本發(fā)明涉及腫瘤診斷、治療領(lǐng)域，更具體地，本發(fā)明涉及以檢測mgam異常為手段的腫瘤診斷方法；及激活mgam基因或蛋白質(zhì)的腫瘤治療劑。

背景技術(shù)：

腹主動脈瘤(abdominalaorticaneutysm，aaa)是指由于腹主動脈壁的病變或損失，造成腹主動脈的局限性擴張、膨出，以搏動性腫塊為主要癥狀的疾病。通常將腹主動脈段動脈壁三層結(jié)構(gòu)持續(xù)性擴張至腎動脈處腹主動脈直徑1.5倍以上即定義為aaa，是一種常見的高病死率動脈退行性疾病。目前，對于腹主動脈瘤具體發(fā)病機制尚不完全清楚，已有的報道顯示其發(fā)病與遺傳因素、炎癥、蛋白酶降解、平滑肌細胞凋亡等因素密切相關(guān)，其發(fā)病與其他腫瘤因化學輻射、基因突變等不同。人腹主動脈平滑肌細胞(hvsmcs)作為腹主動脈中膜的主要構(gòu)成成分，對維持動脈壁結(jié)構(gòu)和功能的完整性起到重要作用。近年來，一些報道顯示腹主動脈瘤組織中vsmc數(shù)量的減少是其形成過程中一個關(guān)鍵因素。如何有效抑制vsmc的凋亡有望為延緩aaa的形成、發(fā)展提供新的治療思路。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的之一在于提供一種通過檢測mgam基因或蛋白表達差異來診斷腹主動脈瘤的方法。

本發(fā)明的目的之二在于提供一種通過抑制mgam基因或mgam蛋白來治療腹主動脈瘤的方法。

本發(fā)明的目的之三在于提供一種用于篩選腹主動脈瘤治療藥物的方法。

本發(fā)明的目的之四在于提供一種用于治療腹主動脈瘤的藥物。

為了實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用了如下技術(shù)方案：

本發(fā)明提供了檢測mgam的產(chǎn)品在制備腹主動脈瘤診斷工具中的應(yīng)用。

進一步，所述檢測mgam的產(chǎn)品包括檢測mgam基因表達量的產(chǎn)品。

更進一步，所述檢測mgam的產(chǎn)品包括能夠定量mgam基因mrna的產(chǎn)品，和/或能夠定量mgam蛋白的產(chǎn)品。

本發(fā)明的定量mgam基因mrna的產(chǎn)品可基于使用核酸分子的已知方法來發(fā)揮其功能：如pcr、如southern雜交、northern雜交、點雜交、熒光原位雜交(fish)、dna微陣列、aso法、高通量測序平臺等。使用該產(chǎn)品可以定性地、定量地、或半定量地實施分析。

包含在上述產(chǎn)品中的核酸可以通過化學合成來獲得，或通過從生物材料制備含有期望核酸的基因，然后使用設(shè)計用于擴增期望核酸的引物擴增它來獲得。

進一步，所述pcr方法為已知方法，例如，arms(amplificationrefractorymutationsystem，擴增不應(yīng)突變系統(tǒng))法、rt-pcr(逆轉(zhuǎn)錄酶-pcr)法、嵌套pcr法等等。擴增的核酸可以通過使用點印跡雜交法、表面等離子共振法(spr法)、pcr-rflp法、原位rt-pcr法、pcr-sso(序列特異性寡核苷酸)法、pcr-ssp法、ampflp(可擴增片段長度多態(tài)性)法、mvr-pcr法、和pcr-sscp(單鏈構(gòu)象多態(tài)性)法來檢測。

所述能夠定量mgam基因mrna的產(chǎn)品包括實時定量pcr中使用的特異擴增mgam基因的引物，所述引物序列如seqidno.1和seqidno.2所示。

產(chǎn)品中包括的引物可以通過通過化學合成來制備，通過使用本領(lǐng)域技術(shù)人員知道的方法參考已知信息來適當?shù)卦O(shè)計，并通過化學合成來制備。

上面所述的核酸還可包括探針，所述探針可以通過化學合成來制備，通過使用本領(lǐng)域技術(shù)人員知道的方法參考已知信息來恰當設(shè)計，并通過化學合成來制備，或者可以通過從生物材料制備含有期望核酸序列的基因，并使用設(shè)計用于擴增期望核酸序列的引物擴增它來制備。

本發(fā)明的定量mgam蛋白的產(chǎn)品可基于使用抗體的已知方法來發(fā)揮其功能：例如，可以包括elisa、放射免疫測定法、免疫組織化學法、western印跡等。

本發(fā)明的定量mgam蛋白的產(chǎn)品包括特異性結(jié)合mgam蛋白的抗體或其片段?？梢允褂萌魏谓Y(jié)構(gòu)、尺寸、免疫球蛋白類別、起源等的抗體或其片段，只要它結(jié)合靶蛋白質(zhì)即可。本發(fā)明的檢測產(chǎn)品中包括的抗體或其片段可以是單克隆的或多克隆的?？贵w片段指保留抗體對抗原的結(jié)合活性的抗體一部分(部分片段)或含有抗體一部分的肽?？贵w片段可以包括f(ab′)2、fab′、fab、單鏈fv(scfv)、二硫化物鍵合的fv(dsfv)或其聚合物、二聚化v區(qū)(雙抗體)、或含有cdr的肽。本發(fā)明的定量mgam蛋白的產(chǎn)品可以包括編碼抗體或編碼抗體片段的氨基酸序列的分離的核酸，包含該核酸的載體，和攜帶該載體的細胞。

抗體可以通過本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的方法來獲得。例如，制備保留整個或部分靶蛋白質(zhì)的多肽或整合編碼它們的多核苷酸的哺乳動物細胞表達載體作為抗原。使用抗原免疫動物后，從經(jīng)過免疫的動物獲得免疫細胞并融合骨髓瘤細胞以獲得雜交瘤。然后從雜交瘤培養(yǎng)物收集抗體。最后可以通過使用被用作抗原的mgam蛋白或其部分對獲得的抗體實施抗原特異性純化來獲得針對mgam蛋白的單克隆抗體?？梢匀缦轮苽涠嗫寺】贵w：用與上文相同的抗原免疫動物，從經(jīng)過免疫的動物收集血液樣品，從血液中分離出血清，然后使用上述抗原對血清實施抗原特異性純化?？梢酝ㄟ^用酶處理獲得的抗體或通過使用獲得的抗體的序列信息來獲得抗體片段。

標記物與抗體或其片段的結(jié)合可以通過本領(lǐng)域普遍知道的方法來實施。例如，可以如下熒光標記蛋白質(zhì)或肽：用磷酸鹽緩沖液清洗蛋白質(zhì)或肽，添加用dmso、緩沖劑、等準備的染料，然后混合溶液，再于室溫放置10分鐘。另外，標記可使用商品化的標記試劑盒，諸如生物素標記試劑盒，如生物素標記試劑盒-nh2、生物素標記試劑盒-sh(dojindolaboratories)；堿性磷酸酶標記試劑盒諸如堿性磷酸酶標記試劑盒-nh2、堿性磷酸酶標記試劑盒-sh(dojindolaboratories)；過氧化物酶標記試劑盒諸如過氧化物酶標記試劑盒-nh2、過氧化物酶標記試劑盒-nh2(dojindolaboratories)；藻膽蛋白標記試劑盒諸如藻膽蛋白標記試劑盒-nh2、藻膽蛋白標記試劑盒-sh、b-藻紅蛋白標記試劑盒-nh2，b-藻紅蛋白標記試劑盒-sh、r-藻紅蛋白標記試劑盒-nh2、r-藻紅蛋白標記試劑盒sh(dojindolaboratories)；熒光標記試劑盒諸如熒光素標記試劑盒-nh2、hilytefluor(tm)555標記試劑盒-nh2、hilytefluor(tm)647標記試劑盒-nh2(dojindolaboratories)；及dylight547和dylight647(technochemicalcorp.)、zenon(tm)、alexafluor(tm)抗體標記試劑盒、qdot(tm)抗體標記試劑盒(invitrogencorporation)和ez-標記物蛋白質(zhì)標記試劑盒(funakoshicorporation)。為了正確標記，可以使用適宜的儀器來檢測經(jīng)過標記的抗體或其片段。

作為依照本發(fā)明的檢測產(chǎn)品的樣品，可以使用例如自活檢受試者獲得的組織樣品或流體。樣品不受特別限制，只要它適于本發(fā)明的測定；例如，它可以包括組織、血液、血漿、血清、淋巴液、尿液、漿膜腔液、脊髓液、滑液、房水、淚液、唾液、或其級分或經(jīng)過處理的材料。

在本發(fā)明的具體實施方案中，所述樣品來自受試者的組織。本領(lǐng)域技術(shù)人員公知，腫瘤組織的細胞會脫落到體液中，這些脫落的細胞稱之為循環(huán)腫瘤細胞，循環(huán)腫瘤細胞的性質(zhì)同腫瘤組織中腫瘤細胞的性質(zhì)相同，因此檢測體液中尤其是血液中循環(huán)腫瘤細胞的性質(zhì)就可以代表腫瘤組織的性質(zhì)。就本發(fā)明而言，通過檢測腫瘤組織中mgam基因表達可以用于診斷腹主動脈瘤，可以容易得出也可以通過檢測循環(huán)腫瘤細胞中mgam基因表達來診斷腹主動脈瘤。

進一步，所述定量mgam基因或mgam蛋白的產(chǎn)品可以是檢測mgam基因或mgam蛋白的試劑、也可以是包含所述試劑的試劑盒、芯片、試紙等，也可以是使用所述試劑的高通量測序平臺。

本發(fā)明還提供了一種診斷腹主動脈瘤的工具，所述工具能夠檢測mgam基因表達量。

進一步，所述工具包括包括能夠定量mgam基因mrna的試劑，和/或能夠定量mgam蛋白的試劑。

更進一步，所述能夠定量mgam基因mrna的試劑是實時定量pcr中使用的特異擴增mgam基因的引物，所述引物序列如seqidno.1和seqidno.2所示。

進一步，所述診斷腹主動脈瘤的工具包括但不限于芯片、試劑盒、試紙、或高通量測序平臺；高通量測序平臺是一種特殊的診斷腹主動脈瘤的工具，隨著高通量測序技術(shù)的發(fā)展，對一個人的基因表達譜的構(gòu)建將成為十分便捷的工作。通過對比疾病患者和正常人群的基因表達譜，容易分析出哪個基因的異常與疾病相關(guān)。因此，在高通量測序中獲知mgam基因的異常與腹主動脈瘤相關(guān)也屬于mgam的用途，同樣在本發(fā)明的保護范圍之內(nèi)。

本發(fā)明的檢測產(chǎn)品、診斷工具中使用的抗mgam抗體或其片段所識別的氨基酸的數(shù)目沒有特別限制，只要抗體能夠結(jié)合mgam即可。

本發(fā)明還提供了一種診斷腹主動脈瘤的方法，所述方法包括如下步驟：

(1)獲取受試者的樣品；

(2)檢測受試者樣品中mgam基因或蛋白的表達水平；

(3)將測得的mgam基因或蛋白的表達水平與受試者的患病與否關(guān)聯(lián)起來。

(4)與對照相比，mgam基因或蛋白的表達水平升高，則該受試者被判斷患有腹主動脈瘤或者具有患有腹主動脈瘤的風險、或者腹主動脈瘤患者被判斷為復(fù)發(fā)、或者腹主動脈瘤患者被判斷為預(yù)后不良。

本發(fā)明還提供了一種腹主動脈瘤的治療方法，所述方法包括抑制mgam基因或mgam蛋白。

進一步，所述方法包括抑制mgam基因的表達，或抑制mgam蛋白的表達或抑制mgam蛋白的活性。

本發(fā)明還提供了一種腫瘤藥物的篩選方法，可以通過在對癌細胞添加測試藥物后或在對腫瘤模型動物施用測試藥物后的某個時期測量mgam基因或者mgam蛋白的表達水平來測定腫瘤藥物改善腫瘤預(yù)后的效果。更具體地說，當mgam基因或者mgam蛋白的表達水平在添加或施用測試藥物后降低時或者恢復(fù)正常水平時，可選擇該藥物作為改善腫瘤預(yù)后的治療藥物。

本發(fā)明還提供了一種治療腹主動脈瘤的藥物，所述藥物包含mgam的抑制劑。

本發(fā)明的mgam的抑制劑不受限制，只要所述抑制劑能夠抑制mgam或涉及mgam上游或下游途徑的物質(zhì)的表達或活性，且對于治療腫瘤有效的藥物即可。

本發(fā)明還提供了上述抑制劑在制備治療腹主動脈瘤的藥物中的應(yīng)用。

進一步，所述抑制劑包括針對mgam基因表達的干擾rna，或者負調(diào)控mirna、負調(diào)控型的轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子、或抑制型靶向小分子化合物。

本發(fā)明的抑制劑可以通過本領(lǐng)域任何已知的方式配制藥物組合物來使用。這種組合物包含活性成分，加上一種或多種藥物可接受的載體、稀釋劑、填充劑、結(jié)合劑及其它賦形劑，這依賴于給藥方式及所設(shè)計的劑量形式。本領(lǐng)域枝術(shù)人員已知的治療惰性的無機或有機的載體包括(但不限于)乳糖、玉米淀粉或其衍生物、滑石、植物油、蠟、脂肪、多羥基化合物例如聚乙二醇、水、蔗糖、乙醇、甘油，諸如此類，各種防腐劑、潤滑劑、分散劑、矯味劑。保濕剮、抗氧化劑、甜味劑、著色劑、穩(wěn)定劑、鹽、緩沖液諸如此類也可加入其中，這些物質(zhì)根據(jù)需要用于幫助配方的穩(wěn)定性或有助于提高活性或它的生物有效性或在口服的情況下產(chǎn)生可接受的口感或氣味，在這種組合物中可以使用的制劑可是其原始化合物本身的形式，或任選地使用其藥物學可接受的鹽的形式，本發(fā)明的抑制劑可以單獨給藥，或以各種組合給藥，以及與其它治療藥劑一起結(jié)合形式給藥。如此配制的組合物根據(jù)需要可選擇本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的任何適當?shù)姆绞桨岩种苿┻M行給藥。使用藥物組合物時，是將安全有效量的本發(fā)明的抑制劑施用于人，其中口服安全有效量通常至少約100微克/千克體重。當然，具體劑量還應(yīng)考慮給藥途徑、病人健康狀況等因素，這些都是熟練醫(yī)師技能范圍之內(nèi)的。

本發(fā)明的藥物可根據(jù)需要制備成各種劑型。包括但不限于，經(jīng)皮、粘膜、鼻、口頰、舌下或經(jīng)口使用的片劑、溶液劑、顆粒劑、貼劑、膏劑、膠囊劑、氣霧劑或栓劑。

本發(fā)明的藥物的施用途徑不受限制，只要它能發(fā)揮期望的治療效果或預(yù)防效果即可，包括但不限于靜脈內(nèi)，腹膜內(nèi)，眼內(nèi)，動脈內(nèi)，肺內(nèi)，口服，小泡內(nèi)，肌肉內(nèi)，氣管內(nèi)，皮下的，通過皮膚，通過胸膜，局部的，吸入，通過粘膜，皮膚，腸胃，關(guān)節(jié)內(nèi)，心室內(nèi)，直腸，陰道，顱骨內(nèi)，尿道內(nèi)，肝內(nèi)，瘤內(nèi)。在某些情況下，可以系統(tǒng)地給藥。在某些情況下是局部地給藥。

本發(fā)明的藥物的劑量不受限制，只要獲得期望的治療效果或者預(yù)防效果即可，可以依據(jù)癥狀、性別、年齡等來恰當?shù)拇_定。本發(fā)明的治療藥物或預(yù)防藥物的劑量可以使用例如對疾病的治療效果或者預(yù)防效果作為指標來確定。

在本發(fā)明的上下文中，“診斷腹主動脈瘤”包括判斷受試者是否已經(jīng)患有腹主動脈瘤、判斷受試者是否存在患有腹主動脈瘤的風險、判斷腹主動脈瘤患者是否已經(jīng)復(fù)發(fā)與轉(zhuǎn)移、判斷腹主動脈瘤患者對藥物治療的反應(yīng)性、或者判斷腹主動脈瘤患者的預(yù)后情況。

本文所用的“治療”涵蓋患有相關(guān)疾病或病癥的哺乳動物例如人類中治療相關(guān)的疾病或疾病狀態(tài)，并且包括：

(1)預(yù)防疾病或疾病狀態(tài)在哺乳動物中發(fā)生，尤其是當該哺乳動物易感于所述疾病狀態(tài)，但尚未被診斷出患有這種疾病狀態(tài)時；

(2)抑制疾病或疾病狀態(tài)，即阻止其發(fā)生；或者

(3)緩解疾病或疾病狀態(tài)，即使疾病或疾病狀態(tài)消退。

術(shù)語“治療”通常涉及治療人類或動物(例如，被獸醫(yī)所應(yīng)用)，其中可達到某些預(yù)期的治療效果，例如，抑制病癥的發(fā)展(包括降低發(fā)展速度、使發(fā)展停止)、改善病癥和治愈病癥。還包括作為預(yù)防措施(例如預(yù)防)的治療。對還沒有發(fā)展為病癥但有發(fā)展為該病癥危險的患者的用途，也包括在術(shù)語“治療”中。

本發(fā)明的優(yōu)點和有益效果：

本發(fā)明的發(fā)現(xiàn)了一種診斷腹主動脈瘤的分子標志物，使用該分子標志物可以在腹主動脈瘤發(fā)生的早期即可作為判斷，提供了患者的生存率。

本發(fā)明的包括mgam基因或蛋白的抑制劑的治療藥物可用作新的腹主動脈瘤的治療藥物。

附圖說明

圖1顯示利用qpcr檢測mgam基因在腹主動脈瘤組織與正常對照組織中的差異表達；

圖2顯示利用westernblot實驗檢測mgam蛋白在腹主動脈瘤組織與正常對照組織中的差異表達；

圖3顯示利用westernblot實驗檢測mgam基因表達抑制率。

具體的實施方式

下面結(jié)合附圖和實施例對本發(fā)明作進一步詳細的說明。以下實施例僅用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。實施例中未注明具體條件的實驗方法，通常按照常規(guī)條件，例如sambrook等人，分子克隆：實驗室手冊(newyork:coldspringharborlaboratorypress,1989)中所述的條件，或按照制造廠商所建議的條件。

實施例1基因芯片篩選差異表達基因

1、組織獲取和處理：收集aaa動脈壁中層活體標本2份及腎下正常主動脈對照組織2份，在無菌、無rna酶條件下，于平腎動脈下方約4cm處切取主動脈壁，滅菌生理鹽水沖洗去血跡，將所取組織除去動脈內(nèi)外膜，迅速(<5min)凍存在液氮中備用。

2、rna提取、cdna合成

將液氮保存的動脈瘤組織分別放在陶瓷研缽中液氮低溫環(huán)境下碾碎成粉末,加入trizol試劑勻漿，離心后取上清液經(jīng)1∶1酸性酚-氯仿兩次抽提后再經(jīng)醋酸鈉和5∶1酸性酚-氯仿抽提，等體積異丙醇沉淀，離心后用milli-q水溶解沉淀，紫外分光光度儀測定od值(a260/a280)，甲醛變性凝膠電泳檢測28s、18srrna條帶。

3、芯片處理

hgec40s型表達譜芯片由上海博星基因芯片有限公司制作。用載體兩端通用引物對4096條全長基因行聚合酶聯(lián)反應(yīng)(pcr)擴增，產(chǎn)物長度為1000～3000bp，應(yīng)用瓊脂糖電泳檢驗pcr產(chǎn)物,濃縮后的擴增產(chǎn)物作為靶基因溶解于3×ssc點樣液中用cartesianpixsys7500點樣儀在18mm×18mm玻片上按0.28mm間距點樣。點樣后玻片經(jīng)水合、室溫干燥、uv交聯(lián)，再用0.2％sds、水及0.2％硼氫化鈉溶液處理10min，晾干備用。

4、探針制備

oligolexmrnamidikits(qiagen公司，美國)純化mrna，據(jù)rna溶液的濃度取適量總rna，用oligodt親和柱純化，得到純mrna。參照文獻[schenam,shalond,davisrw,etal.quantitativemonitoringofgeneexpressionpatternswithacomplementarydnamicroarray.science,1995,270:467-470]的方法逆轉(zhuǎn)錄合成及純化cdna探針，cy3-dutp標記正常組織mrna，用cy5-dutp標記aaa組織mrna。乙醇沉淀后將cy3-dutp和cy5-dutp標記的探針混合溶解在20μl5×ssc+0.2％sds雜交液中。

5、雜交和洗滌：將hgec40s表達譜芯片和雜交探針分別做95℃變性后置于雜交艙內(nèi)，加入混合探針，用雜交密封艙加以密閉，不留有氣泡。于恒濕雜交箱內(nèi)60℃雜交16h。

6、差異基因的檢測與分子生物學信息分析：用genepix4000b熒光掃描儀掃描芯片后，genepixpro3.0軟件分析2種熒光信號的強度和比值。用40個管家基因進行cy3和cy5的均衡。先將所有數(shù)據(jù)的前景值與背景值相減，得出cy3、cy5標記的強度值，根據(jù)總數(shù)為n的有效基因的cy5/cy3的自然對數(shù)值lnri＝lncy5/cy3，以ri值在0.1～10.0之間的有效基因作為均一化依據(jù)，算出這些基因cy5/cy3自然對數(shù)平均值即均一化系數(shù)。將所有數(shù)據(jù)項的cy3標記強度乘上均一化系數(shù)，得出調(diào)整后的cy3值。將所有cy3值小于200的強度值以200取代生物信息學分析結(jié)果：用genepixpro3.0軟件分析2種熒光信號的強度和比值。

7、生物信息學分析結(jié)果

用genepixpro3.0軟件分析2種熒光信號的強度和比值。結(jié)果顯示差異表達基因為432個，其中上調(diào)基因為278個，下調(diào)基因為154個。

實施例2差異表達基因在大樣本中的驗證

選擇在腹主動脈瘤組織的表達選擇基因芯片提示差異表達的mgam為研究目標進行反向驗證。

1、組織獲取和處理：按照實施例1的方法收集aaa動脈壁中層活體標本30份及腎下正常主動脈對照組織40份。

2、rna提取

按照實施例1的方法進行rna提取。

3、逆轉(zhuǎn)錄

用逆轉(zhuǎn)錄緩沖液對lμg總rna進行逆轉(zhuǎn)錄合成cdna。采用25μl反應(yīng)體系，每個樣品取1μg總rna作為模板rna，在pcr管中分別加入以下組分：depc水，5×逆轉(zhuǎn)錄緩沖液，10mmol/ldntp，0.1mmol/ldtt，30μmmol/loligodt，200u/μlm-mlv，模板rna。42℃孵育1h，72℃10min，短暫離心。

4、qpcr

采用25μl反應(yīng)體系，每個樣本設(shè)置3個平行管。配制以下反應(yīng)體系：sybrgreen聚合酶鏈式反應(yīng)體系12.5μl，正向引物(5μm)1μl，反向引物(5μm)1μl，模板cdna2.0μl，無酶水8.5μl；擴增mgam基因的正向引物序列為5’-ttcacaatcaacctacaag-3’(seqidno.1)，反向引物序列為5’-gataatggcaaccttcag-3’(seqidno.2)；擴增gapdh基因的正向引物序列為5’-aaagggtcatcatctctg-3’(seqidno.3)，反向引物序列為5’-gctgttgtcatacttctc-3’(seqidno.4)，各項操作均于冰上進行。擴增程序為：95℃5min，(95℃10s，60℃60s)*45個循環(huán)。以sybrgreen作為熒光標記物，在lightcycler熒光實時定量pcr儀上進行pcr反應(yīng)，通過融解曲線分析和電泳確定目的條帶，δδct法進行相對定量。

5、westernblot檢測

剪碎組織后機械勻漿，4℃12000rmin離心10min?？捡R氏亮藍r250染色測總蛋白濃度，將各組蛋白濃度調(diào)到同一水平。制備10％sds-聚丙烯酰胺凝膠,每孔加蛋白樣品100μg，電泳后通過半干式電轉(zhuǎn)移儀(美國bio-rad公司)將蛋白轉(zhuǎn)到硝酸纖維素濾膜。麗春紅s染色確定轉(zhuǎn)膜情況并標記蛋白marker位置。5％脫脂奶粉tbs緩沖液封閉4℃冰箱過夜；一抗1∶1000稀釋，室溫下?lián)u2h后tbs洗膜3次；按1∶1000加入過氧化物酶標記羊抗兔igg-hrp60min，tbs洗3次后加入ecl2-3min，暗室顯影2min后沖洗膠片。凝膠成像分析系統(tǒng)攝像分析。

將蛋白條帶的灰度值使用imagej軟件進行分析，以β-actin為內(nèi)參，將mgam蛋白條帶的灰度值進行歸一化處理。結(jié)果數(shù)據(jù)都是以平均值±標準差的方式來表示，采用spss13.0統(tǒng)計軟件來進行統(tǒng)計分析的，兩者之間的差異采用t檢驗，認為當p<0.05時具有統(tǒng)計學意義。

6、結(jié)果

(1)qpcr結(jié)果

如圖1所示，與正常對照組織相比，腹主動脈瘤組織中mgam基因mrna水平顯著升高，差異具有統(tǒng)計學意義(p<0.05)。

(2)westernblot結(jié)果

如圖2所示，與正常對照組織相比，腹主動脈瘤組織中mgam蛋白水平顯著升高，差異具有統(tǒng)計學意義(p<0.05)。

實施例3干擾mgam基因表達

1、干擾rna設(shè)計合成

根據(jù)mgam基因序列由上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司設(shè)計合成sirna。上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司同時提供與mgam基因無序列同源性的陰性對照sirna(sirna-nc)。

sirna-mgam：

正義鏈為5’-agaacauugucaacauugcuu-3’(seqidno.5)；

反義鏈為5’-gcaauguugacaauguucuuc-3’(seqidno.6)，

2、人主動脈平滑肌細胞的培養(yǎng)

t/gha-vsmc細胞(簡稱hvsmc細胞)用含10％胎牛血清(fbs)的dmem高糖培養(yǎng)基加青霉素100units/ml、鏈霉素100μg/ml，置37℃，5％co2的培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，每隔24h換1次培養(yǎng)液，48h傳代1次。取對數(shù)生長期的細胞進行后續(xù)實驗。

3、細胞轉(zhuǎn)染

采用脂質(zhì)體lipofectamine2000為轉(zhuǎn)染試劑。實驗分2組：陰性對照組(轉(zhuǎn)染sirna-nc)；實驗組(轉(zhuǎn)染sirna-mgam)。取對數(shù)生長期的hvsmc細胞細胞，接種于6孔細胞培養(yǎng)板。24h后細胞培養(yǎng)板覆蓋率約為70％-80％。轉(zhuǎn)染方式參照lipofectamine2000說明書進行。

4、westernblot實驗檢測sirna-mgam的干擾效率

步驟同實施例2。

5、結(jié)果

如圖3所示，與陰性對照組(轉(zhuǎn)染sirna-nc)相比，實驗組(轉(zhuǎn)染sirna-mgam)細胞中mgam蛋白表達量顯著降低，差異具有統(tǒng)計學意義(p<0.05)。

實施例4mgam基因的表達對人主動脈平滑肌細胞凋亡的影響

利用annexinv-pe/7-aad凋亡檢測試劑盒(購自北京科悅生物科技有限公司，ktk102-020)檢測mgam基因表達對平滑肌細胞凋亡的影響。

1、細胞培養(yǎng)與轉(zhuǎn)染

按照實施例3的方法進行。

2、細胞凋亡誘導(dǎo)與檢測

細胞轉(zhuǎn)染24小時后，各組細胞分別換用無血清的dmem培養(yǎng)基培養(yǎng)，以誘導(dǎo)凋亡。48小時后胰酶消化收集細胞，用pbs洗2遍，按照說明分析加入bindingbuffer(200μl)、annexinv-pe(10μl)和7-aad(5μl)避光孵育15min，最后加入300μlendingbuffer，上機檢測細胞凋亡的變化。

3、結(jié)果

結(jié)果顯示，各組細胞無血清培養(yǎng)基饑餓刺激48h后，流式細胞儀檢測細胞凋亡率顯示sirna-mgam轉(zhuǎn)染組細胞凋亡率為(17.849±1.647)％；而陰性對照組細胞凋亡率為(31.526±1.231)％；sirna-mgam轉(zhuǎn)染組細胞凋亡率較陰性對照組明顯降低，差異有統(tǒng)計學意義(p<0.05)，上述結(jié)果表明，抑制mgam基因表達可以抑制人主動脈平滑肌細胞的凋亡。由于人主動脈平滑肌細胞的凋亡增加導(dǎo)致了腹主動脈瘤的發(fā)生，因此抑制mgam基因表達可以實現(xiàn)治療腹主動脈瘤的目的。

上述實施例的說明只是用于理解本發(fā)明的方法及其核心思想。應(yīng)當指出，對于本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員來說，在不脫離本發(fā)明原理的前提下，還可以對本發(fā)明進行若干改進和修飾，這些改進和修飾也將落入本發(fā)明權(quán)利要求的保護范圍內(nèi)。

sequencelisting

<110>北京泱深生物信息技術(shù)有限公司

<120>用于診治腹主動脈瘤的生物標志物

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