本發(fā)明屬于天然產(chǎn)物生物合成和食品化工
技術(shù)領(lǐng)域：
，具體涉及糖基轉(zhuǎn)移酶催化甜茶苷生物合成天然非糖類甜味劑萊鮑迪苷ka。
背景技術(shù)：
：高熱量食品和飲料過量攝取引起的肥胖、糖尿病和高血脂及其相關(guān)代謝疾病已成為困擾國(guó)際社會(huì)的重大健康難題，低(無)熱量、非糖類甜味劑的研發(fā)越來越受重視。目前全球廣泛使用的非糖類甜味劑數(shù)量較少，根據(jù)來源可分為兩類：第一類為天然甜味劑，是指從自然界生物體中提取而得的產(chǎn)品如甜菊苷、羅漢果苷、甜茶苷、甘草甜素等。第二類為化學(xué)合成甜味劑，是指化學(xué)合成的一類具有甜味的化合物，如阿斯巴甜、三氯蔗糖、糖精鈉、甜蜜素等(weihrauchm.r.etal.annoncol,2004,15:1460-1465)?；瘜W(xué)合成甜味劑可能對(duì)人體有致癌、致畸、致病等副作用，所以，近年來很多國(guó)家對(duì)化學(xué)合成甜味劑采取了嚴(yán)格管控措施，嚴(yán)禁在嬰幼兒食品和飲料中添加。在此背景下，低或無熱量、安全綠色的天然甜味劑受到了消費(fèi)者的廣泛接受和歡迎，成為人類理想的食品、飲料、藥品、營(yíng)養(yǎng)保健品、酒類等的添加劑(carakostasm.c.etal.foodchemtoxicol,2008,46:s1-s10；lemus-mondacar.etal.foodchem,2012,132:1121-1132.)。甜茶苷又名甜茶素(rubusoside，如圖所示)是薔薇科植物甜茶(rubussuavissmuss,lee)產(chǎn)的一種四環(huán)二萜苷化合物，分子式c32h50o13，甜度為蔗糖的300倍，熱值不足蔗糖的1％(何偉平.廣西輕工業(yè),1999,1:1-5.)。甜茶苷對(duì)熱和酸穩(wěn)定，食用后不會(huì)導(dǎo)致齲齒、心血管、肥胖、糖尿病等疾病，是一種高甜度、低熱能和具有保健功能的天然甜味劑，已被應(yīng)用于食品、飲料和保健品等領(lǐng)域(司佳,等.食品科技,2013,38:262-266)。但是，甜味不純、具有后滯苦味是甜茶苷的最大缺點(diǎn)，限制了其廣泛應(yīng)用。2014年ibrahimma等首次從甜葉菊中分離純化和結(jié)構(gòu)表征了甜菊苷的同分異構(gòu)體萊鮑迪苷ka(rebaudiosideka，如圖所示)，其分子式為c38h59o18，甜度為蔗糖的數(shù)百倍，熱值不足蔗糖的1％，甜味純正且無后滯苦味，是一種理想的天然甜味劑。但是，由于萊鮑迪苷ka在甜葉菊中的含量極低，難以通過分離純化法大量制備，且目前無法采用合成生物學(xué)策略或化學(xué)方法合成(ibrahimm.a.etal.jnatprod,2014,77:1231-1235)。因此，受到可獲得性的限制，目前萊鮑迪苷ka尚未被作為甜味劑添加使用，但根據(jù)其甜度及性質(zhì)將可作為添加劑用于食品(如糖果、巧克力、蜜餞、糖制糕點(diǎn)、蛋糕、腌漬品、健康食品等)、飲料(可樂、咖啡、果汁、涼茶、罐頭、碳酸飲料、功能飲料、營(yíng)養(yǎng)飲料、能量飲料、茶飲料、含氣低酒精飲料等)、藥品(藥品的矯味劑、甜味劑等)、酒類(紅酒、米酒、黃酒、水果酒、冰酒等)、營(yíng)養(yǎng)保健品(酵素、蜂蜜、奶制品、葉酸制品、膳食纖維制品、維生素制品、蛋白質(zhì)粉制品、補(bǔ)鈣制品、膠原蛋白粉制品、魚油制品、微量元素制品、補(bǔ)血?jiǎng)┑?、調(diào)味品(果醬、甜醋、料酒、飴糖、蜜餞果脯等)、日用化工品(果膠、香皂、香煙等)、口腔衛(wèi)生產(chǎn)品(口香糖、牙膏、涑口水等)或化妝品。糖基轉(zhuǎn)移酶是催化單糖基團(tuán)從糖基供體向受體底物轉(zhuǎn)移并形成糖苷鍵的一類酶，屬于化合物糖基化修飾的主要酶類。根據(jù)糖基供體不同，糖基轉(zhuǎn)移酶可分為ndp-糖(如ndp-葡萄糖、ndp-半乳糖、ndp-麥芽糖、ndp-葡萄糖醛酸等)依賴的leloirgts和非ndp-糖(可溶性淀粉、蔗糖或糊精等)依賴的non-leloirgts兩種類型(bretonc.etal.curropinstrucbiol,1999,9:563-571.)。與化學(xué)糖基化修飾方法相比，糖基轉(zhuǎn)移酶催化的糖基化修飾反應(yīng)具有更強(qiáng)的位點(diǎn)選擇性和立體選擇性。因此，目前糖基轉(zhuǎn)移酶已被廣泛應(yīng)用于改善藥物分子水溶性、提高生物活性(weiw.etal.molplant,2015,8:1412-1424.)以及甜味劑口味改進(jìn)和增加甜度等方面(danielib.etal.helvchimacta,1997,80:1153-1160.)。鑒于萊鮑迪苷ka僅在19位比甜茶苷多一個(gè)以β-1，2-糖苷鍵連接的葡萄糖基的結(jié)構(gòu)特征和糖基轉(zhuǎn)移酶可以催化糖基化修飾的優(yōu)勢(shì)，荷蘭帝斯曼集團(tuán)(dsm)和美國(guó)conagen公司近期分別利用udp-葡萄糖依賴的糖基轉(zhuǎn)移酶hv1、eugt11、ugt76g1等(wo2016151046、wo2016146711、wo2016168413、us20160153018)采用甜茶苷葡萄糖基修飾而開發(fā)了萊鮑迪苷ka的生物合成技術(shù)。但是，由于前述專利中所用的糖基轉(zhuǎn)移酶的底物選擇性不強(qiáng)，在生成萊鮑迪苷ka的同時(shí)，進(jìn)一步催化萊鮑迪苷ka葡萄糖基修飾生成萊鮑迪苷e，反應(yīng)過程也無法控制，所以最終產(chǎn)物為萊鮑迪苷ka和e的混合物。同時(shí)，二個(gè)產(chǎn)物結(jié)構(gòu)類似，分離難度大，成本高，不適合工業(yè)化應(yīng)用。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：本發(fā)明的目的在于采用底物專一性強(qiáng)的糖基轉(zhuǎn)移酶建立一種綠色、專一、經(jīng)濟(jì)的天然甜味劑萊鮑迪苷ka的生物合成新方法，大量獲得純度大于95％的萊鮑迪苷ka。為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明所采用的技術(shù)方案具體如下：一種萊鮑迪苷ka的制備方法，以u(píng)dp-葡萄糖為活性糖供體，使用udp-g依賴型糖基轉(zhuǎn)移酶oled或者與oled氨基酸序列同源性大于或等于69.5％的酶或蛋白質(zhì)定點(diǎn)糖基化修飾甜茶苷，制備得到萊鮑迪苷ka，所述糖基轉(zhuǎn)移酶oled為來源自streptomycesantibioticus的udp-g依賴型糖基轉(zhuǎn)移酶，優(yōu)選udp-g依賴型糖基轉(zhuǎn)移酶oled的氨基酸序列如seqidno:1所示。本發(fā)明所述同源性大于或等于69.5％的酶或蛋白質(zhì)如hxsw-gt-09(氨基酸序列如seqidno:2所示)、hxsw-gt-10(氨基酸序列如seqidno:3所示)和hxsw-gt-11(氨基酸序列如seqidno:4所示)。hxsw-gt-09、hxsw-gt-10和hxsw-gt-11為基于序列、結(jié)構(gòu)和催化機(jī)制改造所獲得的oled突變體。本發(fā)明所述的制備方法，合成oled及其同源蛋白基因后，利用相應(yīng)的表達(dá)載體構(gòu)建大腸桿菌工程菌株、酵母菌工程菌株、枯草芽孢桿菌表達(dá)菌株、乳酸菌表達(dá)菌株、鏈霉菌表達(dá)菌株，用于糖基轉(zhuǎn)移酶的重組表達(dá)。本發(fā)明所述的制備方法，可以以u(píng)dp-葡萄糖、蔗糖-蔗糖合成酶-udp-葡萄糖再生循環(huán)系統(tǒng)或細(xì)菌內(nèi)源性u(píng)dp-葡萄糖生物合成體系或設(shè)計(jì)改造后的udp-葡萄糖生物合成體系(maoz.c.etal,biotechnolprog,2006,22:369-374；ohj.s.etal.ksbbj,2008,23:474-478；rodríguezdíazj.etal.j.biotechnol,2011,154:212-215；ruffinga.etal.mirobcellfact,2006,5:25；yany.etal.biotechnolbioeng,2008,100:126-140)作為活性糖供體的來源。即可以向反應(yīng)體系加入外源性u(píng)dp-葡萄糖，也可以由蔗糖-蔗糖合成酶-udp-葡萄糖再生循環(huán)系統(tǒng)或內(nèi)源性u(píng)dp-葡萄糖合成途徑產(chǎn)生。本發(fā)明以催化甜茶苷的糖基化修飾定義oled及其同源蛋白的酶活力。在相同的反應(yīng)體系條件下，考察oled及其同源蛋白催化甜茶苷定點(diǎn)葡萄糖基修飾制備萊鮑迪苷ka的效率。本發(fā)明所述的制備方法，可以以游離的oled及其同源蛋白、固定化oled及其同源蛋白或表達(dá)oled及其同源蛋白的細(xì)菌細(xì)胞作為生物催化劑，催化萊鮑迪苷ka的生物合成。進(jìn)一步的，本發(fā)明所述方法可用含糖基轉(zhuǎn)移酶的細(xì)胞提取液構(gòu)建反應(yīng)體系；或用含糖基轉(zhuǎn)移酶的菌體構(gòu)建原位或靜息細(xì)胞反應(yīng)體系；或用固定化酶構(gòu)建催化體系。本發(fā)明所述的一個(gè)優(yōu)選的方案，反應(yīng)的ph為6.0-14.0，優(yōu)選11.0；反應(yīng)的溫度為15-40℃，優(yōu)選30℃；甜茶苷和udp-葡萄糖的摩爾濃度比值為1:0.5-1:10，優(yōu)選1:6；反應(yīng)時(shí)間為2-72小時(shí)，優(yōu)選16小時(shí)。本發(fā)明所述的一個(gè)優(yōu)選的方案，在酶活力0.5u/ml條件下，底物甜茶苷的濃度為1-100mg/ml，優(yōu)選15mg/ml，最佳底物濃度(mg/ml)和酶活力(u/ml)比值為2：1～50：1。本發(fā)明的另一目的在于提供一類與oled同源性超過69.5％的同源蛋白質(zhì)，所述蛋白質(zhì)氨基酸序列如seqidno:2-4所示。萊鮑迪苷ka的甜度為蔗糖300倍左右，且口味純正無后滯苦味，熱量不足蔗糖的1％。萊鮑迪苷ka可溶于水和乙醇水溶液，可作為甜味劑或矯味劑添加至食品(如糖果、巧克力、蜜餞、糖制糕點(diǎn)、蛋糕、腌漬品、健康食品等)、飲料(可樂、咖啡、果汁、涼茶、罐頭、碳酸飲料、功能飲料、營(yíng)養(yǎng)飲料、能量飲料、茶飲料、含氣低酒精飲料等)、藥品(藥品的矯味劑、甜味劑等)、酒類(紅酒、米酒、黃酒、水果酒、冰酒等)、營(yíng)養(yǎng)保健品(酵素、蜂蜜、奶制品、葉酸制品、膳食纖維制品、維生素制品、蛋白質(zhì)粉制品、補(bǔ)鈣制品、膠原蛋白粉制品、魚油制品、微量元素制品、補(bǔ)血?jiǎng)┑?、調(diào)味品(果醬、甜醋、料酒、飴糖、蜜餞果脯等)、日用化工品(果膠、香皂、香煙等)、口腔衛(wèi)生產(chǎn)品(口香糖、牙膏、涑口水等)或化妝品。本發(fā)明具有如下優(yōu)點(diǎn)：oled一種是來源自鏈霉菌streptomycesantibioticus的udp-葡萄糖依賴的糖基轉(zhuǎn)移酶，在體內(nèi)的天然底物是竹桃霉素、紅霉素和泰樂菌素，能夠?qū)⑵咸烟菑膗dp-葡萄糖上定點(diǎn)轉(zhuǎn)移至上述大環(huán)內(nèi)酯類抗生素去氧糖胺結(jié)構(gòu)的2-oh，形成β-1，2-糖苷鍵(quiroslm,etal.jbiolchem,1995，27:18234-18239.)。因此，為避免dsm和conagen上述專利技術(shù)存在多種產(chǎn)物的缺陷，本發(fā)明采用底物專一性強(qiáng)的udp-葡萄糖依賴型糖基轉(zhuǎn)移酶oled及其同源蛋白定點(diǎn)葡萄糖基修飾甜茶苷以制備單一的萊鮑迪苷ka，無副產(chǎn)物，反應(yīng)條件簡(jiǎn)單易控，便于產(chǎn)物純化及工業(yè)化放大。綜上所述，萊鮑迪苷ka性質(zhì)優(yōu)異，安全性好，潛在應(yīng)用價(jià)值巨大，市場(chǎng)前景廣闊。利用糖基轉(zhuǎn)移酶定點(diǎn)糖基化修飾甜茶苷獲得萊鮑迪苷ka的方法綠色，先進(jìn)，易于工業(yè)化。附圖說明圖1為oled及其同源蛋白hxsw-gt-09、hxsw-gt-10、hxsw-gt-11和hxsw-gt-12合成萊鮑迪苷ka的hplc圖譜。圖2為萊鮑迪苷ka的1h-nmr圖譜。圖3為萊鮑迪苷ka的13c-nmr圖譜。圖4為萊鮑迪苷ka的dept圖譜。圖5為萊鮑迪苷ka的hmbc圖譜。圖6為萊鮑迪苷ka的hmqc圖譜。圖7為萊鮑迪苷ka的nosey圖譜。具體實(shí)施方式以下進(jìn)一步提供實(shí)施實(shí)例，這些實(shí)施實(shí)例有助于理解本發(fā)明，僅用作說明而不限制本發(fā)明的應(yīng)用范圍。實(shí)施例1糖基轉(zhuǎn)移酶在大腸桿菌中重組表達(dá)設(shè)計(jì)oled同源蛋白：hxsw-gt-09和hxsw-gt-10是基于oled結(jié)構(gòu)和催化機(jī)制選擇多個(gè)關(guān)鍵氨基酸殘基突變所獲得；hxsw-gt-11和hxsw-gt-12是基于多重序列比對(duì)和oled結(jié)構(gòu)進(jìn)行關(guān)鍵氨基酸殘基突變和udp-葡萄糖或底物結(jié)合相關(guān)部位的motif重組所獲得。hxsw-gt-09(氨基酸序列如seqidno:2所示，核苷酸序列如seqidno:7所示)、hxsw-gt-10(氨基酸序列如seqidno:3所示，核苷酸序列如seqidno:8所示)、hxsw-gt-11(氨基酸序列如seqidno:4所示，核苷酸序列如seqidno:9所示)、hxsw-gt-12(氨基酸序列如seqidno:5所示，核苷酸序列如seqidno:10所示)。將糖基轉(zhuǎn)移酶oled(氨基酸序列如seqidno:1所示，核苷酸序列如seqidno:6所示)及上述oled同源蛋白的基因委托蘇州金唯智生物科技有限公司合成并分別利用pet22b(+)構(gòu)建表達(dá)質(zhì)粒pet22b-oled、pet22b-hxsw-gt09、pet22b-hxsw-gt10、pet22b-hxsw-gt11、pet22b-hxsw-gt12。將上述重組表達(dá)質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)入e.colibl21表達(dá)宿主，得到5種e.coli工程菌株，分別命名為poled、pgt-09、pgt-10、pgt-11和pgt-12。將5株e.coli工程菌分別接種至50ml的lb培養(yǎng)基(含100μg/ml氨芐青霉素)，37℃、220rpm振搖過夜培養(yǎng)獲得相應(yīng)種子液。將種子液按5％接種量轉(zhuǎn)接至lb培養(yǎng)基(含100μg/ml氨芐青霉素)中，37℃振搖培養(yǎng)至od600＝0.8±0.1時(shí)，加入誘導(dǎo)劑iptg使其終濃度為0.4mm，在16℃條件下，誘導(dǎo)培養(yǎng)12小時(shí)，即實(shí)現(xiàn)糖基轉(zhuǎn)移酶的異源表達(dá)。sds-page分析poled、pgt-09、pgt-10、pgt-11和pgt-12工程菌中的糖基轉(zhuǎn)移酶可溶性表達(dá)情況，結(jié)果如表1所示。結(jié)果顯示，糖基轉(zhuǎn)移酶oled、hxsw-gt-09、hxsw-gt-10、hxsw-gt-11和hxsw-gt-12均能可溶性表達(dá)，含量分別占總可溶蛋白的20％、22％、18％、7％和23％。表1糖基轉(zhuǎn)移酶種類和信息實(shí)施例2糖基轉(zhuǎn)移酶在酵母菌中重組表達(dá)將糖基轉(zhuǎn)移酶oled及其同源蛋白基因分別構(gòu)建至畢赤酵母蛋白表達(dá)載體ppic9k，然后將重組表達(dá)質(zhì)粒電擊轉(zhuǎn)化至畢赤酵母gs115，按照invitrogen公司畢赤酵母操作手冊(cè)篩選陽性轉(zhuǎn)化子(g418抗性篩選)。挑選單克隆接種于lb培養(yǎng)基，30℃過夜培養(yǎng)獲得菌液，按1％接種量(v/v)接至bmgy培養(yǎng)基，30℃、250rpm培養(yǎng)48h，離心收集菌體，然后菌體重懸并轉(zhuǎn)接至bmmy中，30℃、250rpm條件下甲醇誘導(dǎo)表達(dá)5天。誘導(dǎo)表達(dá)完成后sds-page分析培養(yǎng)基上清液中目標(biāo)蛋白的表達(dá)情況，篩選相應(yīng)的陽性菌株，再?gòu)呐囵B(yǎng)基ph值、誘導(dǎo)溫度以及甲醇濃度三個(gè)方面初步優(yōu)化表達(dá)條件。結(jié)果顯示，糖基轉(zhuǎn)移酶oled、hxsw-gt-09、hxsw-gt-10、hxsw-gt-11和hxsw-gt-12在畢赤酵母gs115中的表達(dá)量分別為0.28μg/ml、0.27μg/ml、0.21μg/ml、0.23μg/ml、0.25μg/ml，驗(yàn)證了糖基轉(zhuǎn)移酶在酵母菌中表達(dá)的可行性。實(shí)施例3糖基轉(zhuǎn)移酶在枯草芽孢桿菌中重組表達(dá)將糖基轉(zhuǎn)移酶oled及其同源蛋白基因分別構(gòu)建至枯草芽孢桿菌分泌表達(dá)載體pht43，化學(xué)法將重組表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至枯草芽孢桿菌wb800，在含有氨芐青霉素的lb固體培養(yǎng)基上篩選陽性克隆。挑取陽性菌落接種至含氨芐青霉素的lb液體培養(yǎng)基中，37℃培養(yǎng)至od600＝0.5時(shí)，加入iptg誘導(dǎo)過夜，離心獲得培養(yǎng)基上清，sds-page分析上清液中目標(biāo)蛋白的表達(dá)情況。結(jié)果顯示，糖基轉(zhuǎn)移酶oled、hxsw-gt-09、hxsw-gt-10、hxsw-gt-11和hxsw-gt-12在枯草芽孢桿菌wb800中的分泌表達(dá)量高于酵母菌，分別為為0.33μg/ml、0.31μg/ml、0.27μg/ml、0.25μg/ml、0.28μg/ml，驗(yàn)證了糖基轉(zhuǎn)移酶在枯草芽孢桿菌中表達(dá)的可行性。實(shí)施例4糖基轉(zhuǎn)移酶在乳酸菌中重組表達(dá)將糖基轉(zhuǎn)移酶oled及其同源蛋白基因分別構(gòu)建至乳酸菌食品級(jí)表達(dá)載體pnz8148，將重組表達(dá)質(zhì)粒電轉(zhuǎn)至乳酸菌nz9000，在含氯霉素的gm17培養(yǎng)基中篩選陽性菌株。將陽性菌株接種至新鮮gm17培養(yǎng)基培養(yǎng)至od600＝0.6時(shí)，加入乳酸鏈球菌肽誘導(dǎo)，sds-page分析目標(biāo)蛋白的表達(dá)情況。結(jié)果顯示，糖基轉(zhuǎn)移酶oled、hxsw-gt-09、hxsw-gt-10、hxsw-gt-11和hxsw-gt-12在乳酸菌wb800中的表達(dá)量高于枯草芽孢桿菌，分別為為0.54μg/ml、0.57μg/ml、0.42μg/ml、0.19μg/ml、0.38μg/ml，驗(yàn)證了糖基轉(zhuǎn)移酶在乳酸菌中表達(dá)的可行性。實(shí)施例5糖基轉(zhuǎn)移酶在鏈霉菌中重組表達(dá)將糖基轉(zhuǎn)移酶oled及其同源蛋白基因分別構(gòu)建至鏈霉菌游離表達(dá)質(zhì)粒載體pwhm7，通過大腸桿菌-鏈霉菌屬間結(jié)合轉(zhuǎn)移的方法轉(zhuǎn)化至變鉛青鏈霉菌tk24(s.lividanstk24)，篩選陽性菌株后，發(fā)酵培養(yǎng)，通過測(cè)定s.lividanstk24轉(zhuǎn)化子催化甜茶苷的糖基化修飾來評(píng)價(jià)糖基轉(zhuǎn)移酶基因的表達(dá)水平(產(chǎn)物的hplc分析方法見實(shí)施例6)。結(jié)果顯示，糖基轉(zhuǎn)移酶oled、hxsw-gt-09、hxsw-gt-10和hxsw-gt-11能夠催化甜茶苷糖基化，產(chǎn)物的產(chǎn)率分別為53.1％、50.7％、5.8％、11.5％，而hxsw-gt-12無催化功能，驗(yàn)證了糖基轉(zhuǎn)移酶在鏈霉菌中表達(dá)的可行性。實(shí)施例6糖基轉(zhuǎn)移酶催化甜茶苷的糖基化鑒于糖基轉(zhuǎn)移酶大腸桿菌表達(dá)的經(jīng)濟(jì)性、簡(jiǎn)便性和高效性，故本發(fā)明優(yōu)選大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)進(jìn)行后續(xù)的甜茶苷糖基化修飾條件考察。1ml反應(yīng)體系中，底物甜茶苷為0.3mm，udp-葡萄糖為1.2mm，0.05mtris-hcl緩沖液(ph8.0)，糖基轉(zhuǎn)移酶粗酶液500μl，25℃振搖反應(yīng)12小時(shí)。反應(yīng)結(jié)束后，加熱除蛋白，再加入兩倍體積甲醇處理，離心過濾獲得的濾液進(jìn)行hplc分析。以每毫升酶液每小時(shí)催化50μm底物甜茶苷消失的量定義為1u酶活力。oled、hxsw-gt-09、hxsw-gt-10、hxsw-gt-11和hxsw-gt-12的活力分別是1.0u/ml、1.0u/ml、0.2u/ml、0.4u/ml和0u/ml。hplc檢測(cè)條件：色譜柱：agilentc18,5μm,150×4.6mm；流動(dòng)相：a：超純水(含0.1％甲酸)；b：乙腈(含0.1％甲酸)；分析時(shí)間：25min，進(jìn)樣量：20μl，柱溫：35℃，檢測(cè)波長(zhǎng)：220nm；流速：0.8ml/min，梯度洗脫：10％b-95％b。在上述hplc分析條件下，甜茶苷的保留時(shí)間為13.9min，產(chǎn)物為11.5min，結(jié)果如圖1所示。產(chǎn)物經(jīng)制備高效液相制備后獲得純度98.5％的白色固體樣品10mg，nmr圖譜解析后確證產(chǎn)物即為萊鮑迪苷ka(如圖2-7)。根據(jù)面積歸一化法，計(jì)算糖基轉(zhuǎn)移酶催化合成萊鮑迪苷ka的效率，結(jié)果如表2所示。oled、hxsw-gt-09催化效率相當(dāng)，hxsw-gt-12無催化功能，故在后續(xù)的反應(yīng)條件考察中選擇oled和hxsw-gt-09作為考察對(duì)象。表2糖基轉(zhuǎn)移酶催化合成萊鮑迪苷ka的效率糖基轉(zhuǎn)移酶與oled的氨基酸序列同源性萊鮑迪苷ka產(chǎn)率oled100％99.6％hxsw-gt-0998.3％99.5％hxsw-gt-1089.5％18.2％hxsw-gt-1169.5％23.8％hxsw-gt-1258.2％0實(shí)施例7靜息細(xì)胞催化甜茶苷糖基化1ml反應(yīng)體系中，底物甜茶苷為1mm，udp-葡萄糖為4mm或不添加外源性u(píng)dp-葡萄糖，0.05mtris-hcl緩沖液(ph8.0)，含糖基轉(zhuǎn)移酶的靜息細(xì)胞重懸液(酶活力為0.5u)，25℃振搖反應(yīng)12小時(shí)。反應(yīng)結(jié)束后，加入2倍體積甲醇處理，離心過濾獲得的濾液進(jìn)行hplc分析，分析方法見實(shí)施例6。結(jié)果如表3所示。表3靜息細(xì)胞催化合成萊鮑迪苷ka的效率糖基轉(zhuǎn)移酶是否外加udp-葡萄糖萊鮑迪苷ka產(chǎn)率oled是86.3％oled否38.6％hxsw-gt-09是84.9％hxsw-gt-09否36.1％實(shí)施例8原位生物轉(zhuǎn)化50ml的原位體系中，底物甜茶苷為1mm，udp-葡萄糖為4mm或不添加外源性u(píng)dp-葡萄糖，調(diào)節(jié)發(fā)酵液ph至8.0，25℃振搖反應(yīng)12小時(shí)。反應(yīng)結(jié)束后，加入2倍體積甲醇處理，離心過濾獲得的濾液進(jìn)行hplc分析，分析方法見實(shí)施例6。結(jié)果如表4所示。表4萊鮑迪苷ka的原位生物合成原位轉(zhuǎn)化菌株外加udp-葡萄糖萊鮑迪苷ka產(chǎn)率poled是44.7％poled否21.9％pgt-09是45.4％pgt-09否19.8％實(shí)施例9固定化酶催化合成萊鮑迪苷ka分別采用殼聚糖和明膠按照常規(guī)固定化酶制備方法制備固定化oled和固定化hxsw-gt-09用于催化合成萊鮑迪苷ka。1ml反應(yīng)體系中，底物甜茶苷為1mm，udp-葡萄糖為4mm，0.05mtris-hcl緩沖液(ph8.0)，0.5u的固定化糖基轉(zhuǎn)移酶，25℃振搖反應(yīng)12小時(shí)。反應(yīng)結(jié)束后，過濾除去固定化酶，濾液再用2倍體積甲醇處理后，離心進(jìn)行hplc分析，分析方法見實(shí)施例6。結(jié)果顯示，固定化oled和固定化hxsw-gt-09催化合成萊鮑迪苷ka的產(chǎn)率分別是87.8％和84.9％。實(shí)施例10蔗糖-udp-葡萄糖再生循環(huán)系統(tǒng)i采用蔗糖、蔗糖合成酶以及udp組成udp-葡萄糖再生體系用于糖基轉(zhuǎn)移酶制備萊鮑迪苷ka。5ml反應(yīng)體系中，底物甜茶苷為1mm，udp為4mm，2.5u的糖基轉(zhuǎn)移酶，蔗糖0.1m，蔗糖合成酶粗酶液2.5ml，反應(yīng)體系的ph為8.0，25℃振搖反應(yīng)12小時(shí)。反應(yīng)結(jié)束后，煮沸離心除蛋白，再用兩倍體積的甲醇處理后，離心進(jìn)行hplc分析，分析方法見實(shí)施例6。結(jié)果如表5所示。表5萊鮑迪苷ka的合成效率糖基轉(zhuǎn)移酶蔗糖合成酶來源萊鮑迪苷ka產(chǎn)率oledarabidopsisthaliana86.7％oledvignaradiate83.8％hxsw-gt-09arabidopsisthaliana84.4％hxsw-gt-09vignaradiate82.5％實(shí)施例11蔗糖-udp-葡萄糖再生循環(huán)系統(tǒng)ii利用petduet-1共表達(dá)載體構(gòu)建糖基轉(zhuǎn)移酶和蔗糖合成酶的共表達(dá)質(zhì)粒，并獲得相應(yīng)共表達(dá)菌株po-ats、po-vrs、pgt9-ats、pgt9-vrs。共表達(dá)程序與實(shí)施例1相同，表達(dá)條件為0.5mmiptg，20℃、12小時(shí)。表達(dá)完成后利用50ml菌液構(gòu)建原位轉(zhuǎn)化體系：底物甜茶苷為1mm，udp為4mm，蔗糖0.1m，反應(yīng)體系的ph調(diào)節(jié)至8.0，25℃振搖反應(yīng)12小時(shí)。反應(yīng)結(jié)束后，hplc分析萊鮑迪苷ka的合成情況，分析方法見實(shí)施例6。結(jié)果如表6所示。表6萊鮑迪苷ka的合成效率實(shí)施例12蔗糖-udp-葡萄糖再生循環(huán)系統(tǒng)iiipo-ats、po-vrs、pgt9-ats、pgt9-vrs按照實(shí)施例8的條件表達(dá)完成后，收集菌體，然后將菌體按照1:10比例用0.05mtris-hcl(ph8.0)的緩沖液稀釋，構(gòu)建靜息細(xì)胞反應(yīng)體系：底物甜茶苷為1mm，udp為4mm，蔗糖0.1m，25℃振搖反應(yīng)12小時(shí)。反應(yīng)結(jié)束后，hplc分析萊鮑迪苷ka的合成情況，分析方法見實(shí)施例6。結(jié)果如表7所示。表7萊鮑迪苷ka的合成效率實(shí)施例13內(nèi)源性u(píng)dp-葡萄糖合成系統(tǒng)利用pacycduet-1載體將udp-葡萄糖合成途徑中兩個(gè)關(guān)鍵酶葡萄糖磷酸變位酶(pgm)和udp-葡萄糖焦磷酸化酶(galu)一并導(dǎo)入工程菌株poled和pgt-09，獲得內(nèi)源性u(píng)dp-葡萄糖合成途徑改造的大腸桿菌菌株poled-p-g和pgt-09-p-g。誘導(dǎo)表達(dá)條件與實(shí)施例8相同。表達(dá)完成后利用50ml菌液構(gòu)建原位轉(zhuǎn)化體系：底物甜茶苷為1mm，葡萄糖0.05m，反應(yīng)體系的ph調(diào)節(jié)至8.0，25℃振搖反應(yīng)12小時(shí)。反應(yīng)結(jié)束后，hplc分析萊鮑迪苷ka的合成情況，分析方法見實(shí)施例6。結(jié)果如表8所示。表8萊鮑迪苷ka的合成效率實(shí)施例14最佳反應(yīng)ph值鑒于oled催化甜茶苷糖基化的活性強(qiáng)于hxsw-gt-09，所以針對(duì)oled進(jìn)行反應(yīng)條件優(yōu)化?？疾熳罴逊磻?yīng)ph值(5ml)：底物甜茶苷為23.4mm(15mg/ml)，udp-葡萄糖為93.6mm，反應(yīng)ph值為6.0～14.0，2.5uoled粗酶液，25℃振搖反應(yīng)12小時(shí)。反應(yīng)結(jié)束后，加熱除蛋白，再加入2倍體積甲醇處理，離心過濾獲得的濾液進(jìn)行hplc分析，分析方法見實(shí)施例6。不同ph條件下的萊鮑迪苷ka產(chǎn)率如表9所示。根據(jù)結(jié)果，oled催化甜茶苷糖基化制備萊鮑迪苷ka的最佳ph為11.0。表9不同ph條件下的萊鮑迪苷ka產(chǎn)率反應(yīng)ph6.07.08.09.010.011.012.013.014.0產(chǎn)率2.57％14.89％27.62％34.71％47.31％63.26％58.81％23.27％7.18％實(shí)施例15最佳反應(yīng)溫度考察最佳反應(yīng)溫度(5ml)：底物甜茶苷為23.4mm(15mg/ml)，udp-葡萄糖為93.6mm，ph值為11.0，2.5uoled粗酶液，分別于15～40℃振搖反應(yīng)12小時(shí)。反應(yīng)結(jié)束后，加熱除蛋白，再加入2倍體積甲醇處理，離心過濾獲得的濾液進(jìn)行hplc分析，分析方法見實(shí)施例6。不同反應(yīng)溫度下的萊鮑迪苷ka產(chǎn)率如表10所示。根據(jù)結(jié)果，oled催化甜茶苷糖基化制備萊鮑迪苷ka的最佳溫度為30℃。表10不同反應(yīng)溫度下的萊鮑迪苷ka產(chǎn)率反應(yīng)溫度15℃25℃30℃35℃40℃產(chǎn)率49.16％63.26％73.71％70.54％66.82％實(shí)施例16最佳udp-葡萄糖用量考察最佳udp-葡萄糖用量(5ml)：底物甜茶苷為23.4mm(15mg/ml)，udp-葡萄糖為11.7-234mm，ph值為11.0，2.5uoled粗酶液，分別于30℃振搖反應(yīng)12小時(shí)。反應(yīng)結(jié)束后，加熱除蛋白，再加入2倍體積甲醇處理，離心過濾獲得的濾液進(jìn)行hplc分析，分析方法見實(shí)施例6。不同udp-葡萄糖(udpg)用量的萊鮑迪苷ka產(chǎn)率如表11所示。根據(jù)結(jié)果，oled催化甜茶苷糖基化制備萊鮑迪苷ka的最佳udp-葡萄糖用量為140.4mm，其與底物的最佳摩爾濃度比例為6:1。表11不同udp-葡萄糖(udpg)用量的萊鮑迪苷ka產(chǎn)率實(shí)施例17最佳底物濃度和酶用量考察最佳底物濃度(5ml)：底物甜茶苷為1mg/ml-100mg/ml，udp-葡萄糖為底物摩爾濃度的6倍，ph值為11.0，2.5uoled粗酶液，分別于30℃振搖反應(yīng)16小時(shí)。反應(yīng)結(jié)束后，加熱除蛋白，再加入2倍體積甲醇處理，離心過濾獲得的濾液進(jìn)行hplc分析，分析方法見實(shí)施例6。不同甜茶苷濃度條件的萊鮑迪苷ka產(chǎn)率如表12所示。根據(jù)結(jié)果并結(jié)合能量損耗等因素，oled催化甜茶苷糖基化制備萊鮑迪苷ka的最佳底物濃度(mg/ml)和酶活力(u/ml)比值為30：1。表12不同甜茶苷濃度條件的萊鮑迪苷ka產(chǎn)率實(shí)施例18最佳反應(yīng)時(shí)間考察最佳反應(yīng)時(shí)間(5ml)：底物甜茶苷為15mg/ml，udp-葡萄糖為140.4mm，ph值為11.0，2.5uoled粗酶液，分別于30℃振搖反應(yīng)4-72小時(shí)。反應(yīng)結(jié)束后，加熱除蛋白，再加入2倍體積甲醇處理，離心過濾獲得的濾液進(jìn)行hplc分析，分析方法見實(shí)施例6。不同反應(yīng)時(shí)間的萊鮑迪苷ka產(chǎn)率如表13所示。根據(jù)結(jié)果并結(jié)合能量損耗等因素，將oled催化甜茶苷糖基化制備萊鮑迪苷ka的最佳反應(yīng)時(shí)間定為16小時(shí)。表13不同反應(yīng)時(shí)間的萊鮑迪苷ka產(chǎn)率反應(yīng)時(shí)間4hrs8hrs12hrs16hrs24hrs36hrs48hrs72hrs產(chǎn)率73.41％83.22％90.72％96.87％96.93％97.01％97.31％97.11％sequencelisting<110>中國(guó)藥科大學(xué)<120>一種萊鮑迪苷ka的制備方法<130><160>10<170>patentinversion3.5<210>1<211>415<212>prt<213>人工序列<400>1metthrthrglnthrthrproalahisilealametpheserilealaalahisglyhisvalasnproserleugluvalilearggluleuvalalaargglyhisargvalthrtyralaileproprovalphealaasplysvalalaalathrglyalaargprovalleutyrhisserthrleuproglyproaspalaaspproglualatrpglyserthrleuleuaspasnvalglupropheleuasnaspalaileglnalaleuproglnleualaaspalatyralaaspaspileproaspleuvalleuhisaspilethrsertyrproalaargvalleualaargargtrpglyvalproalavalserleuserproasnleuvalalatrplysgly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