本發(fā)明涉及一株發(fā)光細菌及其在百菌清殘留檢測中的應(yīng)用，屬于微生物技術(shù)領(lǐng)域。

背景技術(shù)：

百菌清(chlorothalonil,cht)，化學(xué)名為2,4,5,6-四氯-1,3-二氰基苯，是一種廣譜保護性殺菌劑，農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中主要用于防治果蔬類真菌病害。由于百菌清對植物體具有良好的黏著性和使用的廣泛性,因此百菌清及其代謝產(chǎn)物在果蔬、土壤及水中均有較大的殘留。美國國家環(huán)境保護總署(u.s.epa)已將百菌清列為可能使人類致癌的物質(zhì)之一，其對環(huán)境和食品安全具有潛在威脅。百菌清在土壤中經(jīng)光、微生物或酶等作用后轉(zhuǎn)化為羥基百菌清，其毒性、穩(wěn)定性增加，并能溶于水，對環(huán)境和食品安全造成更為嚴重的威脅。目前百菌清的檢測方法主要有氣相色譜法和液相色譜法以及酶聯(lián)免疫法，但是這些方法在實際應(yīng)用中存在前處理復(fù)雜、儀器試劑昂貴等缺點。

發(fā)光細菌檢測法是用于有害物質(zhì)檢測的生物方法，可通過發(fā)光細菌發(fā)光強度的變化來測定有害物質(zhì)的濃度或評價其毒性，該方法具有靈敏、快速、成本低等優(yōu)點，在食品安全和環(huán)境監(jiān)測等領(lǐng)域應(yīng)用日益廣泛。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本申請的發(fā)明人擬于海水環(huán)境和海洋生物中分離篩選發(fā)光細菌，并初步應(yīng)用于果蔬污染物百菌清殘留的生物檢測，以期建立百菌清檢測的快速、簡便方法。

本發(fā)明的目的之一，是提供一株發(fā)光細菌。本發(fā)明的發(fā)光細菌fc-11-1豐富了發(fā)光細菌物種資源,是不同于已報道的11種發(fā)光細菌的新型發(fā)光菌株。

本發(fā)明解決上述技術(shù)問題的技術(shù)方案如下：一株發(fā)光細菌fc-11-1，已于2016年12月05日保藏在位于北京市朝陽區(qū)大屯路，中國科學(xué)院微生物研究所的中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(簡稱cgmcc)，保藏編號為cgmccno.13424，分類命名為vibriotoranzoniae，其具有以下特性：

(1)在暗室中發(fā)出明亮的藍綠色可見光，具有發(fā)光特性；

(2)革蘭氏陰性菌；

(3)在發(fā)光固體培養(yǎng)基上的菌落為圓形類似饅頭狀，表面光滑濕潤，邊緣整齊，超過24h后菌落周圍呈鋸齒狀；

(4)油鏡下觀察，呈桿狀或弧狀；

上述發(fā)光細菌fc-11-1的分離方法，包括以下步驟：

(1)制備培養(yǎng)基

發(fā)光細菌固體培養(yǎng)基(分離培養(yǎng)基)：甘油3ml、酵母粉5g、胰蛋白胨5g、碳酸鈣1g、瓊脂20g、陳海水1000ml，ph值7.8-8.0，121℃滅菌20分鐘；

發(fā)光細菌液體培養(yǎng)基：酵母粉5g、胰蛋白胨5g、氯化鈉30g、磷酸氫二鈉5g、磷酸二氫鉀1g、甘油3ml，ph值7.6，121℃滅菌20分鐘；

海水2216e瓊脂斜面培養(yǎng)基：蛋白胨5g、酵母粉1g、磷酸鐵0.01g、瓊脂20g、陳海水1000ml，ph值7.6，121℃滅菌20分鐘；

(2)將新鮮捕獲的海魚，于無菌環(huán)境下，用無菌3％nacl溶液沖洗魚體表雜物后，分別采集5-6片魚鱗、魚鰓、80％魚腸，然后分別放入含有玻璃珠的45ml無菌3％nacl溶液，并置于渦旋震蕩器上震蕩2-3分鐘，充分混勻后，置于無菌超凈臺；

(3)分別吸取混勻后的魚鱗、魚鰓、魚腸懸液200μl注入到海水2216e瓊脂培養(yǎng)基平板中，再用涂布棒涂布均勻，靜置1min，放入25℃培養(yǎng)箱中，倒置培養(yǎng)；

(4)用接種針挑取生長的菌落，劃線接種于發(fā)光細菌固體培養(yǎng)基平板中，放入25℃培養(yǎng)箱中，倒置培養(yǎng)，直到有菌落生成，取出；置于暗室觀察，對發(fā)出熒光的菌落做好標記，編號；

(5)用接種針挑取標記好的發(fā)光菌落，進行連續(xù)劃線接種，直到得到可在暗室發(fā)出熒光的純菌落。

上述陳海水，是從不被陸上污物污染的或很少混有淡水的地方取來的海水裝入玻璃瓶儲放在暗處數(shù)星期后形成的海水。

上述發(fā)光細菌fc-11-1的鑒定方法，包括以下步驟：

(1)觀察平板菌落的形態(tài)大小、通過革蘭氏染色觀察細胞形態(tài)；

(2)biolog鑒定

按照biolog微生物自動鑒定儀提供的操作手冊，調(diào)整接種菌懸液濁度接種至96孔gn2微孔鑒定板中，于25℃培養(yǎng)至第24小時、48小時、72小時，結(jié)合“人工”及“自動”兩種讀板模式，分別測定3次，得出鑒定結(jié)果。

(3)pcr模板的制備

將過夜培養(yǎng)的發(fā)光細菌菌懸液配制成10⁸cfu/ml(od600＝0.1)，取其中3μl轉(zhuǎn)入裝有100μl無菌雙蒸水的1.5ml離心管中，在99℃水浴10min，10000g離心10min，冷卻后取上清液作為pcr反應(yīng)模板?？蓪⑻崛〉膁na模板置于-20℃冰箱中保存。

(4)16srdnapcr擴增

發(fā)光細菌16srdnapcr擴增所用引物為細菌16srdna通用引物，上游引物27f：5’-agagtttgatcctggctcag-3’；下游引物1492r：5’-tacggttaccttgttacgactt-3’。

pcr擴增的體系(25μl)：gotaqgreenmastermix12.5μl，上游引物27f1μl，下游引物1492r1μl，模板dna2.5μl，ddh2o8μl。pcr擴增的程序為：95℃預(yù)變性3min，94℃變性1min，55℃退火1min，72℃延伸1min，30個循環(huán)，72℃延伸10min。

pcr產(chǎn)物用1.5％瓊脂糖凝膠電泳進行檢測。

(5)16srdnapcr產(chǎn)物測序及系統(tǒng)發(fā)育樹構(gòu)建

16srdnapcr產(chǎn)物經(jīng)純化后送寶生物工程(大連)有限公司測序。測序所得基因序列提交到ncbi網(wǎng)站(http://blast.ncbi.nlm.nih.gov)進行blast比對。采用mega5.05軟件以neighbor-joining統(tǒng)計方法自展1000次進行系統(tǒng)發(fā)育樹的構(gòu)建。

本發(fā)明的目的之二，是提供上述發(fā)光細菌在百菌清殘留檢測中的應(yīng)用。本發(fā)明的發(fā)光細菌fc-11-1可用于果蔬中百菌清殘留的檢測，具有成本低、操作簡單、不需要貴重或大型儀器設(shè)備等優(yōu)點。

本發(fā)明解決上述技術(shù)問題的技術(shù)方案如下：一株發(fā)光細菌在百菌清殘留檢測中的應(yīng)用。

本發(fā)明的目的之三，是提供一種百菌清殘留檢測的方法。本發(fā)明的檢測方法，具有反應(yīng)靈敏、成本低、操作簡單、不需要大型貴重儀器設(shè)備等優(yōu)點。

本發(fā)明解決上述技術(shù)問題的技術(shù)方案如下：一種百菌清殘留檢測的方法，包括如下步驟：

(1)稱取待測果蔬樣品200g，勻漿或攪拌粉碎均質(zhì)，得到待測樣品；

(2)取步驟(1)得到的待測樣品25g置于250ml錐形瓶中，加入60ml丙酮及質(zhì)量百分比分數(shù)為50％的磷酸2ml，振搖2min，過濾，用20ml丙酮洗滌錐形瓶2次，濾液全部移入250ml分液漏斗中，并加入20g/l硫酸鈉溶液100ml，搖勻后用60ml環(huán)己烷一共提取3次，靜置分層后，提取液經(jīng)無水硫酸鈉漏斗干燥，減壓濃縮至近干，后用氮氣吹干，用25ml無菌雙蒸水定容，渦旋混合，將其轉(zhuǎn)移至試管中，得到百菌清提取物；

(3)制備濃度為0-100μg/kg的百菌清標準溶液；

(4)將分離得到的發(fā)光細菌fc-11-1單菌落接種于10ml發(fā)光細菌液體培養(yǎng)基中，25℃、150r/min振蕩培養(yǎng)20h，即為種子液；將種子液1ml接種至150ml液體發(fā)光培養(yǎng)基中，25℃、150r/min振蕩培養(yǎng),得到測試用菌液；

(5)當步驟(4)得到的測試用菌液的發(fā)光強度每秒光子計數(shù)為3900000-4200000時,取步驟(2)得到的百菌清提取物與步驟(4)得到的測試用菌液等體積混合均勻,同時分別取步驟(4)得到的測試用菌液與步驟(3)得到的百菌清標準溶液等體積混合均勻，于25℃培養(yǎng)30min后，檢測發(fā)光細菌發(fā)光強度，計算發(fā)光抑制效率，根據(jù)標準曲線計算得到待測果蔬樣品中百菌清濃度。

在上述技術(shù)方案的基礎(chǔ)上，本發(fā)明還可以做如下改進。

進一步，步驟(4)所述發(fā)光細菌液體培養(yǎng)基為酵母粉5g、胰蛋白胨5g、氯化鈉30g、磷酸氫二鈉5g、磷酸二氫鉀1g、甘油3ml，ph值7.6，121℃滅菌20分鐘。

進一步，步驟(5)所述發(fā)光抑制效率的計算公式為：

式中：

x％：發(fā)光抑制效率；

kc：未添加百菌清樣品中發(fā)光細菌發(fā)光強度；

kt：待測溶液中發(fā)光細菌發(fā)光強度。

本發(fā)明的有益效果是：

1.本發(fā)明分離出一種發(fā)光細菌。本發(fā)明的發(fā)光細菌fc-11-1豐富了發(fā)光細菌物種資源,是不同于現(xiàn)有已報道的11種發(fā)光細菌的新型發(fā)光菌株。

2.本發(fā)明提供了一種發(fā)光細菌在百菌清殘留檢測中的應(yīng)用。

3.本發(fā)明的發(fā)光細菌用于果蔬中百菌清殘留的檢測，具有成本低、操作簡單、不需要貴重或大型儀器設(shè)備等優(yōu)點。

附圖說明

圖1為發(fā)光細菌fc-11-1的菌落圖。

圖2為發(fā)光細菌fc-11-1的細胞形態(tài)觀察圖。

圖3為發(fā)光細菌fc-11-1的生長和發(fā)光強度曲線圖。

圖4為發(fā)光細菌fc-11-1的系統(tǒng)發(fā)育圖。

圖5為百菌清濃度與fc-11-1發(fā)光抑制率標準曲線。

具體實施方式

以下結(jié)合附圖對本發(fā)明的原理和特征進行描述，所舉實例只用于解釋本發(fā)明，并非用于限定本發(fā)明的范圍。

實施例1發(fā)光細菌fc-11-1的分離、鑒定

如圖1和圖2所示，經(jīng)分離純化培養(yǎng)后獲得1株發(fā)光細菌(圖1)，在暗室中發(fā)出明亮的藍綠色可見光，具有發(fā)光特性；革蘭氏染色菌體呈現(xiàn)紅色，因此可判斷均為革蘭氏陰性菌；在發(fā)光固體培養(yǎng)基上的菌落為圓形類似饅頭狀，表面光滑濕潤，邊緣整齊，超過24h后菌落周圍呈鋸齒狀；油鏡下觀察，呈桿狀或弧狀；在黑暗中發(fā)射藍綠色熒光。

實施例2biolog鑒定

發(fā)光細菌fc-11-1的biolog鑒定分析結(jié)果與數(shù)據(jù)庫中標準菌株的相似性較低，無法鑒定到種。但由biolog鑒定系統(tǒng)統(tǒng)計鑒定結(jié)果(表1)得出的相似性(sim值0.128)和位距(dist值8.955)顯示，與弧菌屬具有較高的同源性，且其生理生化特征與aidelasa等描述的vibriotoranzoniae特征高度一致^[1]。

表1發(fā)光細菌fc-11-1的biolog鑒定結(jié)果

注：“+”表示反應(yīng)陽性，“-”表示反應(yīng)陰性。

實施例3培養(yǎng)時間對發(fā)光細菌生長和發(fā)光強度的影響

在發(fā)光培養(yǎng)基中，25℃、150rpm/min振蕩培養(yǎng)條件下，培養(yǎng)時間對發(fā)光細菌fc-11-1生長和發(fā)光強度(指每秒的光子計數(shù),微弱發(fā)光儀測得)的影響(圖3)。由圖3可以看出，發(fā)光細菌fc-11-1的發(fā)光與生長不具有同步性，細菌濃度達到od600nm＝0.1時，即開始發(fā)光。當該發(fā)光細菌生長進入對數(shù)生長期，細菌密度大概達到od600nm＝0.7時，該發(fā)光細菌可持續(xù)穩(wěn)定發(fā)光達12h。在實際檢測中，起始發(fā)光時間短、持續(xù)穩(wěn)定發(fā)光時間長的菌種能夠縮短檢測周期且易于操作控制，在這一點上,說明fc-11-1適合應(yīng)用于有毒物質(zhì)的檢測。

實施例416srdna序列測定及系統(tǒng)發(fā)育分析

發(fā)光細菌fc-11-1的16srdna序列，長度為1471bp，測序所得結(jié)果提交到ncbi進行比對，如表2顯示。結(jié)合形態(tài)學(xué)鑒定結(jié)果及實驗菌株16srdna序列的最高相似性可得知，分離得到的發(fā)光細菌與vibriotoranzoniae相似性最高，達100％。

表2發(fā)光細菌fc-11-1的16srdna序列相似性

分離得到的發(fā)光細菌fc-11-1比對結(jié)果進行系統(tǒng)發(fā)育樹分析結(jié)果，如圖4顯示。

生理生化鑒定和分子生物學(xué)鑒定結(jié)果證明，本發(fā)明分離得到的發(fā)光細菌fc-11-1為vibriotoranzoniae，這種發(fā)光細菌在國內(nèi)未見報道。

實施例5發(fā)光細菌fc-11-1發(fā)光狀態(tài)對其用于百菌清檢測的影響

將分離得到的發(fā)光細菌fc-11-1單菌落接種于10ml液體培養(yǎng)基中，25℃、150r/min振蕩培養(yǎng)20h，即為種子液。將種子液1ml接種至150ml液體發(fā)光培養(yǎng)基中，25℃、150r/min振蕩培養(yǎng)。在發(fā)光條件下，每隔4h將菌液移至百菌清濃度為0、20、40、60、80、100μg/kg的試管中。反應(yīng)體系中百菌清溶液與菌液等體積混合均勻后于25℃、150r/min振蕩培養(yǎng)30min，測定發(fā)光強度，每組各3個平行，結(jié)果取平均值。取樣至24h。以百菌清濃度為橫坐標，以對發(fā)光細菌fc-11-1發(fā)光抑制率為縱坐標建立標準曲線，如表3。表3結(jié)果證明，發(fā)光細菌的起始發(fā)光強度在3900000-4200000，線性方程的r²值都大于0.98，滿足檢測要求。

表3發(fā)光細菌fc-11-1不同發(fā)光狀態(tài)對其用于百菌清檢測的影響

實施例6作用時間對發(fā)光細菌fc-11-1用于百菌清檢測的影響

將分離得到的發(fā)光細菌fc-11-1單菌落接種于10ml液體培養(yǎng)基中，25℃、150r/min振蕩培養(yǎng)20h，即為種子液。將種子液1ml接種至150ml液體發(fā)光培養(yǎng)基中，25℃、150r/min振蕩培養(yǎng)。測定發(fā)光強度達到3900000-4200000，將菌液分別移至百菌清濃度為0、20、40、60、80、100μg/kg的試管中。反應(yīng)體系中百菌清溶液5ml，菌液5ml?；旌暇鶆蚝笥?5℃、150r/min分別振蕩培養(yǎng)15min、30min、60min，測定發(fā)光強度，每組各3個平行，結(jié)果取平均值。以百菌清濃度為橫坐標，以對發(fā)光細菌fc-11-1發(fā)光抑制率為縱坐標建立標準曲線，如表4所示。表4結(jié)果證明，發(fā)光細菌用于百菌清檢測的作用時間為30min時，其線性方程為y＝0.3975x+0.3682，r²值大于0.99，明顯優(yōu)于作用時間為15min和60min的條件。

表4百菌清與發(fā)光細菌fc-11-1最佳作用時間的確定

實施例7發(fā)光細菌fc-11-1在草莓中百菌清殘留檢測的應(yīng)用

(1)稱取新鮮待測不加內(nèi)標的草莓200g，勻漿后，用tris緩沖液將樣品的ph調(diào)至7.0-7.6；

(2)將(1)中草莓勻漿樣品25ml置于250ml錐形瓶中，加入60ml丙酮及質(zhì)量百分比分數(shù)為50％的磷酸2ml，充分振搖2min，過濾，用20ml丙酮洗滌錐形瓶2次，濾液全部移入250ml分液漏斗中，并加入20g/l硫酸鈉溶液100ml，搖勻后用60ml環(huán)己烷一共提取3次，靜置分層后，提取液經(jīng)無水硫酸鈉漏斗干燥，減壓濃縮至盡干，后用氮氣吹干，用25ml無菌雙蒸水定容，渦旋混合1min，將其轉(zhuǎn)移至試管中，得到百菌清提取物；

(3)制備百菌清不同添加濃度的草莓汁樣品

分別取步驟(1)中所得草莓汁25ml添加百菌清標準品，使其百菌清終濃度分別達到10、20、50、100、200μg/kg，得到外源添加百菌清草莓樣品，同時制備百菌清濃度為0、20、40、60、80、100μg/kg的標準溶液，以用于標準曲線的繪制；

(4)將分離得到的發(fā)光細菌fc-11-1單菌落接種于10ml液體培養(yǎng)基中，25℃、150r/min振蕩培養(yǎng)20h，即為種子液；將種子液1ml接種至150ml液體發(fā)光培養(yǎng)基中，25℃、150r/min振蕩培養(yǎng),得到測試用菌液；

(5)當步驟(4)得到的測試用菌液的發(fā)光強度達到每秒光子計數(shù)為3900000-4200000時,取步驟(2)得到的百菌清提取定容液5ml與步驟(4)得到的測試用菌液5ml與混合均勻,同時分別取步驟(4)得到的測試用菌液5ml與步驟(3)得到的百菌清濃度為0、20、40、60、80、100μg/kg的標準溶液5ml混勻，于25℃培養(yǎng)30min后，檢測發(fā)光細菌發(fā)光強度，計算發(fā)光抑制效率，根據(jù)標準曲線計算得到百菌清濃度，并計算回收率等指標，結(jié)果見表5、圖5。

表5不同百菌清添加濃度在草莓中的回收率(n＝6)

樣品檢測中，當草莓中百菌清添加濃度低于20μg/kg時，回收率較低，在90％以下，隨著添加濃度的增大，當高于50μg/kg時，百菌清回收率均在90％以上，精密度在4.95％-10.73％，符合生物檢測的要求。

實施例8發(fā)光細菌fc-11-1在冷凍菠菜中百菌清殘留檢測的應(yīng)用

(1)稱取冷凍菠菜200g，攪拌均質(zhì)；

(2)制備百菌清不同添加濃度的冷凍菠菜樣品

分別取步驟(1)中所得冷凍菠菜25g添加百菌清標準品，使其百菌清終濃度分別達到10、20、40、50、100、200μg/kg，得到外源添加百菌清菠菜樣品，同時制備百菌清濃度為0、20、40、60、80、100μg/kg的標準溶液，以用于標準曲線的繪制；

(3)各取25g菠菜樣品，同實施例7中步驟(3)進行樣品前處理，提取百菌清，待用；

(4)同實施例7中步驟(4)、(5)制備發(fā)光細菌懸液并與待測樣品或百菌清標準溶液反應(yīng)，測定發(fā)光細菌發(fā)光強度，計算發(fā)光受抑制情況，根據(jù)標準曲線計算測得的百菌清濃度，并計算回收率等指標，結(jié)果見表6。

表6不同百菌清添加濃度在冷凍菠菜中的回收率(n＝6)

樣品檢測中，當添加菠菜中百菌清濃度為10、20、40μg/kg時，回收率均在90％以下，但濃度在40μg/kg時，回收率已達到89.98％。隨著添加濃度增大到50μg/kg時，回收率均在90％以上，精密度在3.07％-8.88％之間，符合生物檢測的要求。

結(jié)果表明該發(fā)光細菌法用于果蔬中百菌清的殘留檢測其檢測低限可達到50μg/kg。

參考文獻

[1].aidelasa,anal.dieguez,jesusl.romalde，vibriotoranzoniaesp.nov.,anewmemberofthesplendiduscladeinthegenusvibrio[j].systematicandappliedmicrobiology,2013,(36):96-100.

以上所述僅為本發(fā)明的較佳實施例，并不用以限制本發(fā)明，凡在本發(fā)明的精神和原則之內(nèi)，所作的任何修改、等同替換、改進等，均應(yīng)包含在本發(fā)明的保護范圍之內(nèi)。

序列表

〈110〉煙臺出入境檢驗檢疫局檢驗檢疫技術(shù)中心

〈120〉一株發(fā)光細菌及其在百菌清殘留檢測中的應(yīng)用

〈160〉1

〈170〉patentinversion3.5

〈210〉1

〈211〉1471

〈212〉dna

〈213〉vibriotoranzoniae

〈400〉1

ctaacacatgcaagtcgagcggtaacgacactaacaatccttcgggtgcgttaatgggcgtcgagcggcggacgggtgagtaatgcctaggaaattgccttgatgtgggggataaccattggaaacgatggctaataccgcatgatgcctacgggccaaagagggggaccttcgggcctctcgcgtcaagatatgcctaggtgggattagctagttggtgaggtaatggctcaccaaggcgacgatccctagctggtctgagaggatgatcagccacactggaactgagacacggtccagactcctacgggaggcagcagtggggaatattgcacaatgggcgcaagcctgatgcagccatgccgcgtgtatgaagaaggccttcgggttgtaaagtactttcagttgtgaggaagggggtaacgttaatagcgctatctcttgacgttagcaacagaagaagcaccggctaactccgtgccagcagccgcggtaatacggagggtgcgagcgttaatcggaattactgggcgtaaagcgcatgcaggtggttcattaagtcagatgtgaaagcccggggctcaacctcggaactgcatttgaaactggtgaactagagtactgtagaggggggtagaatttcaggtgtagcggtgaaatgcgtagagatctgaaggaataccagtggcgaaggcggccccctggacagatactgacactcagatgcgaaagcgtggggagcaaacaggattagataccctggtagtccacgccgtaaacgatgtctacttggaggttgtggccttgagccgtggctttcggagctaacgcgttaagtagaccgcctggggagtacggtcgcaagattaaaactcaaatgaattgacgggggcccgcacaagcggtggagcatgtggtttaattcgatgcaacgcgaagaaccttacctactcttgacatccagagaatccagcggagacgcaggagtgccttcgggagctctgagacaggtgctgcatggctgtcgtcagctcgtgttgtgaaatgttgggttaagtcccgcaacgagcgcaacccttatccttgtttgccagcgagtcatgtcgggaactccagggagactgccggtgataaaccggaggaaggtggggacgacgtcaagtcatcatggcccttacgagtagggctacacacgtgctacaatggcgcatacagagggcagcgagccagcgatggtaagcgaatcccaaaaagtgcgtcgtagtccggattggagtctgcaactcgactccatgaagtcggaatcgctagtaatcgtgaatcagaatgtcacggtgaatacgttcccgggccttgtacacaccgcccgtcacaccatgggagtgggctgcaaaagaagtaggtagtctaaccttcgggaggacgcttaccactttgtggttcatgactggggtgaagtcgtaacaaggta1471