本發(fā)明屬于核酸擴增技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種用于檢測呼吸道病原體的lamp引物組合物，以及基于微流控芯片系統(tǒng)的檢測呼吸道病原體的試劑盒及其方法。

背景技術(shù)：

呼吸道感染是我國常見的一種傳染病，是指病原體感染人體的鼻腔、咽喉、氣管和支氣管等呼吸系統(tǒng)。上呼吸道感染主要有病毒引起，指鼻腔、咽或喉部炎癥，最常見的是急性上呼吸道感染，有較強的傳染性也可引起嚴重并發(fā)癥。下呼吸道感染由病毒、細菌、支原體、衣原體等微生物引起，下呼吸道感染包括支氣管炎、肺炎等，治療時若能明確引起感染的病原體，則可以選擇有效的抗生素或抗病毒治療。同時現(xiàn)今非典型呼吸道病原體在呼吸道病原體中占比越來越大，并且存在多重感染的情況。因此實現(xiàn)快速檢測，多病原體檢測已成為趨勢。

目前臨床上應用的鑒定病原體的方法主要是依靠培養(yǎng)檢測，但是培養(yǎng)法檢測時間差，準確性低，同時呼吸道病原體很多較難培養(yǎng)。而且該類疾病具有相似的臨床癥狀和流行性特征，并且存在多重感染的情況。

呼吸道聯(lián)檢試劑pneumoslide為西班牙vircell公司生產(chǎn)，1卡可同時檢測人血清中呼吸道感染9項igm抗體，包括嗜肺軍團菌1型(lp1)、肺炎支原體(mp)、q熱立克次體(cox)、肺炎衣原體(cp)、腺病毒(adv)、呼吸道合胞病毒(rsv)、甲型流感病毒(ifa)、乙型流感病毒(ifb)、副流感病毒(piv)，但結(jié)果需用免疫熒光顯微鏡觀察，對辨別陰陽性需要較長時間進行分辨。

微流控技術(shù)是以微加工技術(shù)實現(xiàn)微體積反應，用以取代常規(guī)分子生物學、化學、免疫學或藥物分析反應，并可實現(xiàn)多通量或高通量反應使得實驗檢測成本大幅降低，顯著提高效率。

環(huán)介導恒溫擴增根據(jù)鏈置換dna聚合酶的擴增特性以及特異性引物(針對靶序列6個區(qū)域設(shè)計的4條特異性引物)，利用鏈置換dna聚合酶保證引物在等溫條件下順利與模板結(jié)合并進行擴增反應，與聚合酶鏈式反應有等同的特異性和靈敏度，可實現(xiàn)在恒溫條件下的連續(xù)快速擴增，同時還可添加環(huán)引物，提高擴增效率，優(yōu)于pcr。

相關(guān)呼吸道病原體檢測技術(shù)主要為間接免疫熒光法，膠體金法、酶聯(lián)免疫法以及熒光pcr法。其中，間接免疫熒光法判定結(jié)果需要借助熒光顯微鏡，而且判定結(jié)果需要檢測人員經(jīng)驗豐富；膠體金檢測雖然快速，但是靈敏度不高，容易出現(xiàn)假陰性結(jié)果。酶聯(lián)免疫檢測的特異性和靈敏度不高，操作過程繁瑣，耗時費力。熒光pcr法能夠較準確的檢測病原體核酸，但多重熒光pcr產(chǎn)品檢測靶點最多3個，檢測時間長，檢測體系和操作過程比較復雜，難以實行現(xiàn)場檢測，需要專業(yè)人員操作特定檢測儀器等問題。

目前許多研究將環(huán)介導恒溫擴增與微流控芯片結(jié)合，對病原體核酸、腫瘤標記基因、耐藥位點等進行快速檢測，但是以上研究需要借助其他儀器對結(jié)果進行判定。

因此，目前面臨的技術(shù)性難點在于研發(fā)一款在可以同時檢測多種呼吸道病原體，并且便于判定結(jié)果的系統(tǒng)。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)中的缺陷，提供一種用于檢測呼吸道病原體的lamp引物組合物及其試劑盒和方法，其采用微流控芯片實現(xiàn)7種感染率較高的非典型呼吸道病原體(肺炎支原體(mp)、肺炎衣原體(cp)、腺病毒(adv)、呼吸道合胞病毒(rsv)、甲/乙型流感病毒(ifa&ifb，共檢)、副流感病毒(piv))的并行分析，并同步肉眼顯色判定，提高呼吸道相關(guān)病原體的檢測通量以及可操作性，降低成本，縮短檢測時間。

為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用如下技術(shù)方案：

一方面，本發(fā)明提供一種用于檢測呼吸道病原體的lamp引物組合物，其包括肺炎支原體引物組、肺炎衣原體引物組、甲/乙型流感病毒引物組、副流感病毒引物組、腺病毒引物組、呼吸道合胞病毒引物組中的至少一組；

其中，所述肺炎支原體引物組包括seqidno：1所示的肺炎支原體外引物1、seqidno：2所示的肺炎支原體外引物2、seqidno：3所示的肺炎支原體內(nèi)引物1和seqidno：4所示的肺炎支原體內(nèi)引物2；

其中，所述肺炎衣原體引物組包括seqidno：5所示的肺炎衣原體外引物1、seqidno：6所示的肺炎衣原體外引物2、seqidno：7所示的肺炎衣原體內(nèi)引物1和seqidno：8所示的肺炎衣原體內(nèi)引物2；

其中，所述甲/乙型流感病毒引物組包括seqidno：9所示的甲/乙型流感病毒外引物1、seqidno：10所示的甲/乙型流感病毒外引物2、seqidno：11所示的甲/乙型流感病毒內(nèi)引物1和seqidno：12所示的甲/乙型流感病毒內(nèi)引物2；

其中，所述副流感病毒引物組包括seqidno：13所示的副流感病毒外引物1、seqidno：14所示的副流感病毒外引物2、seqidno：15所示的副流感病毒內(nèi)引物1和seqidno：16所示的副流感病毒內(nèi)引物2；

其中，所述腺病毒引物組引物組包括seqidno：17所示的腺病毒引物組外引物1、seqidno：18所示的腺病毒引物組外引物2、seqidno：19所示的腺病毒引物組內(nèi)引物1和seqidno：20所示的腺病毒引物組內(nèi)引物2；

其中，所述呼吸道合胞病毒引物組包括seqidno：21所示的呼吸道合胞病毒外引物1、seqidno：22所示的呼吸道合胞病毒外引物2、seqidno：23所示的呼吸道合胞病毒內(nèi)引物1和seqidno：24所示的呼吸道合胞病毒內(nèi)引物2。

為了進一步優(yōu)化上述技術(shù)方案，本發(fā)明所采取的技術(shù)措施還包括：

優(yōu)選地，該lamp引物組合物進一步包括質(zhì)控引物組，所述質(zhì)控引物組包括seqidno：25所示的質(zhì)控外引物1、seqidno：26所示的質(zhì)控外引物2、seqidno：27所示的質(zhì)控內(nèi)引物1和seqidno：28所示的質(zhì)控內(nèi)引物2。

上述呼吸道病原體引物組的引物序列及質(zhì)控引物組的序列如下所示：

表1擴增引物序列表

另一方面，本發(fā)明提供一種含有上述lamp引物組合的試劑盒，其還包括微流控芯片，所述微流控芯片設(shè)有互不連通的4個反應檢測部分，每一反應檢測部分均包括依次連通的儲液區(qū)、預留區(qū)、球閥和反應孔，所述儲液區(qū)設(shè)置加樣孔，每個反應檢測部分具有8個反應孔，所述引物組合物中的每一引物組分別包被于對應的反應孔中。

為了進一步優(yōu)化上述技術(shù)方案，本發(fā)明所采取的技術(shù)措施還包括：

優(yōu)選地，所述微流控芯片為圓盤形微流控芯片。

優(yōu)選地，每一引物組中外引物1的濃度為50μm，外引物2的濃度為50μm，內(nèi)引物1的濃度為50μm，內(nèi)引物2的濃度為50μm；其中，在該試劑盒中，所述外引物1、外引物2、內(nèi)引物1、內(nèi)引物2的體積比為1:1:4～8:4～8。

優(yōu)選地，所述試劑盒進一步包括反應液、dna聚合酶、指示劑、陰性對照物。

優(yōu)選地，所述反應液包括10～15mmdntps、10×isothermalamplification反應緩沖液、100～200mmmmgso4水溶液；其中，所述反應液中dntps、反應緩沖液、mgso4水溶液的體積比為7～9:4～6:2。

優(yōu)選地，所述反應液包括12mmdntps、10×isothermalamplification反應緩沖液、150mmmgso4水溶液；其中，所述反應液中dntps、反應緩沖液、mgso4水溶液的體積比為7～9:4～6:2，更優(yōu)選為8：5：2。

優(yōu)選地，所述dna聚合酶為bstdna聚合酶，濃度為8u/μl。

優(yōu)選地，所述指示劑包括hnb、calcein、甲酚紅、酚紅、間甲酚紫、溴甲酚紫、中性紅、萘酚酞、百里酚藍，其濃度為50～200μm。

優(yōu)選地，所述指示劑為甲酚紅，反應體系終濃度為50～200μm，更優(yōu)選反應體系終濃度為100μm，

優(yōu)選地，所述陰性對照物為水。

最后，本發(fā)明還提供一種采用上述引物組合物來檢測呼吸道病原體的用于非診斷目的方法，其包括如下步驟：

步驟1)引物組合物的包被：將所述引物組合物中的每一引物組分別包被在相應的反應孔內(nèi)，經(jīng)過真空干燥固定在反應孔中；

步驟2)待檢樣品核酸提?。翰捎么胖榉ㄌ崛〈龣z樣品的核酸；

步驟3)lamp反應：取反應液和dna聚合酶、指示劑，與待檢樣品的核酸混合好后，轉(zhuǎn)移至包被引物組的微流控芯片的儲液區(qū)，液體在離心力作用下流入反應孔內(nèi)，然后進行環(huán)介導恒溫擴增反應；

步驟4)結(jié)果判讀：根據(jù)擴增結(jié)束后反應孔中的顏色變化進行直接肉眼判讀或者采用設(shè)備進行顏色判讀。

優(yōu)選地，步驟1)所述的引物組合物的包被的具體步驟如下：步驟1)所述的引物組合物的包被的具體步驟如下：將所述引物組合物的每一引物組分別與瓊脂糖混合，配制成相應的混合溶液，取1μl的混合溶液點入微流控芯片相應的反應孔內(nèi)，于潔凈超凈臺內(nèi)晾干后，抽真空干燥2小時后，引物組被包被于相應的反應孔中；其中，所述混合溶液中瓊脂糖的終濃度為0.1％(質(zhì)量百分比)，所述混合溶液含有4～8μm內(nèi)引物1、4～8μm內(nèi)引物2，1μm外引物1、1μm外引物2；更具體地說，所述微流控芯片中每一反應檢測部分的8個反應孔分別包被如下引物組：肺炎支原體引物組、肺炎衣原體引物組、甲/乙型流感病毒引物組、副流感病毒引物組、腺病毒引物組、呼吸道合胞病毒引物組、質(zhì)控引物組、陰性對照品。

優(yōu)選地，步驟3)所述的lamp反應的具體步驟如下：取30μl反應液、4μldna聚合酶溶液、5μl2mm甲酚紅、20μl待檢樣品的核酸，加水補足至100μl的反應混合溶液，旋渦震蕩均勻后取80μl反應混合溶液注入每個加樣孔中貼封口膜后，在離心機中迅速離心1200rpm/min15s，3200rpm/min30s，在離心力作用下進樣至反應孔，在50℃恒溫反應20min，在60℃下恒溫反應60min。

優(yōu)選地，步驟4)所述的直接肉眼判讀具體如下：若顏色發(fā)生變化，則所述待檢樣本中含有呼吸道病原體基因組核酸；若顏色未發(fā)生變化，則所述待檢樣本中不含有呼吸道病原體基因組核酸。

優(yōu)選地，步驟4)所述的設(shè)備包括恒溫微流控芯片核酸擴增儀，其可檢測相應的擴增曲線及ct值。

優(yōu)選地，在步驟1)之前，還包括微流控芯片的清洗步驟，具體如下：微流控芯片采用等離子清洗，用等離子清洗機沖洗微流控芯片表面，用惰性氣體風干。

優(yōu)選地，在步驟1)包被引物組合物的微流控芯片采用壓敏鍵合膜進行封裝。該壓敏鍵合膜粘性強度、能夠耐受常規(guī)加熱溫度、對所進行的反應沒有顯著不良影響。

所述制備下述任一產(chǎn)品的方法也屬于本發(fā)明的保護范圍：

a.所述檢測呼吸道病原體的環(huán)介導等溫擴增的引物組合物；

b.所述檢測呼吸道病原體的微流控芯片；

所述的檢測呼吸道病原體的等溫擴增成套引物組合物的下述任一種用于非診斷目的的應用也屬于本發(fā)明的保護范圍：

a.所述檢測呼吸道病原體的等溫擴增的成套引物組合物在制備所述檢測呼吸道病原體的微流控芯片中的應用；

b.所述檢測呼吸道病原體的等溫擴增的成套引物組合物在制備所述檢測呼吸道病原體的試劑或試劑盒的應用；

c.所述檢測呼吸道病原體的等溫擴增的成套引物組合物在制備所述檢測呼吸道病原體的系統(tǒng)中的應用。

本發(fā)明還保護一種用于非診斷目的的檢測呼吸道病原體的方法，包括a或b：

a.提取待測樣本的核酸，用所述檢測呼吸道病原體的等溫擴增的成套引物組合物進行等溫擴增，檢測擴增產(chǎn)物，確定待測樣本是否含有所述成套引物組合物中相應引物組對應的呼吸道病原體病原體；

b.提取待測呼吸道病原體的核酸，用所述檢測呼吸道病原體的等溫擴增成套引物進行等溫擴增，檢測擴增產(chǎn)物，確定待測呼吸道病原體是為所述成套引物組合物中相應引物組對應的呼吸道病原體。

在本發(fā)明中，所述呼吸道病原體可為如下中的至少一種：肺炎支原體、肺炎衣原體、甲/乙型流感病毒、副流感病毒、腺病毒和呼吸道合胞病毒。

與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有以下有益效果：

本發(fā)明采用的試劑盒及其使用方法，加入了肉眼可見指示劑，該指示劑可在反應前加入，不影響擴增，可以指示反應結(jié)果；本發(fā)明采用的微流控芯片具有32個反應孔，只要在芯片生產(chǎn)時在不同的反應孔內(nèi)預先包埋引物組即可以在同一設(shè)計的芯片上進行32個核酸反應，實現(xiàn)多樣本多指標的檢測方式，同時在芯片中設(shè)置質(zhì)控引物組，可以達到質(zhì)量控制要求；

本發(fā)明通過運用在微流控芯片上進行可視化判定的方法，可快速準確地實現(xiàn)7種非典型呼吸道病原體的即時檢測，不僅實現(xiàn)向各小體積加樣孔配液，避免操作人員不易辨認是否加樣成功的問題，同時通過顏色變化肉眼判定結(jié)果從而達到可視化的要求，這使本發(fā)明在實際應用中更加簡便、快捷、并且容易操作、適用于現(xiàn)場操作，其將lamp等溫擴增與微流控芯片肉眼可視化相結(jié)合，可實現(xiàn)多重呼吸道病原體的檢測，以用于快速準確地鑒定呼吸道病原體的種類。

本發(fā)明的優(yōu)越之處在于兼顧微流控芯片檢測性能以及可操作性，既可以結(jié)合配套儀器，也可以根據(jù)肉眼觀測最終結(jié)果，因此該系統(tǒng)可以適應高通量自動化或簡便操作的要求。

附圖說明

圖1為本發(fā)明采用的微流控芯片的結(jié)構(gòu)示意圖；

圖2為本發(fā)明一實施例的微流控芯片中引物組的包被示意圖；

圖3為呼吸道病原體樣品的微流控芯片的檢測結(jié)果圖；

圖中附圖標記為：

1、底片；2、反應檢測部分；3、通孔；4、封膜；21、加樣孔；22、儲液區(qū)；23、預留區(qū)；24、反應孔；25、球閥；26、廢液槽；27、排氣孔；28、第一弧形通道；29、第二弧形通道。

1#～4#：反應檢測部分；a～h：包被引物組的反應孔。

在下文中，反應檢測部分1#的反應孔a以1#-a表示，反應檢測部分1#的反應孔b以1#-b表示，依次類推。

具體實施方式

本發(fā)明提供了一種用于檢測呼吸道病原體的引物組合物及其試劑盒和使用方法，其中所述呼吸道病原體包括肺炎支原體、肺炎衣原體、甲/乙型流感病毒、副流感病毒、腺病毒和呼吸道合胞病毒的至少一種，所述引物組合物包括上述呼吸道病原體對應的引物組中的至少一組。

下面結(jié)合附圖和實施例，對本發(fā)明的具體實施方式作進一步描述。以下實施例僅用于更加清楚地說明本發(fā)明的技術(shù)方案，而不能以此來限制本發(fā)明的保護范圍。

實施例一

本實施例描述了本發(fā)明所采用的微流控芯片。

如圖1所示，本發(fā)明采用的微流控芯片為圓盤形微流控芯片，其包括4個反應檢測部分2，每一反應檢測部分2包括加樣孔21、儲液區(qū)22、預留區(qū)23、反應孔24、球閥25、廢液槽26、排氣孔27、第一弧形通道28和第二弧形通道29，上述第一弧形通道28和第二弧形通道29位于底片1上，第一弧形通道28連接預留區(qū)23和排氣孔27，第二弧形通道29連接加樣孔21、儲液區(qū)22和預留區(qū)23，上述球閥25位于預留區(qū)23與反應孔2之間，每個反應檢測部分具有8個反應孔。

上述微流控芯片通過不同加樣孔進行進樣離心，預留區(qū)通過球閥與儲液區(qū)相通，通過離心機的低速(1000rpm)離心，儲液區(qū)的液體在離心力作用下依次流入預留區(qū)中；預留區(qū)通過球閥與反應孔相通，再通過高速(3000rpm)離心，預留區(qū)的液體在離心力作用下依次流入反應孔中，多余液體流入廢液槽中；在反應孔在一定溫度下進行反應，加熱進入反應階段時，球閥防止加樣孔中的液體回流到預留區(qū)中進而向周圍反應孔擴散，同時保證反應孔中的液體是全滿狀態(tài)，保證反應進行并且防止污染。

如圖2所示，本發(fā)明采用微流控芯片進行呼吸道病原體的檢測。其中1#為含有肺炎支原體核酸的反應檢測部分；2#為含有肺炎衣原體核酸的反應檢測部分；3#為含有甲/乙型流感病毒核酸的反應檢測部分；4#為含有副流感病毒核酸的反應檢測部分；在上述反應檢測部分1#～4#中的反應孔a、b、c、d、e、f、g中分別包被肺炎支原體引物組、肺炎衣原體引物組、甲/乙型流感病毒引物組、副流感病毒引物組、腺病毒引物組、呼吸道合胞病毒引物組、質(zhì)控引物組；在上述反應檢測部分1#～4#中的反應孔h中為水的陰性對照。也可增設(shè)另1個微流控芯片，分別設(shè)置5#～8#的腺病毒核酸、呼吸道合胞病毒核酸、含有六種病原體核酸、陰性樣本核酸的反應檢測部分，其各反應孔包被物質(zhì)與上相同(圖中未示出)；

實施例二

本實施例為本發(fā)明所采用的用于檢測呼吸道病原體的lamp引物組合物及其試劑盒。

本發(fā)明所述的lammp引物組合物包括6個病原體引物組中至少一個。所述呼吸道病原體包括下述六種病原體中的至少一種：肺炎支原體、肺炎衣原體、甲/乙型流感病毒、副流感病毒、腺病毒、呼吸道合胞病毒。上述病原體對應的6個引物組分別為肺炎支原體引物組、肺炎衣原體引物組、甲/乙型流感病毒引物組、副流感病毒引物組、腺病毒引物組、呼吸道合胞病毒引物組，該引物組合還包括質(zhì)控引物組(陰性質(zhì)控、陽性質(zhì)控)。上述其各引物組的各引物序列詳見表1。

本發(fā)明涉及一種含有上述lamp引物組合物的試劑盒，其還包括如實施例1所述的包被上述引物組合物的微流控芯片、反應液、dna聚合酶、指示劑和陰性對照物。在包被引物組合物的微流控芯片中，每一引物組中的4種引物的濃度如下：外引物1的濃度為50μm，外引物2的濃度為50μm，內(nèi)引物1的濃度為50μm，內(nèi)引物2的濃度為50μm；其中，所述外引物1、外引物2、內(nèi)引物1、內(nèi)引物2的體積比為1:1:4～8:4～8。該試劑盒中，反應液的體積為30μl，包括12mmdntps、10×isothermalamplification反應緩沖液、150mmmgso4水溶液，其中dntps、反應緩沖液、mgso4水溶液的體積比為8：5：2；dna聚合酶的體積為4μl，其為濃度為8u/μl的bstdna聚合酶；指示劑的體積為5μl，其為2mm甲酚紅。

實施例三

本實施例為采用實施二所述的引物組合物和試劑盒進行檢測呼吸道性病原體的非診斷目的的方法，其包括如下步驟：

1.微流控芯片的清洗步驟；

微流控芯片采用等離子清洗，用等離子清洗機沖洗微流控芯片表面，用惰性氣體風干。

2.引物組合物的包被；

如圖2和圖3所示，將肺炎支原體引物組、肺炎衣原體引物組、甲/乙型流感病毒引物組、副流感病毒引物組、腺病毒引物組、呼吸道合胞病毒引物組、質(zhì)控引物組分別與瓊脂糖混合，配制成相應的混合溶液，在上述混合液中，含有4～8μm內(nèi)引物1、4～8μm內(nèi)引物2，1μm外引物1、1μm外引物2，所述混合溶液中瓊脂糖的終濃度為0.1％(質(zhì)量百分比)；取1μl混合溶液點入微流控芯片相應的反應孔(反應孔a、b、c、d、e、f、g)內(nèi)，反應孔h存放水，將微流控芯片于于潔凈超凈臺內(nèi)晾干后，抽真空干燥2小時后，引物組被包被于相應的反應孔中，然后該微流控芯片采用壓敏鍵合膜進行封裝。

3.待檢樣品核酸提取：采用磁珠法提取待檢樣品的核酸；

用磁珠法核酸提取試劑盒提取肺炎支原體(mp)、肺炎衣原體(cp)、腺病毒(adv)、呼吸道合胞病毒(rsv)、甲/乙型流感病毒(ifb)、副流感病毒(piv)核酸，操作步驟如下：

3.1核酸提取純化準備

a)裂解液如有沉淀，請于56℃溫浴至沉淀完全溶解后使用。

b)使用前，加24ml無水乙醇至洗液三中，混勻，并做好標記(確保瓶蓋擰緊，防止乙醇揮發(fā))。

c)將蛋白酶混合物充分混勻后，按照每管20μl分裝至各離心管中。

d)按照每管分裝10μl內(nèi)標的量至各離心管中。

3.2核酸提取純化步驟

a)向上述已分好蛋白酶和內(nèi)標的離心管中加入200μl臨床樣本和陰陽性對照，輕輕混勻；然后再加入400μl裂解液，漩渦振蕩10s，56℃孵育10分鐘。

b)然后加入300μl核酸共沉劑和2μl磁珠，上下顛倒離心管10次，使管內(nèi)磁珠分布均勻。

c)靜置離心管10分鐘，期間每隔兩分鐘上下顛倒離心管5次，使管內(nèi)磁珠分布均勻。

d)離心管置于離心機上，8000g離心1min，用移液器吸去管內(nèi)液體。

e)加入500μl洗液一，用移液器槍頭輕柔打散管壁磁珠，漩渦振蕩10s，直至其分布均勻。

f)將離心管置于離心機上，8000g離心1min，用移液器吸去管內(nèi)液體。

g)加入500μl洗液二，用移液器槍頭輕柔打散管壁磁珠，漩渦振蕩10s，直至其分布均勻。

h)將離心管置于離心機上，8000g離心1min，用移液器吸去管內(nèi)液體。

i)加入500μl洗液三，用移液器槍頭輕柔打散管壁磁珠，漩渦振蕩10s，直至其分布均勻。

j)將離心管置于離心機上，8000g離心1min，用移液器吸去管內(nèi)液體。

k)將離心管置于離心機上，8000g離心30s，用移液器吸去管內(nèi)殘余液體。

l)打開管蓋，室溫干燥2分鐘。

m)加入60μl洗脫液，用移液器槍頭打散管壁磁珠，直至其分布均勻。56℃孵育3分鐘。

n)將離心管置于離心機上，10000g離心1min。將收集到的60μl上清液吸取至一個無核酸酶干凈的離心管中，即為純化后的核酸溶液用于恒溫熒光擴增。

4.lamp反應

取30μl恒溫擴增緩沖液(含12mmdntps、10×isothermalamplification反應緩沖液、150mmmgso4水溶液，三者體積比為8：5：2)、4μl恒溫擴增酶溶液(含bstdna聚合酶，濃度為8u/μl)、5μl2mm甲酚紅、20μl待檢樣品的核酸，加水補足至100μl的反應混合溶液，旋渦震蕩均勻后取80μl反應混合溶液注入每個加樣孔中貼封口膜后，在離心機中迅速離心1200rpm/min15s，3200rpm/min30s，在離心力作用下反應混合溶液進樣至反應孔；

加樣后的芯片放到配套儀器微流控芯片核酸分析儀內(nèi)，完成擴增反應，50℃20min；60℃60min；或?qū)⑽⒘骺匦酒诺胶銣丶訜崞鲀?nèi)，50℃20min；60℃60min完成擴增反應。

其中，反應檢測部分1#的待檢樣品的核酸含有肺炎支原體核酸；反應檢測部分2#的待檢樣品的核酸含有肺炎衣原體核酸；反應檢測部分3#的待檢樣品的核酸含有甲/乙型流感病毒核酸；反應檢測部分4#的待檢樣品的核酸含有副流感病毒核酸的反應檢測部分。

5.結(jié)果判讀；

5.1采用設(shè)備進行判讀：在配套儀器微流控芯片核酸分析儀上陽性反應孔出現(xiàn)s形擴增曲線，陰性反應孔沒有擴增曲線，若檢測到某反應孔出現(xiàn)擴增曲線，則該反應孔對應的該樣本的該檢測指標為陽性，即反應孔中含有呼吸道病原體核酸且發(fā)生恒溫擴增反應。

5.2采用肉眼可視化進行判讀：在芯片上陽性反應孔為黃色，陰性反應孔為紅色，若檢測到某反應孔出現(xiàn)黃色，則該反應孔對應的該樣本的該檢測指標為陽性，即所述待測樣品的顏色為黃色，則所述待測樣本液中含有相應呼吸道病原體的基因組，若所述待測樣品的顏色為紅色，則所述待測樣本液中不含有相應呼吸道病原體的基因組。

如圖3所示，將相應型別的咽拭子樣本進行核酸提取后，作為模板，加入到微流控芯片對應的反應檢測部分1#(肺炎支原體)，反應檢測部分2#(肺炎衣原體)，反應檢測部分3#(乙型流感病毒)，反應檢測部分4#(副流感病毒)進行等溫擴增，結(jié)果如下：反應檢測部分1#的反應孔為肺炎支原體臨床樣本在反應池的肉眼可視化檢測結(jié)果，1#-a、1#-g為黃色，其他為紅色；反應檢測部分2#的反應孔為肺炎支原體臨床樣本在反應池的肉眼可視化檢測結(jié)果，2#-b、2#-g為黃色，其他為紅色；反應檢測部分3#的反應孔為乙型流感病毒臨床樣本在反應池的肉眼可視化檢測結(jié)果，3#-c、3#-g為黃色，其他為紅色；反應檢測部分4#的反應孔為副流感臨床樣本在反應池的肉眼可視化檢測結(jié)果，4#-d、4#-g為黃色，其他為紅色。

上述結(jié)果表明，本發(fā)明所述的檢測呼吸道病原體的試劑盒及其方法通過運用在微流控芯片上進行可視化判定的方法，可實現(xiàn)7種非典型呼吸道病原體(肺炎支原體、肺炎衣原體、腺病毒、呼吸道合胞病毒、甲/乙型流感病毒、副流感病毒)的即時檢測，不僅實現(xiàn)向各小體積加樣孔配液，避免操作人員不易辨認是否加樣成功的問題，同時通過顏色變化肉眼判定結(jié)果從而達到可視化的要求，這使本發(fā)明在實際應用中更加簡便、快捷、并且容易操作、適用于現(xiàn)場操作。

以上對本發(fā)明的具體實施例進行了詳細描述，但其只作為范例，本發(fā)明并不限制于以上描述的具體實施例。對于本領(lǐng)域技術(shù)人員而言，任何對該實用進行的等同修改和替代也都在本發(fā)明的范疇之中。因此，在不脫離本發(fā)明的精神和范圍下所作的均等變換和修改，都應涵蓋在本發(fā)明的范圍內(nèi)。

sequencelisting

<110>上海速創(chuàng)診斷產(chǎn)品有限公司

<120>一種檢測呼吸道病原體的lamp引物組合物及其試劑盒

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<223>副流感病毒內(nèi)引物2

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<223>質(zhì)控內(nèi)引物2

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