本發(fā)明屬于病毒檢測(cè)領(lǐng)域，具體涉及一種快速鑒別豬繁殖與呼吸綜合癥病毒(prrsv)疫苗株gdr180株與其他毒株的pcr-hrm檢測(cè)方法。

背景技術(shù)：

豬繁殖與呼吸綜合癥(porcinereproductiveandrespiratorysyndrome，prrs)最早于1987年發(fā)現(xiàn)于美國，其癥狀主要表現(xiàn)為懷孕母豬流產(chǎn)、早產(chǎn)、產(chǎn)死胎、木乃伊胎及仔豬感染后的成活率下降，成年豬的呼吸道癥狀。

prrsv弱毒疫苗株(gdr180)是中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所最新培育的高代次致弱毒株，具有良好免疫保護(hù)力和安全性的疫苗株，臨床試驗(yàn)證明該疫苗免疫接種對(duì)實(shí)驗(yàn)豬具有很好的免疫保護(hù)作用。疫苗接種后不會(huì)使豬產(chǎn)生體溫升高等免疫副反應(yīng)，降低活疫苗排毒風(fēng)險(xiǎn)。接種后可獲得堅(jiān)強(qiáng)的免疫保護(hù)和較長的免疫保護(hù)期。gdr180疫苗的研制豐富了我國市場(chǎng)高致病藍(lán)耳疫苗的種類，通過鑒別疫苗株與野毒株可以排除免疫后是疫苗株殘毒還是野毒株的感染，是非常有意義的舉措。目前較少關(guān)于gdr180株與野毒株的鑒別研究，僅有雙重?zé)晒舛縫cr方法的研究報(bào)道，但需要使用較昂貴的mgb熒光探針，成本高。所以，建立一種較簡單、經(jīng)濟(jì)的鑒別疫苗株與野毒株的方法，具有重大意義。

pcr-高分辨熔解曲線分析技術(shù)(high-resolutionmeltingcurveanalysis，hrm)是一種用于單核苷酸多態(tài)性(snp)和基因分型研究方法，是一種簡單、快速、低成本的pcr擴(kuò)增后檢測(cè)技術(shù)，可用于高通量的突變掃描和基因分型。pcr-hrm實(shí)驗(yàn)的難點(diǎn)在于，需要找篩選出合適的靶位點(diǎn)來設(shè)計(jì)引物，依據(jù)靶位點(diǎn)的序列匹配度的差異使得熔解曲線探針峰出現(xiàn)熔解溫度的差異來達(dá)到區(qū)分目的，熔解溫度的差異大小即依賴于序列匹配度，同時(shí)也與堿基序列種類和排布有關(guān)。好的靶序列和合適的pcr擴(kuò)增條件才能夠獲得好的熔解曲線區(qū)分效果。如果不然，則無法獲得有差異的熔解曲線探針峰，無法達(dá)到區(qū)分的目的。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于提供一種快速鑒別prrsv疫苗株gdr180株與其他毒株的pcr-hrm檢測(cè)方法的引物及探針；

本發(fā)明的另一目的在于提供一種快速鑒別prrsv疫苗株gdr180株與其他毒株的pcr-hrm檢測(cè)方法的試劑；

本發(fā)明的再一目的在于提供一種快速鑒別prrsv疫苗株gdr180與其他株的pcr-hrm檢測(cè)方法。

本發(fā)明所采取的技術(shù)方案是：

一種快速鑒別prrsv疫苗株gdr180株與其他毒株的pcr-hrm檢測(cè)方法的引物，其核苷酸序列如下所示：

p1:ttcttcttgccttttctatgcttc；

p2:caactgtgtcaaggaaatggct；

p3:caggatagggcatgaccgat；

p4:ccaaatatctcgggatggaact。

一種快速鑒別prrsv疫苗株gdr180株與其他毒株的pcr-hrm檢測(cè)方法的探針，其核苷酸序列如下所示：

probe1:aatgtgtcaggcactgtggctgtgtg。

優(yōu)選的，探針的一端利用修飾物進(jìn)行修飾和封閉，修飾物包括氨基修飾的c6、反向dt、c3間臂(c3spacer)。目前來說，寡核苷酸3’端c3封閉技術(shù)比較成熟，其合成價(jià)格低廉，熒光飽和染料廉價(jià)易得而且用量少，有利于本發(fā)明技術(shù)的推廣。

一種快速鑒別prrsv疫苗株gdr180與其他株的pcr-hrm檢測(cè)試劑，該試劑含有上述所述的引物和探針。

一種快速鑒別prrsv疫苗株gdr180與其他株的pcr-hrm檢測(cè)方法，包括下列步驟：

1)從待測(cè)樣品中提取病毒rna；

2)將rna反轉(zhuǎn)錄成cdna；

3)以cdna為模板，用上述引物對(duì)p1和p2進(jìn)行pcr預(yù)擴(kuò)增反應(yīng)，獲得預(yù)擴(kuò)增產(chǎn)物；

4)以預(yù)擴(kuò)增產(chǎn)物作為模板，用上述引物對(duì)p3、p4以及探針probe1，在加入熒光飽和染料的條件下，進(jìn)行不對(duì)稱pcr-hrm擴(kuò)增反應(yīng)獲得擴(kuò)增產(chǎn)物；

5)對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行hrm分析，確定待測(cè)樣品為gdr180疫苗株或其他株。

優(yōu)選的，步驟3)中pcr預(yù)擴(kuò)增反應(yīng)體系為：

優(yōu)選的，步驟3)中的pcr預(yù)擴(kuò)增的反應(yīng)程序?yàn)椋?4℃預(yù)變性5min；94℃變性30s，55℃退火30s，72℃延伸35s；循環(huán)35次；72℃終延伸5min。

優(yōu)選的，步驟4)中的pcr-hrm擴(kuò)增反應(yīng)體系為：

優(yōu)選的，步驟4)中的pcr-hrm擴(kuò)增反應(yīng)程序?yàn)椋?8℃變性10sec，55℃退火30sec，72℃延伸20sec，45個(gè)循環(huán)；hrm升溫步驟為92℃1min，40℃2min；50℃至90℃，升溫速率為0.5℃/步。

優(yōu)選的，所述hrm分析方法如下所述：

1)以gdr180疫苗株不同拷貝為模板的pcr產(chǎn)物熔解曲線探針峰tm值為參考，若探針峰tm值在72.64±1.17℃，主峰tm值在84.7±0.87℃，則判定為疫苗株gdr180；

2)若探針峰不在此范圍或無探針峰的prrsv株，則判定為prrsv其他毒株。

本發(fā)明的有益效果是：

本發(fā)明方法結(jié)合pcr與高分辨率熔解曲線技術(shù)，篩選gdr180株的特異堿基位點(diǎn)，通過加入3’端封閉的寡核苷酸鏈，依據(jù)靶位點(diǎn)的序列匹配度的差異使得熔解曲線探針峰出現(xiàn)熔解溫度的差異來達(dá)到區(qū)分目的。發(fā)明人通過反復(fù)篩選，最后找到一個(gè)gdr180株與其他疫苗株和野毒株有差異的特異基因位點(diǎn)，通過不對(duì)稱pcr擴(kuò)增來獲得與探針結(jié)合的鏈，通過hrm分析儀獲得熔解曲線，利用熒光值的導(dǎo)數(shù)值來分析熔解曲線的探針峰。

本發(fā)明首次建立了一種快速區(qū)分prrsv疫苗株gdr180與其他株的pcr-hrm鑒別檢測(cè)方法及引物，pcr結(jié)合hrm分析的操作簡單，全部過程只需3小時(shí)，極大縮短了分型所需時(shí)間；費(fèi)用低，所需探針為寡核苷酸3’端c3封閉，其合成價(jià)格低廉，熒光飽和染料廉價(jià)易得；由于實(shí)驗(yàn)方法特異性好，重復(fù)性好，可以準(zhǔn)確、快速、高通量地運(yùn)用于prrsv特定疫苗株的篩查，為快速臨床診斷提供依據(jù)。

本發(fā)明的pcr-hrm引物，對(duì)gdr180與其他株均有很好地的擴(kuò)增性，pcr擴(kuò)增效率高，檢測(cè)靈敏度高。

本發(fā)明的pcr-hrm引物特異性好，能特異性擴(kuò)增prrsv，對(duì)其他病原無擴(kuò)增性，本發(fā)明對(duì)特定株的篩查具有可靠性。

附圖說明

圖1為prrsv疫苗株gdr180與其他株標(biāo)準(zhǔn)樣品hrm峰型化熔解曲線；

圖2為prrsv疫苗株gdr180與其他株臨床樣品hrm峰型化熔解曲線；

圖3為prrsv疫苗株gdr180與其他株pcr-hrm引物特異性凝膠電泳圖。

具體實(shí)施方式

下面結(jié)合具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步的說明，但并不局限于此。

實(shí)施例1pcr-hrm引物設(shè)計(jì)

本發(fā)明方法結(jié)合pcr與高分辨率熔解曲線技術(shù)，篩選gdr180株的特異堿基位點(diǎn)，通過加入3’端封閉的寡核苷酸鏈，依據(jù)靶位點(diǎn)序列匹配度的差異使得熔解曲線探針峰出現(xiàn)熔解溫度的差異來達(dá)到區(qū)分目的。

發(fā)明人通過反復(fù)篩選，選出特異性強(qiáng)的引物及探針，其核苷酸序列如下所示：

p1:5'-ttcttcttgccttttctatgcttc-3'(seqidno:1)；

p2:5'-caactgtgtcaaggaaatggct-3'(seqidno:2)；

p3:5'-caggatagggcatgaccgat-3'(seqidno:3)；

p4:5'-ccaaatatctcgggatggaact-3'(seqidno:4)；

probe1:5'-aatgtgtcaggcactgtggctgtgtg-c3-3'(seqidno:5)。

探針probe1的一端利用修飾物進(jìn)行修飾和封閉，修飾物包括氨基修飾的c6、反向dt、c3間臂(c3spacer)。本發(fā)明中所用的修飾物為c3spacer，c3封閉的探針廉價(jià)且合成技術(shù)成熟，熒光飽和染料種類選擇多且用量少，有利于本發(fā)明技術(shù)的推廣。

其中，p1/p2引物擴(kuò)增片段的長度為525bp，可以高效擴(kuò)增prrsv所有株；p3/p4引物擴(kuò)增片段的長度為137bp，這一段序列包含了gdr180株與其他疫苗株和野毒株有差異的特異基因位點(diǎn)；probe1是p3/p4擴(kuò)增區(qū)域的一段靶序列，通過不對(duì)稱pcr擴(kuò)增來獲得與探針結(jié)合的鏈，然后進(jìn)一步通過hrm分析儀獲得熔解曲線，利用熒光值的導(dǎo)數(shù)值來分析熔解曲線的探針峰。

實(shí)施例2標(biāo)準(zhǔn)樣品的制備及pcr-hrm分析

1)從樣品中提取病毒rna：

在組織勻漿器中冰上充分勻漿化處理，反復(fù)凍融3次，10,000rpm離心5min，取上清備用(有條件可以過濾除菌)。組織上清或血清采用天根trizol試劑(天根生化)說明書進(jìn)行rna抽提。

2)陽性標(biāo)準(zhǔn)樣品的制備：

為了驗(yàn)證本發(fā)明方法可行性與可靠性，同時(shí)構(gòu)建標(biāo)準(zhǔn)陽性樣品，為之后的臨床樣品檢測(cè)提供hrm陽性對(duì)照，本發(fā)明優(yōu)先制備prrsvgdr180株與另2株非gdr180株標(biāo)準(zhǔn)樣品(包括hun4-f112、mlv)，利用ntc作為陰性空白對(duì)照。

標(biāo)準(zhǔn)樣品的制備步驟如下：分別取經(jīng)過測(cè)序確定為gdr180、hun4-f112和mlv株的質(zhì)粒dna作為模板(質(zhì)粒濃度稀釋至10⁶copies/μl)，以p3和p4為上下游引物(質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品不需要預(yù)擴(kuò)增)，probe1為封閉探針，在加有飽和熒光染料下的進(jìn)行pcr擴(kuò)增，其預(yù)擴(kuò)增反應(yīng)體系為：

98℃變性10sec，55℃退火30sec，72℃延伸20sec，45個(gè)循環(huán)。hrm升溫步驟為92℃1min，40℃2min；50℃至90℃，升溫速率為0.5℃/步。hrm實(shí)驗(yàn)結(jié)果用rotor-geneq^tm軟件進(jìn)行分析。

結(jié)果見圖1。3個(gè)標(biāo)準(zhǔn)品的不對(duì)稱pcr擴(kuò)增產(chǎn)物均有清晰的熔解曲線，其中g(shù)dr180株的熔解曲線探針峰tm值為72.50℃，主熔解峰(pcr產(chǎn)物熔解峰)tm值為84.60℃；非gdr180株的hun4-f112的探針峰tm值為64.3℃，主熔解峰tm值為84.95℃；mlv的探針峰tm值為65.55℃，主熔解峰tm值為85.12℃。

因此，gdr180株的熔解曲線通過探針峰tm的差別可以和其他標(biāo)準(zhǔn)品熔解曲線很好的區(qū)分。

對(duì)不同批次gdr180株pcr產(chǎn)物熔解曲線探針峰tm與主峰tm進(jìn)行匯總，結(jié)果見表1。

表1不同批次gdr180株探針峰tm與主峰tm匯總

根據(jù)表1的結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，gdr180疫苗株不同批次pcr產(chǎn)物熔解曲線探針峰tm值為參考，探針峰tm值在72.64±0.39℃，主峰tm值在84.7±0.29℃。在99％置信區(qū)間內(nèi)，若探針峰tm值在72.64±1.17℃，主峰tm值在84.7±0.87℃，則判斷為疫苗株gdr180；若探針峰不在此范圍或無探針峰的prrsv株，則判斷為非gdr180株的prrsv其他毒株。

實(shí)施例3臨床樣品的pcr-hrm檢測(cè)

1)從樣本中提取病毒rna：方法同實(shí)施例2中rna提取方法；

2)以提取的rna為模板，進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄成cdna，pcr預(yù)擴(kuò)增，預(yù)擴(kuò)增反應(yīng)體系為：

94℃預(yù)變性5min；94℃變性30s，55℃退火30s，72℃延伸35s；循環(huán)35次；72℃終延伸5min。

3)以預(yù)擴(kuò)增的pcr產(chǎn)物為模板，擴(kuò)增反應(yīng)體系為：

98℃變性10sec，55℃退火30sec，72℃延伸20sec，45個(gè)循環(huán)。hrm升溫步驟為92℃1min，40℃2min；50℃至90℃，升溫速率為0.5℃/步。hrm實(shí)驗(yàn)結(jié)果用rotor-geneqtm軟件進(jìn)行分析。

10份樣品(其中3份標(biāo)準(zhǔn)品參照，包括疫苗株gdr180、另一種疫苗株為hun4-f112和mlv)的不對(duì)稱pcr擴(kuò)增產(chǎn)物中，7份臨床樣品均有清晰的熔解曲線，見圖2。疫苗株gdr180標(biāo)準(zhǔn)品對(duì)照獲得的熔解曲線有明顯的探針峰和主峰，探針峰tm值為72.68℃，主峰tm值為84.8℃；hun4-f112的探針峰tm值為63.9℃，主峰tm值為84.75℃，mlv的探針峰為65.65℃，主峰為85.35℃。7份臨床樣品中6份的探針峰tm值為65.63±0.23℃(其中一份樣品無探針峰，由于探針與靶序列差異太大)，7份樣品的pcr產(chǎn)物熔解主峰tm值為85.13±0.25℃。在99％置信區(qū)間，探針峰tm值為65.63±0.69℃，與gdr180株(72.64±1.17℃)無相互交叉，探針峰tm值差異極顯著。因此7個(gè)分離株均判定為非gdr180株的prrsv毒株。

圖2的結(jié)果進(jìn)行匯總，結(jié)果見表2。

表210份樣品pcr產(chǎn)物熔解tm匯總

由表2可知，上述分析結(jié)果和本發(fā)明的判斷標(biāo)準(zhǔn)相吻合。

實(shí)施例4pcr-hrm方法特異性實(shí)驗(yàn)

選擇豬源性病毒pedv、prv、csfv、pcv和porv作為陰性對(duì)照，選用p1/p2引物，結(jié)果見圖3。

圖3中，泳道1-5為pedv、prv、csfv、pcv和porv，凝膠電泳顯示未擴(kuò)出目的條帶，泳道6-7分別為prrsv陽性參照gdr180株和hun4-f112，有清晰目的條帶，說明引物擴(kuò)增的特異性好。

上述實(shí)施例為本發(fā)明較佳的實(shí)施方式，但本發(fā)明的實(shí)施方式并不受上述實(shí)施例的限制，其他的任何未背離本發(fā)明的精神實(shí)質(zhì)與原理下所作的改變、修飾、替代、組合、簡化，均應(yīng)為等效的置換方式，都包含在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。

sequencelisting

<110>廣東省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物監(jiān)測(cè)所

<120>一種快速鑒別prrsv疫苗株gdr180株與其他毒株的pcr-hrm檢測(cè)方法

<130>

<160>5

<170>patentinversion3.5

<210>1

<211>24

<212>dna

<213>人工序列

<400>1

ttcttcttgccttttctatgcttc24

<210>2

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<212>dna

<213>人工序列

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