋白酶。
滅酶的步驟：
酶解結(jié)束后再次啟動微波加溫至90℃，維持10min，得到滅酶水解液；
分離純化的步驟：
將滅酶活的水解液降至室溫，采用sephadexg-15凝膠過濾色譜分離純化滅酶活的水解液；分離純化的步驟具體如下：用去離子水平衡凝膠層析柱，柱子尺寸為1.6cm×70cm，填料為葡聚糖凝膠樹脂sephadexg-15，流速為1.0ml/min；將滅酶活的水解液溶于去離子水配置成20mg/ml的溶液，2ml上柱，用去離子水進(jìn)行洗脫，洗脫流速為2ml/min，并用分步收集器收集洗脫液，4ml/管，于214nm下檢測吸光值，將屬于同一峰的收集液混合，然后進(jìn)行濃縮。
高壓蒸汽滅菌的步驟：
經(jīng)分離純化的水解液在溫度為121℃，壓力為0.1mpa的條件下高壓蒸汽滅菌15min；
濃縮干燥的步驟：
將高壓蒸汽滅菌后的水解液調(diào)ph值至7.0，進(jìn)行濃縮低溫真空干燥，即得花生降脂肽。
實(shí)施例2
一種花生蛋白多肽，為分子量介于3000-6000da的花生降脂肽，該花生降脂肽釆用微波輔助酶解技術(shù)制備而得，該制備方法包括如下步驟：
前處理的步驟：
將花生加水潤濕，在121℃下蒸煮15min，冷卻，粉碎攪拌，制成花生泥；
蛋白質(zhì)改性的步驟：
稱取花生泥，按照固液比1:10加入堿液，然后調(diào)ph值至8.2，在45-55℃下，微波處理10分鐘，之后保溫20min，ph值保持在8.5以下，離心，取上層清液，加入酸液，調(diào)ph值至4，微波處理10分鐘，之后保溫20min，ph值保持在4.5以下，離心，取下層沉淀，溶解，得到改性花生蛋白溶液；
一次酶解的步驟：
以改性花生蛋白溶為底物，用鹽酸調(diào)ph值至7.5，按照底物質(zhì)量百分比為0.5-0.8％加入自制蛋白酶拌勻，然后在55℃下，微波處理20分鐘，ph值保持在7.5以下；
二次酶解的步驟：
經(jīng)過第一次酶解處理后，將第一次酶解液降至常溫，再次調(diào)節(jié)ph值至7.5，按照底物質(zhì)量百分比為0.8-1.2％加入自制蛋白酶拌勻，在55℃下，微波處理20分鐘，ph值保持在7.5以下，酶解結(jié)束；
滅酶的步驟：
酶解結(jié)束后再次啟動微波加溫至90℃，維持10min，得到滅酶水解液；
分離純化的步驟：
將滅酶活的水解液降至室溫，調(diào)ph值至7.5，采用sephadexg-15凝膠過濾色譜分離純化滅酶活的水解液；
高壓蒸汽滅菌的步驟：
經(jīng)分離純化的水解液在溫度為121℃，壓力為0.1mpa的條件下高壓蒸汽滅菌15min；
濃縮干燥的步驟：
將高壓蒸汽滅菌后的水解液調(diào)ph值至7.0，進(jìn)行濃縮低溫真空干燥，即得花生降脂肽。
實(shí)施例3
一種花生蛋白多肽，為分子量介于3000-6000da的花生降脂肽，該花生降脂肽釆用微波輔助酶解技術(shù)制備而得，該制備方法包括如下步驟：
前處理的步驟：
將花生加水潤濕，在121℃下蒸煮15min，冷卻，粉碎攪拌，制成花生泥；
蛋白質(zhì)改性的步驟：
稱取花生泥，按照固液比1:10加入堿液，然后調(diào)ph值至8.5，在45-55℃下，微波處理10分鐘，之后保溫20min，ph值保持在8.5以下，離心，取上層清液，加入酸液，調(diào)ph值至4.5，微波處理10分鐘，之后保溫20min，ph值保持在4.5以下，離心，取下層沉淀，溶解，得到改性花生蛋白溶液；
一次酶解的步驟：
以改性花生蛋白溶為底物，用鹽酸調(diào)ph值至7.5，按照底物質(zhì)量百分比為0.5-0.8％加入自制蛋白酶拌勻，然后在55℃下，微波處理20分鐘，ph值保持在7.5以下；
二次酶解的步驟：
經(jīng)過第一次酶解處理后，將第一次酶解液降至常溫，再次調(diào)節(jié)ph值至7.5，按照底物質(zhì)量百分比為0.8-1.2％加入自制蛋白酶拌勻，在55℃下，微波處理20分鐘，ph值保持在7.5以下，酶解結(jié)束；
滅酶的步驟：
酶解結(jié)束后再次啟動微波加溫至90℃，維持10min，得到滅酶水解液；
分離純化的步驟：
將滅酶活的水解液降至室溫，調(diào)ph值至8.0，采用sephadexg-15凝膠過濾色譜分離純化滅酶活的水解液；
高壓蒸汽滅菌的步驟：
經(jīng)分離純化的水解液在溫度為121℃，壓力為0.1mpa的條件下高壓蒸汽滅菌15min；
濃縮干燥的步驟：
將高壓蒸汽滅菌后的水解液調(diào)ph值至7.0，進(jìn)行濃縮低溫真空干燥，即得花生降脂肽。
對比例1
與實(shí)施例1的區(qū)別在于在一、二次酶解中，不采用本發(fā)明的自制蛋白酶，而選用現(xiàn)有的木瓜蛋白酶，木瓜蛋白酶的活力為4.5×105u/g。
對比例2
與實(shí)施例1的區(qū)別在于去除分離純化的步驟，其余步驟與參數(shù)相同。
實(shí)施例4
一種復(fù)方花生蛋白多肽酒，由如下步驟制成：
輔料中藥浸提液的步驟：
取山楂，加入10倍量80℃的純凈水浸泡1h，煮沸1.5h，過濾，濾渣加入8倍量純凈水再次煮沸1h，用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀減壓濃縮至稠膏，備用；
勾兌的步驟：
以濃度為35％米酒為基液，加入40-45％基酒重量的花生蛋白多肽以及5-8％基酒重量的山楂稠膏，攪拌均勻，并密封儲存2個月；
雙頻超波陳化的步驟：
在兩種超波頻率條件下進(jìn)行輪流超波陳化處理，第一種超波條件：300w、35khz的超波15min；第二種超波條件：300w、45khz的超波15min；共超聲2h；
調(diào)配檢驗(yàn)的步驟：
調(diào)整酒精濃度和糖度，儲藏，確保酒體清亮透明；然后檢驗(yàn)合格后灌裝，即得復(fù)方花生蛋白多肽酒。
對比例3
與實(shí)施例4的區(qū)別在于去除輔料中藥浸提液的步驟，不添加山楂稠膏，其余步驟與參數(shù)相同。
對比例4
與實(shí)施例4的區(qū)別在于去除雙頻超波陳化的步驟，其余步驟與參數(shù)相同。
下面，對本發(fā)明制備的花生降脂肽的肽得率、純度以及降脂作用進(jìn)行測定與驗(yàn)證。
1、肽得率的測定
采用三氯乙酸(tca)沉淀法與甲醛滴定法相結(jié)合進(jìn)行測定。取10ml酶解液加10ml20％(g/g)tca，攪勻靜置半小時后在4800r/min下離心10min，所得的上清液記作上清液tca，分別用凱氏定氮法和甲醛滴定法測定上清液中的總氮含量和氨態(tài)氮含量，則肽氮量和肽得率按下式進(jìn)行計算，結(jié)果如表3：
上清液總肽氮量＝上清液tca總氮量－上清液tca總氨態(tài)氮量，
肽得率＝上清液總肽氮含量/原料總蛋白氮含量×100％。
2、純度的測定
以牛血清白蛋白(bsa)為標(biāo)準(zhǔn)品，制成不同濃度的bsa溶液。向7支試管中分別加入5ml考馬斯亮藍(lán)染色溶液染色5min。以第1支試管中的溶液為空白對照，測定其余6支試管中溶液在595nm處的吸光度。以蛋白質(zhì)質(zhì)量濃度(g·l-1)為橫坐標(biāo)，吸光度為縱坐標(biāo)，進(jìn)行線性回歸分析。得到的線性回歸方程為y＝8.714x+0.025(r＝0.998)，線性范圍為0-100μg。結(jié)果表明，線性關(guān)系良好，可以用來進(jìn)行蛋白質(zhì)含量的測定。分別吸取實(shí)施例1-3所得的花生蛋白多肽作為供試品，在595nm處測定吸光度，并根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計算蛋白質(zhì)含量，計算蛋白質(zhì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)/％，結(jié)果如表3。
3、降脂作用的驗(yàn)證
膽固醇是人體血液中血脂的重要組成之一，以降膽固醇活性為指標(biāo)，觀察本發(fā)明花生降脂肽對三種膽酸鹽的影響，對三種膽酸鹽的抑制率越高，降膽固醇活性越高，結(jié)果如表3。
本實(shí)驗(yàn)采用糠醛顯色法測定反應(yīng)過程中花生降脂肽對膽酸鹽的絡(luò)合作用，以花生降脂肽對膽酸鹽、脫氧膽酸鹽以及?；悄懰猁}三種膽酸鹽的吸附能力為指標(biāo)，評價花生降脂肽的降膽固醇活性。
采用糠醛顯色法測定三種膽酸鹽的含量，分別取三種膽酸鹽標(biāo)準(zhǔn)溶液，加入40％硫酸溶液，振蕩，加入1％糠醛溶液1ml，混勻，60℃溫育40min，待溫度降到室溫后，于620nm波長處測吸光值，以濃度為橫坐標(biāo)，吸光值為縱坐標(biāo)，繪制三條標(biāo)準(zhǔn)曲線。取實(shí)施例1-6的制品2ml，按照糠醛顯色法測其吸光度，由標(biāo)準(zhǔn)曲線計算上清液中三種膽酸鹽濃度。計算公式如下：
抑制率(％)＝(p1-p2)/p1×100％
式中：p1分別為三種膽酸鹽溶液的初始質(zhì)量濃度(mg/ml)
p2為吸附后三種膽酸鹽溶液的質(zhì)量濃度(mg/ml)
表3花生降脂肽的肽得率、純度以及降脂效果
本發(fā)明實(shí)施例1-3制備的花生降脂肽的肽得率高，純度高，可以作為添加劑或活性藥物添加至到人類食品、醫(yī)藥、保健品等多種行業(yè)和領(lǐng)域，無疑對延長花生產(chǎn)業(yè)鏈，全面提高花生產(chǎn)業(yè)綜合效益，實(shí)現(xiàn)農(nóng)業(yè)增效農(nóng)民增收農(nóng)村繁榮，對推動一帶一路建設(shè)有重大意義。而對比例1-2制備的花生降脂肽的肽得率與本發(fā)明相比具有較大差異，說明本發(fā)明的自制蛋白酶以及分離純化的步驟對整個肽得率高，純度高影響較大。
實(shí)施例4與5的數(shù)據(jù)說明，本發(fā)明花生蛋白多肽與山楂兩者配合使用，能夠起到協(xié)同增效的作用。不添加山楂，其抑制率會下降將近15％以上，也就是說其降脂效果也會下降；另外，實(shí)施例4與6的數(shù)據(jù)說明，本花生蛋白多肽與山楂兩者的協(xié)同增效作用跟雙頻超波陳化的步驟有關(guān)，去除雙頻超波陳化的步驟，其降脂效果也會下降。
上述實(shí)施方式僅為本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方式，不能以此來限定本發(fā)明保護(hù)的范圍，本領(lǐng)域的技術(shù)人員在本發(fā)明的基礎(chǔ)上所做的任何非實(shí)質(zhì)性的變化及替換均屬于本發(fā)明所要求保護(hù)的范圍。