本發(fā)明屬于生物工程技術(shù)領(lǐng)域，特別涉及一種利用發(fā)酵調(diào)控手段以提高d-乳酸生產(chǎn)效率的方法。

背景技術(shù)：

乳酸是世界三大有機(jī)酸之一，它可以廣泛的用于食品、醫(yī)藥、化工和農(nóng)業(yè)等領(lǐng)域。特別的d-乳酸可以廣泛的應(yīng)用于醫(yī)藥、化工和農(nóng)業(yè)領(lǐng)域。以d-乳酸為單體合成的聚乳酸以其良好的生物可降解性能及其他優(yōu)良的使用特性(如透明性、熱塑性、產(chǎn)物安全性等)已成為21世紀(jì)最具發(fā)展前景的綠色環(huán)保材料。此外以高純的d-乳酸制造的生物農(nóng)藥“驃馬”和“威霸”等除草劑，作為新型的低毒性農(nóng)藥，能夠有效的除草殺蟲既經(jīng)濟(jì)又可靠。市場上，同等級的d-乳酸價(jià)格比l-乳酸貴5～10倍。因此d-乳酸的生產(chǎn)和純化逐漸受到重視。

乳酸的制備方法有發(fā)酵法、化學(xué)合成法和酶法。其中，發(fā)酵法和化學(xué)合成法得到工業(yè)上的應(yīng)用，而我國主要采用發(fā)酵法。與l-乳酸相比，目前d-乳酸在發(fā)酵菌種的多樣性以及發(fā)酵水平方面仍然具有較大的差距，因此進(jìn)一步改善d-乳酸的生產(chǎn)菌種、提高菌種的發(fā)酵性能對于推動d-乳酸工業(yè)的發(fā)酵及擴(kuò)大d-乳酸應(yīng)用具有重要意義。

在d-乳酸菌種發(fā)酵產(chǎn)酸過程中，由于有主產(chǎn)物乳酸的不斷產(chǎn)生發(fā)酵罐內(nèi)的ph會逐漸降低，為了維持菌體生長的最適ph，在發(fā)酵過程中需要通過不斷補(bǔ)堿來維持ph，隨著發(fā)酵過程中堿的不斷流入，發(fā)酵液中的金屬離子濃度的不斷升高必然導(dǎo)致滲透壓的升高，過高的滲透壓將影響菌體的生長和產(chǎn)酸。而滲透壓保護(hù)劑比如甜菜堿、海藻糖、脯氨酸、甘氨酸等滲透壓保護(hù)劑能夠很好的緩解環(huán)境中滲透壓過高的問題，因此發(fā)酵過程中添加適當(dāng)?shù)臐B透壓保護(hù)劑，從而提高了生產(chǎn)強(qiáng)度。專利文件cn101457243公開了一種提高l-谷氨酸發(fā)酵產(chǎn)率的新工藝，

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：
主要是在發(fā)酵培養(yǎng)基中添加了甜菜堿、脯氨酸的方法，來有效提高l-谷氨酸的發(fā)酵產(chǎn)率。目前還未見國內(nèi)外利用滲透壓保護(hù)劑應(yīng)用于d-乳酸的發(fā)酵生產(chǎn)中。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的是針對現(xiàn)有技術(shù)的缺陷，提供一種可提高d-乳酸生產(chǎn)強(qiáng)度 的d-乳酸生產(chǎn)方法。

為了實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用以下技術(shù)方案：一種可提高d-乳酸生產(chǎn)強(qiáng)度的d-乳酸生產(chǎn)方法，包括以下步驟：

(1)平板培養(yǎng)：將芽孢桿菌bs1-5接種至平板培養(yǎng)基厭氧培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度30～45℃，培養(yǎng)時(shí)間20～48h；

(2)種子培養(yǎng)：將經(jīng)步驟(1)平板培養(yǎng)的的芽孢桿菌接種至種子培養(yǎng)基厭氧培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度30～45℃，培養(yǎng)時(shí)間12～24h；

(3)發(fā)酵產(chǎn)酸：將步驟(2)獲得的種子培養(yǎng)液接種至發(fā)酵培養(yǎng)基中進(jìn)行發(fā)酵產(chǎn)酸，接種量為3％～15％，發(fā)酵溫度30～45℃，通入氮?dú)獗３制鋮捬醯沫h(huán)境，采用中和劑將發(fā)酵體系的ph控制在4.5～7.0，加入滲透壓保護(hù)劑控制發(fā)酵罐內(nèi)滲透壓的提高。

所述平板培養(yǎng)基包括以下組分：葡萄糖10～30g/l，酵母膏1～3g/l，無水乙酸鈉1～4g/l，無水硫酸鎂0.1～0.4g/l，磷酸二氫鉀1～3g/l，瓊脂15～25g/l。

所述種子培養(yǎng)基包括以下組分：葡萄糖10～40g/l，酵母膏1～3g/l，蛋白胨1～3g/l，無水硫酸鎂0.1～0.4g/l，碳酸鈣10～30g/l。

所述發(fā)酵培養(yǎng)基包括以下組分：葡萄糖150～180g/l，酵母膏4～8g/l，玉米漿干粉4～6g/l，硫酸鎂0.4～0.6g/l，麩皮8～12g/l。

所述滲透壓保護(hù)劑甜菜堿、海藻糖、脯氨酸或甘氨酸，在d-乳酸發(fā)酵起始時(shí)或發(fā)酵過程中添加到發(fā)酵罐內(nèi)，添加量為0.2～5g/l。

本發(fā)明所使用的菌種為一株高生長產(chǎn)酸速率的d-乳酸生產(chǎn)菌，已于2012年12月6日保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心(中國，武漢，武漢大學(xué))，其分類命名為芽孢乳桿菌(sporolactobacillussp.)bs1-5，保藏登記號為cctccno.m2012516，其更具體分類為菊糖芽孢乳桿菌(sporolactobacillussp.inulinus)。

本發(fā)明提高d-乳酸發(fā)酵生產(chǎn)強(qiáng)度的方法主要為在d-乳酸發(fā)酵開始時(shí)或發(fā)酵中添加少量滲透壓保護(hù)劑在發(fā)酵培養(yǎng)基中以緩解由于金屬堿的不斷加入到發(fā)酵罐中帶來的滲透壓的提高，滲透壓的提高會影響d-乳酸菌種的生長與產(chǎn)酸。滲透壓保護(hù)劑的加入，菌體密度有一定的提高，同時(shí)較大幅度的縮短發(fā)酵周期。其原理是：根據(jù)微生物厭氧發(fā)酵產(chǎn)d-乳酸的特性，在發(fā)酵體系中添加了適量的滲透壓保護(hù)劑，而這些保護(hù)劑大都是親水性的物質(zhì)，他們能夠進(jìn)入細(xì)胞，維持菌 體細(xì)胞在高底物、高產(chǎn)物、和高金屬離子濃度時(shí)的滲透壓，防止菌體因滲透壓過高而失水死亡。較高的菌體量保證了d-乳酸的濃度與生產(chǎn)強(qiáng)度較大幅度的提高，從而可以降低d-乳酸生產(chǎn)過程中的能耗，提高了生產(chǎn)效率。

具體實(shí)施方式

用以下的實(shí)施例對本發(fā)明作進(jìn)一步說明，但有必要指出以下實(shí)施例只用于對發(fā)明內(nèi)容的進(jìn)一步說明，并不構(gòu)成對本發(fā)明保護(hù)范圍的限制。

實(shí)施例1

(1)平板培養(yǎng)：將芽孢桿菌bs1-5接種至平板培養(yǎng)基厭氧培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度30℃，培養(yǎng)時(shí)間48h；

(2)種子培養(yǎng)：將經(jīng)步驟(1)平板培養(yǎng)的的芽孢桿菌接種至種子培養(yǎng)基厭氧培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度30℃，培養(yǎng)時(shí)間24h；

(3)發(fā)酵產(chǎn)酸：將步驟(2)獲得的種子培養(yǎng)液接種至發(fā)酵培養(yǎng)基中進(jìn)行發(fā)酵產(chǎn)酸，接種量為15％，發(fā)酵溫度30℃，通入氮?dú)獗３制鋮捬醯沫h(huán)境，采用中和劑將發(fā)酵體系的ph控制在6.0。

平板培養(yǎng)基成分為(g/l)：葡萄糖10，酵母膏1，無水乙酸鈉1，無水硫酸鎂0.1，磷酸二氫鉀1，瓊脂15。

種子培養(yǎng)基成分為(g/l)：葡萄糖10，酵母膏1，蛋白胨1，無水硫酸鎂0.1，碳酸鈣10。

發(fā)酵培養(yǎng)基成分為(g/l):葡萄糖150，酵母膏4，玉米漿干粉4，硫酸鎂0.4，麩皮8。

發(fā)酵產(chǎn)酸階段采用氫氧化鈉作為ph調(diào)節(jié)劑，表1為添加和未添加了滲透壓保護(hù)劑甜菜堿的實(shí)驗(yàn)結(jié)果：

表1未添加與添加甜菜堿的實(shí)驗(yàn)結(jié)果

實(shí)施例2

(1)平板培養(yǎng)：將芽孢桿菌bs1-5接種至平板培養(yǎng)基厭氧培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度45℃，培養(yǎng)時(shí)間20h；

(2)種子培養(yǎng)：將經(jīng)步驟(1)平板培養(yǎng)的的芽孢桿菌接種至種子培養(yǎng)基厭氧培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度45℃，培養(yǎng)時(shí)間12h；

(3)發(fā)酵產(chǎn)酸：將步驟(2)獲得的種子培養(yǎng)液接種至發(fā)酵培養(yǎng)基中進(jìn)行發(fā)酵產(chǎn)酸，接種量為3％，發(fā)酵溫度45℃，通入氮?dú)獗３制鋮捬醯沫h(huán)境，采用中和劑將發(fā)酵體系的ph控制在7.0。

平板培養(yǎng)基成分為(g/l)：葡萄糖30，酵母膏3，無水乙酸鈉4，無水硫酸鎂0.4，磷酸二氫鉀3，瓊脂25。

種子培養(yǎng)基成分為(g/l)：葡萄糖40，酵母膏3，蛋白胨3，無水硫酸鎂0.4，碳酸鈣30.

發(fā)酵培養(yǎng)基成分為(g/l):葡萄糖150，酵母膏8，玉米漿干粉6，硫酸鎂0.6，麩皮12。

發(fā)酵產(chǎn)酸階段采用氫氧化鈉作為ph調(diào)節(jié)劑，滲透壓保護(hù)劑為甜菜堿，下表為添加和未添加了滲透壓保護(hù)劑的實(shí)驗(yàn)結(jié)果：

表2未添加與添加甜菜堿的實(shí)驗(yàn)結(jié)果

實(shí)施例3

(1)平板培養(yǎng)：將芽孢桿菌bs1-5接種至平板培養(yǎng)基厭氧培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度37℃，培養(yǎng)時(shí)間24h；

(2)種子培養(yǎng)：將經(jīng)步驟(1)平板培養(yǎng)的的芽孢桿菌接種至種子培養(yǎng)基厭氧培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度37℃，培養(yǎng)時(shí)間20h；

(3)發(fā)酵產(chǎn)酸：將步驟(2)獲得的種子培養(yǎng)液接種至發(fā)酵培養(yǎng)基中進(jìn)行發(fā)酵產(chǎn)酸，接種量為10％，發(fā)酵溫度37℃，通入氮?dú)獗３制鋮捬醯沫h(huán)境，采用中和劑將發(fā)酵體系的ph控制在6.5。

平板培養(yǎng)基成分為(g/l)：葡萄糖20，酵母膏2，無水乙酸鈉2，無水硫酸鎂0.3，磷酸二氫鉀2，瓊脂20。

種子培養(yǎng)基成分為(g/l)：葡萄糖20，酵母膏2，蛋白胨2，無水硫酸鎂0.3，碳酸鈣20。

發(fā)酵培養(yǎng)基成分為(g/l):葡萄糖150，酵母膏6，玉米漿干粉5，硫酸鎂0.5，麩皮10。

發(fā)酵產(chǎn)酸階段采用氫氧化鈉作為ph調(diào)節(jié)劑，滲透壓保護(hù)劑為甜菜堿、海藻糖、脯氨酸或甘氨酸，下表3、4、5、6為添加和未添加了滲透壓保護(hù)劑的實(shí)驗(yàn)結(jié)果：

表3未添加與添加甜菜堿的實(shí)驗(yàn)結(jié)果

表4未添加與添加甘氨酸的實(shí)驗(yàn)結(jié)果

表5未添加與添加海藻糖的實(shí)驗(yàn)結(jié)果

表6未添加與添加脯氨酸的實(shí)驗(yàn)結(jié)果

實(shí)施例4

(1)平板培養(yǎng)：將芽孢桿菌bs1-5接種至平板培養(yǎng)基厭氧培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度37℃，培養(yǎng)時(shí)間24h；

(2)種子培養(yǎng)：將經(jīng)步驟(1)平板培養(yǎng)的的芽孢桿菌接種至種子培養(yǎng)基厭氧培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度37℃，培養(yǎng)時(shí)間20h；

(3)發(fā)酵產(chǎn)酸：將步驟(2)獲得的種子培養(yǎng)液接種至發(fā)酵培養(yǎng)基中進(jìn)行發(fā)酵產(chǎn)酸，接種量為10％，發(fā)酵溫度37℃，通入氮?dú)獗３制鋮捬醯沫h(huán)境，采用中和劑將發(fā)酵體系的ph控制在6.5。

平板培養(yǎng)基成分為(g/l)：葡萄糖20，酵母膏2，無水乙酸鈉2，無水硫酸鎂0.3，磷酸二氫鉀2，瓊脂20。

種子培養(yǎng)基成分為(g/l)：葡萄糖20，酵母膏2，蛋白胨2，無水硫酸鎂0.3，碳酸鈣20。

發(fā)酵培養(yǎng)基成分為(g/l):葡萄糖160，酵母膏6，玉米漿干粉5，硫酸鎂0.5，麩皮10。

發(fā)酵產(chǎn)酸階段采用氨水作為ph調(diào)節(jié)劑，滲透壓保護(hù)劑為海藻糖，下表為添加和未添加了滲透壓保護(hù)劑的實(shí)驗(yàn)結(jié)果：

表7未添加與添加海藻糖的實(shí)驗(yàn)結(jié)果

實(shí)施例5

(1)平板培養(yǎng)：將芽孢桿菌bs1-5接種至平板培養(yǎng)基厭氧培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度37℃，培養(yǎng)時(shí)間24h；

(2)種子培養(yǎng)：將經(jīng)步驟(1)平板培養(yǎng)的的芽孢桿菌接種至種子培養(yǎng)基厭氧培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度37℃，培養(yǎng)時(shí)間20h；

(3)發(fā)酵產(chǎn)酸：將步驟(2)獲得的種子培養(yǎng)液接種至發(fā)酵培養(yǎng)基中進(jìn)行發(fā)酵產(chǎn)酸，接種量為10％，發(fā)酵溫度37℃，通入氮?dú)獗３制鋮捬醯沫h(huán)境，采用中和劑將發(fā)酵體系的ph控制在6.5。

平板培養(yǎng)基成分為(g/l)：葡萄糖20，酵母膏2，無水乙酸鈉2，無水硫酸鎂0.3，磷酸二氫鉀2，瓊脂20。

種子培養(yǎng)基成分為(g/l)：葡萄糖20，酵母膏2，蛋白胨2，無水硫酸鎂 0.3，碳酸鈣20。

發(fā)酵培養(yǎng)基成分為(g/l):葡萄糖180，酵母膏6，玉米漿干粉5，硫酸鎂0.5，麩皮12。

發(fā)酵產(chǎn)酸階段采用氫氧化鈉作為ph調(diào)節(jié)劑，滲透壓保護(hù)劑為海藻糖，下表為添加和未添加了滲透壓保護(hù)劑的實(shí)驗(yàn)結(jié)果：

表8未添加與添加海藻糖的實(shí)驗(yàn)結(jié)果

實(shí)施例6

(1)平板培養(yǎng)：將芽孢桿菌bs1-5接種至平板培養(yǎng)基厭氧培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度37℃，培養(yǎng)時(shí)間24h；

(2)種子培養(yǎng)：將經(jīng)步驟(1)平板培養(yǎng)的的芽孢桿菌接種至種子培養(yǎng)基厭氧培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度37℃，培養(yǎng)時(shí)間20h；

(3)發(fā)酵產(chǎn)酸：將步驟(2)獲得的種子培養(yǎng)液接種至發(fā)酵培養(yǎng)基中進(jìn)行發(fā)酵產(chǎn)酸，接種量為10％，發(fā)酵溫度37℃，通入氮?dú)獗３制鋮捬醯沫h(huán)境，采用中和劑將發(fā)酵體系的ph控制在6.5。

平板培養(yǎng)基成分為(g/l)：葡萄糖20，酵母膏2，無水乙酸鈉2，無水硫酸鎂0.3，磷酸二氫鉀2，瓊脂20。

種子培養(yǎng)基成分為(g/l)：葡萄糖20，酵母膏2，蛋白胨2，無水硫酸鎂0.3，碳酸鈣20。

發(fā)酵培養(yǎng)基成分為(g/l):葡萄糖150，酵母膏6，玉米漿干粉5，硫酸鎂0.5，麩皮10。

發(fā)酵產(chǎn)酸階段采用氨水作為ph調(diào)節(jié)劑，滲透壓保護(hù)劑為甜菜堿，下表為添加和未添加了滲透壓保護(hù)劑的實(shí)驗(yàn)結(jié)果：

表9未添加與添加甜菜堿的實(shí)驗(yàn)結(jié)果