本發(fā)明涉及一種蜜蜂幼蟲芽孢桿菌實時熒光定量pcr檢測試劑盒及其檢測方法，屬于動物衛(wèi)生技術領域，適用于蜜蜂美洲幼蟲腐臭病的診斷和監(jiān)測及蜂產(chǎn)品中蜜蜂幼蟲芽孢桿菌的檢測。

背景技術：

美洲幼蟲腐臭病（americanfoulbrood，afb）簡稱美腐病，是侵害蜜蜂幼蟲的一種細菌性疾病。該病主要危害意蜂，在世界范圍內(nèi)均有發(fā)生，一旦暴發(fā)，會帶來嚴重的經(jīng)濟損失。美腐病是我國從日本引進西方蜜蜂時帶來的，在我國飼養(yǎng)的意蜂中經(jīng)常發(fā)生，目前已在我國的十幾個省市的蜂群中發(fā)現(xiàn)該病。被感染的蜜蜂幼蟲平均在孵化后12.5天表現(xiàn)出癥狀，首先體色明顯變化，從正常的珍珠白變黃、淡褐色、褐色甚至黑褐色，同時蟲體不斷失水干癟，最后成緊貼于巢房壁的、黑褐色的、難以清除的鱗片狀物。鑒于該病對養(yǎng)蜂業(yè)帶來的嚴重危害，農(nóng)業(yè)部和質(zhì)檢總局聯(lián)合制定的最新的《中華人民共和國進境動物檢疫疫病名錄》將其列為二類傳染病，世界動物衛(wèi)生組織（oie）也將其列為檢疫對象。

美洲幼蟲腐臭病的病原體為蜜蜂幼蟲芽孢桿菌（paenibacilluslarvae），是一種芽孢形式的革蘭氏陽性細菌。產(chǎn)生的芽孢有7層結構包圍，這種特殊構造使得幼蟲芽孢桿菌的芽孢具有特別強的生命力，對熱、化學物質(zhì)等有極強的抵抗力，在高溫干燥等惡劣環(huán)境下至少能存活35年。懸浮在蜂蜜中的芽孢陽光照射下能存活4周-6周。

蜜蜂幼蟲芽孢桿菌的培養(yǎng)條件極其苛刻，不易分離培養(yǎng)，使得蜜蜂幼蟲芽孢桿菌的分離變得很困難，其他方法也難于進一步推廣使用，oie也只推薦了pcr檢測方法。而熒光定量pcr方法通過利用熒光探針使特異性進一步增強，直接顯示擴增結果，而無需電泳檢測，更縮短了檢測時間。目前，檢測蜜蜂幼蟲芽孢桿菌的實時熒光定量pcr試劑盒及其檢測方法未見報道。

本發(fā)明利用蜜蜂幼蟲芽孢桿菌16srrna特異的保守序列設計引物和探針，通過對反應體系的優(yōu)化，研制用于檢測蜜蜂幼蟲芽孢桿菌的實時熒光定量pcr試劑盒及方法，彌補目前國內(nèi)有關蜂類疫病檢測的技術需求，保護國內(nèi)蜂群和自然生態(tài)的健康發(fā)展。

技術實現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于提供一種蜜蜂幼蟲芽孢桿菌實時熒光定量pcr檢測試劑盒及其檢測方法，彌補現(xiàn)有檢測技術的不足，其具有特異性強、靈敏度高、操作簡單的特點，能夠?qū)γ鄯浼捌浞洚a(chǎn)品中蜜蜂幼蟲芽孢桿菌進行快速、準確的檢疫和鑒定。

為了實現(xiàn)本發(fā)明的目的，本發(fā)明的技術方案如下：

一種蜜蜂幼蟲芽孢桿菌實時熒光定量pcr檢測試劑盒，包括正向引物pl-f、反向引物pl-r及taqman探針fl-p，各引物核苷酸序列如下：

正向引物pl-f：5’-ttcgggagacgccaggttag-3’，

反向引物pl-r：5’-agccgttaccctaccaactagc-3’；

taqman探針fl-p：5’-tcacttacagatgggcctgcggcgca-3’，

探針的5’端和3’端分別采用熒光基團fam和tamra進行修飾。

其中，該試劑盒的具體試劑組成為：

（1）陽性標準品：100μl濃度為1×10³拷貝/μl的陽性標準品1支，采用含有目的dna片段的陽性質(zhì)粒作為陽性標準品，-20℃保存；

（2）陰性對照：100μl濃度為100ng/μl的陰性對照1支，采用未感染蜜蜂幼蟲芽孢桿菌的健康蜜蜂組織提取的總dna為陰性對照樣品，-20℃保存；

（3）pcr反應液：50個反應體系的pcr反應液組成成分為：2×pcr緩沖液625μl，濃度為10μmol/l的正向引物pl-f和反向引物pl-r各25μl，濃度為5μmol/l的taqman探針fl-p50μl，濃度為10mmol/l的dntp25μl，濃度為25mmol/l的mgcl2100μl，共計850μl；-20℃保存；

（4）extaq酶：25μl濃度為5u/μlextaq酶1支，-20℃保存；

（5）無菌水：2ml無菌水2支。

本發(fā)明的另一目的在于提供一種使用上述蜜蜂幼蟲芽孢桿菌實時熒光定量pcr檢測試劑盒的檢測方法，包括以下步驟：

（1）pcr反應體系配置：在pcr管中加入pcr反應液17.0μl，5u/μlextaq酶0.5μl，待測樣品dna2.0μl，然后加入滅菌水5.5μl，使反應總體積為25.0μl；

（2）pcr反應程序：95℃預變性2min；然后95℃變性5s、64℃退火延伸30s，共40個循環(huán)，在64℃進行單點熒光檢測；

（3）結果判定：陰性對照無ct值且無擴增曲線，同時陽性對照ct值≤35，并且出現(xiàn)典型的擴增曲線，說明實驗為有效實驗，否則實驗無效；在實驗有效的情況下，待測樣品無ct值且無擴增曲線，表示樣品中不含蜜蜂幼蟲芽孢桿菌；待測樣品ct值≤35，且出現(xiàn)典型的擴增曲線，表示樣品中含有蜜蜂幼蟲芽孢桿菌；待測樣品ct值＞35，則對該樣品重復檢測：重復檢測結果無ct值則該樣品不含蜜蜂幼蟲芽孢桿菌；重復檢測結果有ct值則該樣品中含有蜜蜂幼蟲芽孢桿菌。

本發(fā)明具有以下優(yōu)點：（1）良好的穩(wěn)定性和特異性：本發(fā)明系選擇蜜蜂幼蟲芽孢桿菌16srrna基因保守片段為靶目標，不僅設計了一對特異性引物，而且還設計了一條特異性熒光探針，在熒光pcr反應過程中可以對靶目標進行雙重控制，對蜜蜂幼蟲芽孢桿菌的檢測具有高度特異性，與其它蜜蜂病原菌無交叉反應，且重復性好；（2）靈敏度高：本發(fā)明采用taqman-tamra探針，通過反應體系和反應條件的優(yōu)化，進一步提升其靈敏度，可達到20拷貝/μl；（3）操作簡便、快速：實時熒光收集數(shù)據(jù)，不需要進行電泳檢測核酸的擴增情況，整個反應可在2小時內(nèi)完成。

附圖說明

圖1為實施例2的幼蟲芽孢桿菌實時熒光定量pcr檢測試劑盒的檢測方法的退火溫度優(yōu)化結果。當退火溫度為64.5℃時，熒光強度最強，所以該試劑盒檢測方法中最佳退火溫度為64℃。

圖2為實施例3的陽性標準品和陰性對照pcr擴增結果。其中m：100bpladderdnamarkeri；1：陽性標準品，大小約為196bp；2：陰性對照。

圖3為實施例4的蜜蜂幼蟲芽孢桿菌陽性標準品熒光pcr的動力學曲線。圖中橫坐標代表熒光pcr擴增的循環(huán)數(shù)，縱坐標代表熒光信號強度；從右至左擴增曲線陽性標準品的濃度分別是2×10¹至2×10⁹拷貝/μl。

圖4為實施例4的蜜蜂幼蟲芽孢桿菌陽性標準品實時熒光定量pcr的標準曲線。圖中橫坐標代表標準品拷貝數(shù)值，縱坐標代表pcr擴增循環(huán)數(shù)；標準曲線方程為y=-3.398x+42.779；r代表相關系數(shù)，決定系數(shù)r²為0.998，擴增效率為97.932%。

圖5為實施例5蜜蜂幼蟲芽孢桿菌實時熒光定量pcr檢測試劑盒的特異性測定結果。其中1：蜜蜂幼蟲芽孢桿菌；2：蜂房蜜蜂球菌；3：蜜蜂球囊菌；4：蜜蜂副傷寒桿菌；5：黃曲霉菌；6：陰性對照。

圖6為實施例6的臨床樣品檢測結果。其中包括陽性對照、陰性對照和5份陽性樣品。

具體實施方式

為了進一步闡明本發(fā)明而不是限制本發(fā)明，以下結合實施例加以說明。下述實施例中所述實驗方法，如無特殊說明，均為常規(guī)方法；所述試劑和生物材料如無特殊說明均可從商業(yè)途徑獲得。

實施例1：

一種蜜蜂幼蟲芽孢桿菌實時熒光定量pcr檢測試劑盒，包括正向引物pl-f、反向引物pl-r及taqman探針fl-p，其中正向引物pl-f序列為5’-ttcgggagacgccaggttag-3’，反向引物pl-r序列為5’-agccgttaccctaccaactagc-3’；taqman探針fl-p序列為5’-fam-tcacttacagatgggcctgcggcgca-tamra-3’。該試劑盒包括下列試劑（50個反應體系）：

（1）陽性標準品：利用pl-f和pl-r引物擴增蜜蜂幼蟲芽孢桿菌基因組dna，將產(chǎn)物克隆至pmd-18t載體，轉化dh5α大腸桿菌，利用堿裂解法提取陽性克隆質(zhì)粒，計算質(zhì)粒純度和濃度后，10倍梯度稀釋至1000拷貝/μl作為陽性標準品，100μl/支，-20℃保存；

（2）陰性對照：100μl濃度為100ng/μl的陰性對照1支，采用未感染蜜蜂幼蟲芽孢桿菌的健康蜜蜂組織提取的總dna為陰性對照樣品，-20℃保存；

（3）pcr反應液：50個反應體系的pcr反應液組成成分為：2×pcr緩沖液625μl，濃度為10μmol/l的正向引物pl-f和反向引物pl-r各25μl，濃度為5μmol/l的taqman探針fl-p50μl，濃度為10mmol/l的dntp25μl，濃度為25mmol/l的mgcl2100μl，共計850μl；-20℃保存；

（4）extaq酶：25μl濃度為5u/μlextaq酶1支，-20℃保存；

（5）無菌水：2ml無菌水2支。

實施例2：

幼蟲芽孢桿菌實時熒光定量pcr檢測試劑盒的檢測方法的退火溫度優(yōu)化

（1）pcr反應體系：在每一個pcr管中分別加入pcr反應液17.0μl，5u/μlextaq酶0.5μl，陽性對照2.0μl，然后加入滅菌水5.5μl，使反應總體積為25.0μl；

（2）pcr優(yōu)化反應程序：95℃預變性2min；然后95℃變性5s，55℃-65℃（梯度溫度）退火延伸30s，每個梯度溫度設置3個重復，共40個循環(huán)。

（3）退火溫度選擇：退火溫度優(yōu)化結果如圖2所示，退火溫度為64.5℃時擴增產(chǎn)物熒光強度最高，因此選擇64℃作為該試劑盒反應程序的退火溫度。

實施例3：

使用蜜蜂幼蟲芽孢桿菌實時熒光定量pcr檢測試劑盒的檢測方法，包括以下步驟：

（1）pcr反應體系配置：在pcr管中加入pcr反應液17.0μl，5u/μlextaq酶0.5μl，待測樣品dna2.0μl，然后加入滅菌水5.5μl，使反應總體積為25.0μl；

（2）pcr反應程序：95℃預變性2min；然后95℃變性5s、64℃退火延伸30s，共40個循環(huán)，在64℃進行單點熒光檢測；

（3）結果判定：陰性對照無ct值且無擴增曲線，同時陽性對照ct值≤35，并且出現(xiàn)典型的擴增曲線，說明實驗為有效實驗，否則實驗無效。在實驗有效的情況下，待測樣品無ct值且無擴增曲線，表示樣品中不含蜜蜂幼蟲芽孢桿菌；待測樣品ct值≤35，且出現(xiàn)典型的擴增曲線，表示樣品中含有蜜蜂幼蟲芽孢桿菌；待測樣品ct值＞35，則對該樣品重復檢測：重復檢測結果無ct值則該樣品不含蜜蜂幼蟲芽孢桿菌；重復檢測結果有ct值則該樣品中含有蜜蜂幼蟲芽孢桿菌。

實施例4：

蜜蜂幼蟲芽孢桿菌實時熒光定量pcr檢測試劑盒檢測標準曲線的建立

（1）標準品dna稀釋：將含有目的片段的陽性克隆質(zhì)粒用無菌水10倍遞增稀釋成2×10⁹拷貝/μl~2×10¹拷貝/μl的一系列dna標準品。

（2）標準曲線方程建立：以稀釋后的dna標準品為模板，每個標準樣品處理重復3次，并以未感染蜜蜂幼蟲芽孢桿菌的健康蜜蜂組織總dna為對照，以無菌水為空白對照。按實施例3所述方式配置25μl的實時熒光定量pcr反應體系并進行實時熒光定量pcr反應；獲得如圖3所示的擴增曲線，然后繪制如圖4所示的標準曲線，構建標準曲線方程。本實施例構建的標準曲線方程為y=-3.398x+42.779，決定系數(shù)r²為0.998，擴增效率為97.932%，檢測靈敏度可達到20拷貝/μl，滿足熒光pcr正常的標準曲線要求。

實施例5：

蜜蜂幼蟲芽孢桿菌實時熒光定量pcr檢測試劑盒的特異性測定

分別以蜜蜂幼蟲芽孢桿菌、蜂房蜜蜂球菌、蜜蜂球囊菌、蜜蜂副傷寒桿菌和黃曲霉菌等5種常見的蜜蜂病原菌為樣品，按常規(guī)方法提取dna后以實施例3的方法進行pcr反應和結果判定，由圖5可知，僅蜜蜂幼蟲芽孢桿菌有產(chǎn)生典型的擴增曲線（ct值為15.10），其他樣品均無擴增曲線，說明本試劑盒具有較強的特異性。

實施例6：

臨床樣品蜜蜂幼蟲芽孢桿菌的檢測

利用本試劑盒對臨床分離的5份感染蜜蜂幼蟲芽孢桿菌的蜜蜂陽性樣品進行檢測，按照ctab方法提取各個樣品總dna后根據(jù)實施例3的方法進行檢測。結果如圖6所示，5份樣品均為陽性，ct值均在18~30之間，陽性對照為12.09，陰性對照無ct值，與預期結果相一致。

以上所述僅為本發(fā)明的較佳實施例，凡依本發(fā)明申請專利范圍所做的均等變化與修飾，皆應屬本發(fā)明的涵蓋范圍。

sequencelisting

<110>福建出入境檢驗檢疫局檢驗檢疫技術中心

<120>蜜蜂幼蟲芽孢桿菌熒光定量pcr檢測試劑盒及其應用

<130>3

<160>3

<170>patentinversion3.3

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