一種新城疫疫苗玉屏風多糖免疫增強劑的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于于畜禽免疫領(lǐng)域，提供了一種畜禽免疫佐劑，具體公開了一種新城疫 疫苗中藥玉屏風多糖免疫增強劑。
【背景技術(shù)】
[0002] 隨著中國經(jīng)濟的發(fā)展、畜牧業(yè)快速增長，動物疫病不僅給畜牧業(yè)生產(chǎn)造成巨大的 經(jīng)濟損失，而且某些人獸共患病，直接威脅著人類的生存和發(fā)展?，F(xiàn)在人們已經(jīng)認識到，機 體免疫系統(tǒng)的素亂更易發(fā)生感染。但由于化學藥物有用藥時間長、療效持續(xù)時間短、藥物殘 留、環(huán)境污染等缺點，而且動物機體的免疫應(yīng)答，有著極其復(fù)雜的過程，多種因素的參與，所 W免疫抑制產(chǎn)生時，常不是單一的化學免疫增強劑所能奏效，因此目前特別缺乏高效低毒 的免疫增強劑。而中藥在運方面則有比較明顯的特色和優(yōu)勢。許多中藥及其復(fù)方W整體調(diào) 整、平衡陰陽為特點，使機體達到和維持免疫穩(wěn)定，具有持續(xù)作用時間長、無殘留、對動物 機體刺激小等優(yōu)點，所W成為較理想的免疫增強劑。
[0003] 中藥免疫增強劑與疫苗配合使用，能增強動物免疫功能，提高動物的抗病力和疫 苗的保護率，因而在預(yù)防和控制動物傳染性疾病上有很大的推廣價值。多糖因為其顯著的 生物活性，己引起人們在研發(fā)上的極大興趣。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 針對現(xiàn)有技術(shù)存在的諸多不足，本發(fā)明提供了一種新城疫疫苗中藥玉屏風多糖免 疫增強劑，主要采用黃巧、白術(shù)、防風按質(zhì)量比3:1: 1，通過水煎-醇沉法制備而得，其重要 成分為玉屏風多糖；采用運種免疫增強劑，與疫苗配合使用，能增強動物免疫功能，提高動 物的抗病力和疫苗的保護率，因而在預(yù)防和控制動物傳染性疾病上有很大的推廣價值。 陽〇化]本發(fā)明的具體技術(shù)方案是：
[0006] -種新城疫疫苗中藥玉屏風多糖免疫增強劑，成分為玉屏風多糖，所述的玉屏風 多糖采用黃巧、白術(shù)、防風按質(zhì)量比3:1:1，通過水煎-醇沉法制備而得；
[0007] 其中所述玉屏風多糖是按如下方法提取的： 陽00引 W玉屏風散lOOOg計，將黃巧、白術(shù)、防風按質(zhì)量比3:1:1配置成lOOOg玉屏風散， 加入8倍質(zhì)量的水浸泡30min;之后煮沸比，過濾后藥渣加入6倍質(zhì)量的水煮沸比，過濾后 濾渣再次加入6倍質(zhì)量的水煮沸Ih過濾，合并=次濾液，將濾液加熱濃縮至lOOOmU冷卻后 300化pm離屯、lOmin，除去雜質(zhì)，蒸饋水定容制成1000血；使其終濃度為Ig/mL;
[0009] 之后用一步醇沉法提取，向上述濃縮液中緩慢加入95wt%乙醇使混合液中乙醇的 終濃度達80wt%，邊加邊攬拌，添加完成后靜置2地，離屯、，取沉淀置于60°C烘干箱干燥，即 得玉屏風總多糖一YPF-PStc;
[0010] 為了達到免疫增強劑的要求，發(fā)明人進一步對上述獲得的玉屏風總多 糖一YPF-PSt。進行了純化，具體步驟如下：
[0011] 分別取YPF-PSt。500mg溶解于10血蒸饋水中，得到50mg.血1樣品，之后層析柱 (1. 6cmX90cm)，介質(zhì)為Se地adexA-25,流速0. 42血?min1上樣，之后采用分部收集，用 0. 05mol?L心aCl和Imol?L心aCl各400血梯度洗脫，洗脫液經(jīng)透析袋透析去除氯化鋼和 雜質(zhì)即得純化多糖燈PF-PStp)。
[0012] 在獲得上述的玉屏風總多糖一YPF-PSt。后，發(fā)明人采用RAMPSh、RAMPStp、各白術(shù)分 級多糖（RAMPSwe、RAMPS7。。和RAMPSSW作為對照對其免疫增強效果進行了評價，結(jié)果顯示玉 屏風多糖免疫增強劑能顯著增強新城疫疫苗免疫維雞的血清抗體效價，促進外周淋己細胞 增殖，促進淋己細胞進入S期和G2/M期，提高CD4\CD8叮淋己細胞亞群的百分率，提高維雞 免疫器官指數(shù)，能顯著提高新城疫疫苗的免疫效果。 陽01引同時發(fā)明人將每個多糖設(shè)為5個濃度，分別為2、4、6、8、100mgmL1，在維雞14天 時，滴鼻點眼新城疫苗，同時肌肉注射0. 5mL多糖，連續(xù)S天，28天時加強免疫，在初免后7、 14、21、28天時抽血測定抗體效價，來確定免疫效果最好的濃度為6mgmLi。所W我們需要 的玉屏風免疫增強劑的劑量為6mgmL1X0. 5血X3天。
[0014] 由此確定了玉屏風多糖作為新城疫疫苗免疫增強劑時的具體用量為：每單位劑量 疫苗配合9mg中藥免疫增強劑使用。
[0015] 綜上所述，采用運種免疫增強劑，與新城疫疫苗配合使用，能增強動物免疫功能， 提高動物的抗病力和疫苗的保護率，因而在預(yù)防和控制動物傳染性疾病上有很大的推廣價 值。
【附圖說明】
[0016] 圖1為各種多糖單獨刺激外周血淋己細胞最高細胞增殖率的變化柱狀圖； 陽017] 圖2為多糖協(xié)同PHA刺激時各組的最高淋己細胞增殖率的變化柱狀圖；
[0018] 圖3為多糖協(xié)同PHA刺激在不同時間點對雞淋己細胞周期分布的變化柱狀圖；
[0019] 圖4為在不同時間點對雞淋己細胞亞群CD4+的影響柱狀圖；
[0020] 圖5為在不同時間點對雞淋己細胞亞群CD8+的影響柱狀圖；
[0021] 圖6為新城疫IV系弱毒苗免疫維雞后血清ND-HI抗體效價的變化圖（l〇g2,n= 6);
[0022] 圖7為新城疫IV系弱毒苗免疫維雞后各組胸腺指數(shù)的動態(tài)變化圖（g.kg1，n= 4)；
[0023] 圖8為新城疫IV系弱毒苗免疫維雞后各組脾臟指數(shù)的動態(tài)變化圖（g.kg1，n= 4)；
[0024] 圖9為新城疫IV系弱毒苗免疫維雞后各組法氏囊指數(shù)的動態(tài)變化圖（g.kg1，n =4) 陽0巧]圖10為新城疫IV系弱毒苗免疫維雞后多糖在不同時間點對雞淋己細胞周期分布 的變化柱狀圖（n= 4); 陽0%] 圖11為新城疫IV系弱毒苗免疫維雞后在不同時間點對雞淋己細胞亞群CD4+的 影響柱狀圖；
[0027]圖12為新城疫IV系弱毒苗免疫維雞后在不同時間點對雞淋己細胞亞群CD8+的 影響柱狀圖。
【具體實施方式】
[0028]W下通過實施例形式的【具體實施方式】，對本發(fā)明的上述內(nèi)容做進一步的詳細說 明，但不應(yīng)將此理解為本發(fā)明上述主題的范圍僅限于W下的實例。凡基于本發(fā)明上述內(nèi)容 所實現(xiàn)的技術(shù)均屬于本發(fā)明的范圍。
[0029] 實施例1多糖的制備
[0030] W玉屏風散lOOOg計，將黃巧、白術(shù)、防風按質(zhì)量比3:1:1配置成lOOOg玉屏風散， 加入8倍質(zhì)量的水浸泡30min;之后煮沸比，過濾后藥渣加入6倍質(zhì)量的水煮沸比，過濾后 濾渣再次加入6倍質(zhì)量的水煮沸Ih過濾，合并=次濾液，將濾液加熱濃縮至lOOOmU冷卻后 3000rpm離屯、lOmin，除去雜質(zhì)，蒸饋水定容制成lOOOmL;用一步醇沉法提取，向上述濃縮液 中緩慢加入95wt%乙醇使混合液中乙醇的終濃度達80wt%，邊加邊攬拌，添加完成后靜置 2地，離屯、，取沉淀置于60°C烘干箱干燥，即得玉屏風總多糖一YPF-PStc。
[0031] 實施例2多糖的純化
[0032] 分別取YPF-PSt。500mg溶解于10血蒸饋水中，得到50mg.血1樣品，之后層析柱 (1. 6cmX90cm)，介質(zhì)為Se地adexA-25,流速0. 42血?min1上樣，之后采用分部收集，用 0. 05mol?L心aCl和Imol?L心aCl各400血梯度洗脫，洗脫液經(jīng)透析袋透析去除氯化鋼和 雜質(zhì)即得純化多糖燈PF-PStp)。
[0033] 實施例3體外免疫效果的比較
[0034] 方法：W玉屏風多糖為試驗材料，WRAMPSt。、RAMPStp、各白術(shù)分級多糖（RAMPSe。。、 RAMPS,。。和RAMPSSW作為對照。首先測定3個方劑對外周血淋己細胞的安全濃度，然后將3 個方劑用細胞培養(yǎng)液（RPMI1640)分別稀釋成62. 5、31. 25、15. 625、7. 813、3. 907yg?血1 一共5個工作濃度，分別加入到培養(yǎng)的雞外周血淋己細胞中，在酶聯(lián)免疫儀上檢測570nm處 的吸光值（Ae,。值），作為淋己細胞增殖的指標。并按公式計算各多糖的最高細胞增殖率：最 高細胞增殖率=(多糖組最高A"。值一細胞對照組A"。值）/細胞對照組A57。值X100 %。 篩選出RAMPSe。。作為對照方1和RAMPStp作為對照方2,在流式細胞儀上檢測各個時間點細 胞的周期分布W及CD4\CD8+T淋己細胞亞群的影響。
[0035]結(jié)果：
[0036] (1)多糖單獨刺激時各組淋己細胞增殖的變化
[0037]YPF-PStc和RAMPStp在 15. 625-62. 5yg?血1、YPF-PStp在 7. 813-62. 5yg?血1、 RAMPS,。。在31. 25yg?血1時的A57。值顯著高于細胞對照組（P<0. 05)(表1)，表明它們在 運些濃度均能顯著促進雞外周血淋己細胞增殖。 陽03引表1多糖單獨刺激時各組淋己細胞增殖的變化（A"。值）
[0039]
W40] 注：同列數(shù)據(jù)標注不同字母者差異顯著（P<0. 05) 下同。
[0041] 最高細胞增殖率：YPF-PStp在31. 25yg?血1時的細胞增殖率最高，為31. 148%; 其次為YPF-PSt。在15. 625yg?血1時，為24. 257%，兩組顯著高于其它多糖組（P<0. 05) (圖1)，表明它們單獨促進外周血淋己細胞增殖的效果較強。 陽0創(chuàng) 似多糖協(xié)同PHA刺激時淋己細胞增殖的變化
[0043] YPF-PSt。在15. 625-62. 5yg?血\YPF-PStp在15. 625-31. 25yg?血\RAMPStp在 3. 125yg.ml\RAMPS抑C在7. 813-15. 625yg.ml1的A的。值顯著高于PHA對照組（P<〇.05)(表2)。表明它們在運些濃度能協(xié)同PHA促進雞外周血淋己細胞增殖。 W44] 表2白術(shù)多糖協(xié)同PHA刺激時淋己細胞增殖的變化（A"。值）
[0045]
[0046] 最高細胞增殖率：RAMPSe。。在7. 813yg?血1時的細胞增殖率最高，為29. 897%， 其次RAMPStp在31. 25yg?血1時，為22. 159%，兩組顯著高于其它多糖組（P<0. ， YPF-PSt。和YPF-PStp的細胞增殖率顯著高于RAMPS7。。、RAMPSs。。和RAMPSt。組（P<〇. 05)(圖 2)。表明它們協(xié)同PHA促進外周血淋己細胞增殖的效果較強。
[0047] (3)多糖體外對雞外周血淋己細胞周期的影響 W4引在72h之內(nèi)未經(jīng)任何處理的細胞大部分處于G0/G1期，其變化不明顯。RAMPStp和YPF-PStp處理細胞48h、7化后，與RAMPSe。。相比較，G0/G1期細胞的百分比明顯降低，S期 細胞百分比明顯增多（P<〇. 05)(表3和圖3)。在所有時間點，與PHA組相比，YPF-PStp和 RAMPStp對淋己細胞周期的SPF值、PI值的影響均顯著（P<0. 05)。YPF-PStp和RAMPStp處理 細胞4化后，與RAMPSeoc相比較，SPF值和PI值顯著升高（P<0. 05)(表4和5)。
[0049]YPF-PStp在作用于淋己細胞48h時升高S期細胞的百分比的效果最顯著，其SPF 值、PI值也均最大，YPF-PStp效果最明顯。
[0050] 表3在不同時間點對雞淋己細胞周期分布的影響（n= 4)
[0051]
[0054]
[0057] (4)CD4叮淋己細胞亞群的變化
[0058] 在所有時間點，試驗組的CD4+淋己細胞百分率均顯著高于空白對照組（P<0. 05)， YPF-PStp和RAMPStp的CD4 +淋己細胞百分率顯著高于PHA對照組（P<0. 05) ;YPF-PStp和 RAMPStp處理細胞4化后，CD4 +淋己細胞百分率顯著高于