本申請為國際申請日2012年10月18日、國際申請?zhí)杙ct/us2012/060875于2014年6月11日進入中國國家階段、申請?zhí)?01280061076.4、發(fā)明名稱“胺陽離子脂質(zhì)及其用途”的分案申請。

相關(guān)申請的交叉引用

本申請要求2011年10月18日提交的美國臨時申請?zhí)?1/548,598的權(quán)益，其公開內(nèi)容通過引用整體并入本文。

本發(fā)明部分涉及胺陽離子脂質(zhì)化合物及其制劑，以及其遞送治療劑、例如核酸分子至細胞的用途。

背景技術(shù)：

核酸分子因為其尺寸和親水性而不能容易地穿過細胞膜。因此，遞送已經(jīng)成為核酸治療、例如反義有效載荷和rnai技術(shù)的主要挑戰(zhàn)中的一個。為了在系統(tǒng)施用之后觸發(fā)rna酶h活性或rnai活性，含有核酸分子的制劑不僅必須(1)防止載荷的酶促和非酶促降解并(2)提供制劑的適當(dāng)生物分布，而且必須(3)允許制劑的細胞攝取或內(nèi)化并(4)促進核酸有效載荷遞送至細胞的細胞質(zhì)。在上述標準1和2方面優(yōu)異的許多制劑在標準3和4方面有缺陷，因此許多核酸制劑顯示了優(yōu)良的生物分布，但是由于缺乏系統(tǒng)遞送和局部遞送而未能敲除靶基因。

因此，需要用于遞送治療劑、例如rnai劑的新化合物。具體地，可以在脂質(zhì)顆粒制劑中使用能夠發(fā)揮陽離子脂質(zhì)作用的化合物以遞送核酸有效載荷至細胞。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

我們已經(jīng)開發(fā)了用于遞送一種或多種治療劑的新的基于胺的脂質(zhì)化合物，包括氨基-胺和氨基酰胺陽離子脂質(zhì)，及其制劑。具體地，本發(fā)明的化合物(例如，式(i)或ii(a)-ii(k)的化合物)可以用于遞送聚陽離子有效載荷或反義有效載荷(例如，核酸分子或rnai劑)至細胞并沉默靶基因。

一方面，本發(fā)明特征為具有下式的化合物：

或其藥學(xué)可接受的鹽，其中

每個r¹和r²獨立地為任選取代的c11-24烷基、任選取代的c11-24烯基、任選取代的c11-24炔基、任選取代的c11-24雜烷基、任選取代的c11-24雜烯基或任選取代的c11-24雜炔基，其中r¹和r²在相鄰>chnr³r⁴的碳上未經(jīng)氧取代；

r³是h或任選取代的c1-6烷基；并且

r⁴是經(jīng)-nr^4ar^4b取代的未取代的c1-6烷基、經(jīng)-nr^4ar^4b進一步取代的取代的c1-6烷基、或任選取代的c3-7雜環(huán)基，其中每個r^4a和r^4b獨立地為h、c(＝nh)nh2或任選取代的c1-6烷基，或者其中r^4a和r^4b結(jié)合在一起形成任選取代的c3-7雜環(huán)基；并且其中r³和r⁴可以結(jié)合在一起形成任選取代的c3-7雜環(huán)基，

其中r³和r⁴不結(jié)合在一起形成任選取代的咪唑基或任選取代的苯并咪唑基或任選取代的琥珀酰亞胺基；其中一個且僅一個伯胺可以存在于r³或r⁴上，或者沒有伯胺存在于r³或r⁴上；并且其中r³或r⁴都不是任選取代的酰胺；并且

其中當(dāng)r¹或r²是飽和c11烷基或飽和c15烷基時，r³不是h；其中當(dāng)r¹或r²是飽和c16烷基或飽和c17烷基時，r¹和r²未經(jīng)羥基取代；其中當(dāng)r¹或r²是飽和c17烷基時，r³或r⁴未經(jīng)羥基取代；并且其中當(dāng)r¹或r²是飽和c18烷基時，r⁴未經(jīng)任選取代的咪唑基取代。

在一些實施方案中，r³是經(jīng)-nr^3ar^3b取代的c1-6烷基并且其中每個r^3a和r^3b獨立地為h或任選取代的c1-6烷基。在特定實施方案中，每個r^3a和r^3b獨立地為h或c1-6烷基。

在一些實施方案中，r⁴是經(jīng)-nr^4ar^4b取代的未取代的c1-6烷基。在特定實施方案中，r⁴是經(jīng)-nr^4ar^4b進一步取代的取代的c1-6烷基(例如，取代的c1-3烷基、取代的c1-2烷基、取代的c1烷基、取代的c2烷基或取代的c3烷基)或c1-6氨基烷基。在一些實施方案中，r⁴是經(jīng)氧取代并且經(jīng)-nr^4ar^4b進一步取代的c1-6烷基。在一些實施方案中，r^4a和r^4b結(jié)合在一起形成任選取代的c3-7雜環(huán)基(例如，任選取代的吡咯烷基、任選取代的咪唑烷基、任選取代的吡唑烷基、任選取代的哌啶基、任選取代的哌嗪基、任選取代的氮雜環(huán)庚烷基、任選取代的吡咯基、任選取代的咪唑基或任選取代的吡唑基)。在一些實施方案中，每個r^4a和r^4b獨立地為任選取代的c1-6烷基。在一些實施方案中，r⁴是經(jīng)任選取代的c3-7雜環(huán)基(例如，本文描述的任何一個)取代的未取代的c1-6烷基。在一些實施方案中，r⁴是經(jīng)任選取代的c3-7雜環(huán)基(例如，任選取代的吡咯烷基、任選取代的咪唑烷基、任選取代的吡唑烷基、任選取代的哌啶基、任選取代的哌嗪基、任選取代的氮雜環(huán)庚烷基、任選取代的吡咯基、任選取代的咪唑基、任選取代的吡唑基、任選取代的吡啶基、任選取代的吡嗪基、任選取代的嘧啶基或任選取代的噠嗪基)進一步取代的取代的c1-6烷基(例如，經(jīng)氧取代)或c1-6氨基烷基。

在一些實施方案中，r³和r⁴結(jié)合在一起形成任選取代的c3-7雜環(huán)基(例如，任選取代的吡咯烷基、任選取代的咪唑烷基、任選取代的吡唑烷基、任選取代的哌啶基、任選取代的哌嗪基、任選取代的氮雜環(huán)庚烷基、任選取代的吡咯基、任選取代的咪唑基、任選取代的吡唑基、任選取代的吡啶基、任選取代的吡嗪基、任選取代的嘧啶基或任選取代的噠嗪基)。

在一些實施方案中，所述化合物具有下式：

或其藥學(xué)可接受的鹽，其中每個r¹和r²獨立地為任選取代的c11-24烷基、任選取代的c11-24烯基、任選取代的c11-24炔基、任選取代的c11-24雜烷基、任選取代的c11-24雜烯基或任選取代的c11-24雜炔基；每個n1和n2獨立地為從0至2的整數(shù)(例如，n1和n2同時為1，或者n1為1并且n2為2)；并且r⁵選自由以下組成的組：h、任選取代的c1-6烷基和任選取代的雜環(huán)基(例如，未取代的c1-6烷基或經(jīng)任選取代的吡咯基、任選取代的咪唑基、任選取代的吡唑基、任選取代的吡啶基、任選取代的吡嗪基、任選取代的嘧啶基或任選取代的噠嗪基取代的c1-6烷基)。在一些實施方案中，所述化合物選自由以下組成的組：l-2、l-5、l-6、l-22、l-23、l-24、l-25、l-26、l-28、l-29、l-45和l-48或其藥學(xué)可接受的鹽。

在一些實施方案中，所述化合物具有下式：

或其藥學(xué)可接受的鹽，其中每個r¹和r²是任選取代的c11-24烷基、任選取代的c11-24烯基、任選取代的c11-24炔基、任選取代的c11-24雜烷基、任選取代的c11-24雜烯基、任選取代的c11-24雜炔基；每個n1和n2獨立地為從0至2的整數(shù)(例如，n1和n2同時為1，或者n1為1并且n2為2)；并且r⁵選自由以下組成的組：h、任選取代的c1-6烷基和任選取代的雜環(huán)基(例如，未取代的c1-6烷基或經(jīng)任選取代的吡咯基、任選取代的咪唑基、任選取代的吡唑基、任選取代的吡啶基、任選取代的吡嗪基、任選取代的嘧啶基或任選取代的噠嗪基取代的c1-6烷基)。在一些實施方案中，所述化合物選自由以下組成的組：l-27和l-47或其藥學(xué)可接受的鹽。

在本文描述的任何一個式(例如，式(i)、(iia)和(iib))的一些實施方案中，r⁵是經(jīng)nr^5ar^5b取代的c1-6烷基，其中每個r^5a和r^5b獨立地為h、任選取代的c1-6烷基(例如，任選取代的c1-6烷基)，并且其中r^5a和r^5b可以結(jié)合在一起形成任選取代的c3-7雜環(huán)基。在一些實施方案中，r⁵是任選取代的雜環(huán)基(例如，任選取代的吡咯烷基、任選取代的咪唑烷基、任選取代的吡唑烷基、任選取代的哌啶基、任選取代的哌嗪基、任選取代的氮雜環(huán)庚烷基、任選取代的吡咯基、任選取代的咪唑基、任選取代的吡唑基、任選取代的吡啶基、任選取代的吡嗪基、任選取代的嘧啶基或任選取代的噠嗪基)。

在一些實施方案中，所述化合物具有下式：

或其藥學(xué)可接受的鹽，其中每個r¹和r²是任選取代的c11-24烷基、任選取代的c11-24烯基、任選取代的c11-24炔基、任選取代的c11-24雜烷基、任選取代的c11-24雜烯基、任選取代的c11-24雜炔基；并且每個n1和n2獨立地為從0至2的整數(shù)(例如，n1和n2同時為1，或者n1為1并且n2為2)。在一些實施方案中，所述化合物為l-46或其藥學(xué)可接受的鹽。

在一些實施方案中，所述化合物具有下式：

或其藥學(xué)可接受的鹽，其中每個r¹和r²獨立地為任選取代的c11-24烷基、任選取代的c11-24烯基、任選取代的c11-24炔基、任選取代的c11-24雜烷基、任選取代的c11-24雜烯基或任選取代的c11-24雜炔基；r³是h或任選取代的c1-6烷基；l¹是任選取代的c1-6亞烷基；并且每個r⁵和r⁶獨立地為h或任選取代的c1-6烷基，或者其中r⁵和r⁶結(jié)合形成任選取代的c3-7雜環(huán)基。

在一些實施方案中，所述化合物具有下式：

或其藥學(xué)可接受的鹽，其中每個r¹和r²獨立地為任選取代的c11-24烷基、任選取代的c11-24烯基、任選取代的c11-24炔基、任選取代的c11-24雜烷基、任選取代的c11-24雜烯基或任選取代的c11-24雜炔基；r³是h或任選取代的c1-6烷基；l¹是任選取代的c1-6亞烷基；并且每個r⁵和r⁶獨立地為h或任選取代的c1-6烷基，或者其中r⁵和r⁶結(jié)合形成任選取代的c3-7雜環(huán)基。

在式(iid)或(iie)的一些實施方案中，r⁵和r⁶結(jié)合形成任選取代的吡咯烷基、任選取代的咪唑烷基、任選取代的吡唑烷基、任選取代的哌啶基、任選取代的哌嗪基或任選取代的氮雜環(huán)庚烷基。

在一些實施方案中，所述化合物選自由以下組成的組：l-1、l-3、l-4、l-7、l-9、l-10、l-11、l-12、l-15、l-16、l-17、l-18、l-19、l-30、l-31、l-32、l-33、l-34、l-42、l-43和l-49或其藥學(xué)可接受的鹽。

在一些實施方案中，所述化合物具有下式：

或其藥學(xué)可接受的鹽，其中每個r¹和r²獨立地為任選取代的c11-24烷基、任選取代的c11-24烯基、任選取代的c11-24炔基、任選取代的c11-24雜烷基、任選取代的c11-24雜烯基或任選取代的c11-24雜炔基；r³是h或任選取代的c1-6烷基；l¹是任選取代的c1-6亞烷基；每個n3和n4獨立地為從0至2的整數(shù)；并且r⁵是h或任選取代的c1-6烷基。

在一些實施方案中，所述化合物選自由以下組成的組：l-14、l-21和l-36或其藥學(xué)可接受的鹽。

在本文描述的任何一個式(例如，式(iid)-(iij)，例如式(iid)-(iig))的一些實施方案中，r³是經(jīng)-nr^3ar^3b取代的c1-6烷基，并且其中每個r^3a和r^3b獨立地為h或任選取代的c1-6烷基。在一些實施方案中，r³是未取代的c1-6烷基。

在本文描述的任何一個式(例如，式(iid)-(iij)，例如式(iid)-(iig))的一些實施方案中，l¹是經(jīng)甲基、乙基、丙基或-nr^lar^lb取代的c1-6亞烷基，其中每個r^la和r^lb獨立地為h或任選取代的c1-6烷基。

在一些實施方案中，所述化合物具有下式：

或其藥學(xué)可接受的鹽，其中每個r¹和r²獨立地為任選取代的c11-24烷基、任選取代的c11-24烯基、任選取代的c11-24炔基、任選取代的c11-24雜烷基、任選取代的c11-24雜烯基或任選取代的c11-24雜炔基；r³是h或任選取代的c1-6烷基；l¹是任選取代的c1-6亞烷基；并且r⁵是h或任選取代的c1-6烷基。

在一些實施方案中，l¹在4-位置連接至咪唑基。

在一些實施方案中，所述化合物選自由以下組成的組：l-8、l-13、l-20、l-35和l-44或其藥學(xué)可接受的鹽。

在一些實施方案中，所述化合物具有下式：

或其藥學(xué)可接受的鹽，其中每個r¹和r²獨立地為任選取代的c11-24烷基、任選取代的c11-24烯基、任選取代的c11-24炔基、任選取代的c11-24雜烷基、任選取代的c11-24雜烯基或任選取代的c11-24雜炔基；r³是h或任選取代的c1-6烷基；l¹是任選取代的c1-6亞烷基；并且每個r⁵和r⁶獨立地為h或任選取代的c1-6烷基。

在一些實施方案中，所述化合物具有下式：

或其藥學(xué)可接受的鹽，其中每個r¹和r²獨立地為任選取代的c11-24烷基、任選取代的c11-24烯基、任選取代的c11-24炔基、任選取代的c11-24雜烷基、任選取代的c11-24雜烯基或任選取代的c11-24雜炔基；r³是h或任選取代的c1-6烷基；并且每個r⁵和r⁶獨立地為h或任選取代的c1-6烷基。

在本文描述的任何一個式(例如，式(iid)-(iik)，例如式(iii)-(iik))的一些實施方案中，每個r⁵和r⁶獨立地為經(jīng)-nr^5ar^5b取代的c1-6烷基，并且其中每個r^5a和r^5b獨立地為h或任選取代的c1-6烷基。

在一些實施方案中，所述化合物選自由以下組成的組：l-37、l-38、l-39、l-40和l-41或其藥學(xué)可接受的鹽。

在本文描述的任何一個式(例如，式(iid)-(iik))的一些實施方案中，l¹是任選取代的c1-6亞烷基。

在本文描述的任何一個式(例如，式(i)或(iia)-(iik))的一些實施方案中，r³是任選取代的c1-6烷基。在一些實施方案中，每個r¹和r²獨立地為包括直鏈和支鏈形式的未取代的c11-24烯基或未取代的c11-24雜烯基(例如，每個r¹和r²獨立地為包含一個或多個雙鍵的未取代的c11-24烯基或未取代的c11-24雜烯基)。在一些實施方案中，r¹或r²中的一個不是飽和的c11-24烷基。在一些實施方案中，r¹和r²都不是飽和的c11-24烷基。在一些實施方案中，每個r¹和r²獨立地選自由以下組成的組：亞麻烯基(c18：3)、亞麻烯基氧基(c18：3)、亞麻?；?c18：3)、亞油烯基(c18：2)、亞油烯基氧基(c18：2)、亞油?；?c18：2)、油烯基(c18：1)、油烯基氧基(18：1)、油烯基氧基亞甲基(18：1)、油?；?c18：1)、油?；鶃喖谆?c18：1)、硬脂基(c18：0)、硬脂基氧基(c18：0)、硬脂酰基(c18：0)、棕櫚基(c16：0)、棕櫚基氧基(c16：0)、棕櫚?；?c16：0)、棕櫚?；鶃喖谆?c16：0)、肉豆蔻基(c14：0)、肉豆蔻基氧基(c14：0)、肉豆蔻?；?c14：0)、月桂基(c12：0)、月桂基氧基(c12：0)和月桂?；?c12：0)，例如亞油烯基(c18：2)或油烯基(c18：1)。在一些實施方案中，r¹和r²相同或不同。

在本文描述的任何一個式(例如，式(i)或(iia)-(iik))的一些實施方案中，r³或r⁴但不是r³和r⁴兩者同時經(jīng)伯胺取代。在一些實施方案中，r³和r⁴不同時經(jīng)伯胺取代。

在本文描述的任何一個式(例如，式(i)或(iia)-(iik))的一些實施方案中，r³和r⁴與它們連接的n一起包含來自表2和3的h-1至h-52中的一個的頭基。在一些實施方案中，每個r¹和r²獨立地選自由以下組成的組：亞麻烯基(c18：3)、亞麻烯基氧基(c18：3)、亞麻?；?c18：3)、亞油烯基(c18：2)、亞油烯基氧基(c18：2)、亞油?；?c18：2)、油烯基(c18：1)、油烯基氧基(18：1)、油烯基氧基亞甲基(18：1)、油?；?c18：1)、油?；鶃喖谆?c18：1)、硬脂基(c18：0)、硬脂基氧基(c18：0)、硬脂酰基(c18：0)、棕櫚基(c16：0)、棕櫚基氧基(c16：0)、棕櫚?；?c16：0)、棕櫚?；鶃喖谆?c16：0)、肉豆蔻基(c14：0)、肉豆蔻基氧基(c14：0)、肉豆蔻?；?c14：0)、月桂基(c12：0)、月桂基氧基(c12：0)和月桂?；?c12：0)，例如每個r¹和r²獨立地為亞油烯基(c18：2)或油烯基(c18：1)。

另一方面，本發(fā)明的化合物包括r¹r²-ch-a，其中r¹和r²是尾基(例如，本文、例如表4中描述的任何一個)，并且a是頭基(例如，本文、例如表2和3中描述的任何一個)。在一些實施方案中，頭基是h-1至h-52中的一個，例如h-2、h-5、h-6、h-19、h-26或h-43(例如，h-5或h-43)。

另一方面，本發(fā)明化合物是表1提供的任何化合物或其藥學(xué)可接受的鹽。

一方面，本發(fā)明特征是包括本文描述的任何化合物(例如，表1提供的一種或多種化合物)或其藥學(xué)可接受的鹽的制劑。

在一些實施方案中，所述制劑包括兩種或多種所述化合物，例如2、3、4、5、6、7或更多種所述化合物。

在一些實施方案中，制劑包括約10％至約80％的所述化合物，例如約10％至約15％、約10％至約20％、約10％至約25％、約10％至約30％、約10％至約35％、約15％至約20％、約15％至約25％、約15％至約30％、約15％至約35％、約15％至約40％、約20％至約25％、約20％至約30％、約20％至約35％、約20％至約40％、約25％至約30％、約25％至約35％、約25％至約40％、約30％至約35％、約30％至約40％、或約35％至約40％的一種或多種本發(fā)明化合物。

在一些實施方案中，制劑還包括陽離子脂質(zhì)(例如，dodma、dotma、dpepc、dodap或dotap)、中性脂質(zhì)(例如，dspc、popc、dope或sm)和任選的甾醇衍生物(例如，膽固醇；膽甾烷酮；膽甾烯酮；糞甾醇；3β-[-(n-(n’，n’-二甲基氨基乙烷)-氨基甲?；鵠膽固醇(dc-膽固醇)；雙胍-三氨乙基胺-膽固醇(bgtc)；(2s，3s)-2-(((3s，10r，13r，17r)-10，13-二甲基-17-((r)-6-甲基庚-2-基)-2，3，4，7，8，9，10，11，12，13，14，15，16，17-十四氫-1h-環(huán)戊二烯并[a]菲-3-基氧基)羰基氨基)乙基2，3，4，4-四羥基丁酸酯(dpc-1)；(2s，3s)-((3s，10r，13r，17r)-10，13-二甲基-17-((r)-6-甲基庚-2-基)-2，3，4，7，8，9，10，11，12，13，14，15，16，17-十四氫-1h-環(huán)戊二烯并[a]菲-3-基)2，3，4，4-四羥基丁酸酯(dpc-2)；雙((3s，10r，13r，17r)-10，13-二甲基-17-((r)-6-甲基庚-2-基)-2，3，4，7，8，9，10，11，12，13，14，15，16，17-十四氫-1h-環(huán)戊二烯并[a]菲-3-基)2，3，4-三羥基戊二酸酯(dpc-3)；或6-(((3s，10r，13r，17r)-10，13-二甲基-17-((r)-6-甲基庚-2-基)-2，3，4，7，8，9，10，11，12，13，14，15，16，17-十四氫-1h-環(huán)戊二烯并[a]菲-3-基氧基)氧代磷?；趸?-2，3，4，5-四羥基己酸酯(dpc-4))。在一些實施方案中，制劑還包括peg-脂質(zhì)軛合物(例如，peg-dmg、peg-dmpe、peg-dppe、peg-dpg、peg-dope或peg-dog)。

在一些實施方案中，制劑包括約10mol％至約40mol％的一種或多種本發(fā)明化合物(例如，一種或多種本文描述、例如表1中的任意化合物)、約10mol％至約40mol％的一種或多種陽離子脂質(zhì)或一種或多種本發(fā)明化合物(例如，一種或多種本文描述、例如表1中的任意化合物)、約1mol％至約20mol％的一種或多種peg-脂質(zhì)軛合物、約5mol％至約20mol％的一種或多種中性脂質(zhì)和約20mol％至約40mol％的一種或多種甾醇衍生物。

在特定實施方案中，制劑包括約10mol％至約80mol％(例如，約40mol％至約55mol％，例如約48mol％)的一種或多種陽離子脂質(zhì)(例如，如本文描述的本發(fā)明化合物和/或其他陽離子脂質(zhì))、約1mol％至約20mol％的一種或多種peg-脂質(zhì)軛合物、約5mol％至約20mol％的一種或多種中性脂質(zhì)、和約20mol％至約40mol％的一種或多種甾醇衍生物。在一些實施方案中，制劑包括約10mol％至約30mol％(例如，約22mol％)的一種或多種本發(fā)明化合物(例如，l-6、l-30和/或本文描述的任何一個)、約15mol％至約35mol％(例如，約26mol％)的一種或多種陽離子脂質(zhì)(例如，dodma或本文描述的任何一個)、約3mol％至約9mol％(例如，約6mol％)的一種或多種peg-脂質(zhì)軛合物(例如，peg-dspe、peg-dmpe、和/或本文描述的任何一個)、約10mol％至約20mol％(例如，約14mol％)的一種或多種中性脂質(zhì)(例如，dspc或本文描述的任何一個)和約20mol％至約40mol％(例如，約29mol％至約33mol％，例如約33mol％)的一種或多種甾醇衍生物(例如，膽固醇、其衍生物或本文描述的任何一個)。

在一些實施方案中，一種或多種本發(fā)明化合物以約10mol％至約40mol％的量存在，例如，約10mol％至約15mol％、約10mol％至約20mol％、約10mol％至約25mol％、約10mol％至約30mol％、約10mol％至約35mol％、約15mol％至約20mol％、約15mol％至約25mol％、約15mol％至約30mol％、約15mol％至約35mol％、約15mol％至約40mol％、約20mol％至約25mol％、約20mol％至約30mol％、約20mol％至約35mol％、約20mol％至約40mol％、約25mol％至約30mol％、約25mol％至約35mol％、約25mol％至約40mol％、約30mol％至約35mol％、約30mol％至約40mol％、或約35mol％至約40mol％(例如，約21.0mol％、21.2mol％、21.4mol％、21.6mol％、21.8mol％、22mol％、25mol％、26mol％、26mol％、30mol％、35mol％或40mol％)的一種或多種本發(fā)明化合物。在一些實施方案中，一種或多種本發(fā)明化合物以約10mol％至約80mol％的量存在，例如，約10mol％至約15mol％、約10mol％至約20mol％、約10mol％至約25mol％、約10mol％至約30mol％、約10mol％至約35mol％、約10mol％至約40mol％、約10mol％至約45mol％、約10mol％至約50mol％、約10mol％至約55mol％、約10mol％至約60mol％、約10mol％至約65mol％、約10mol％至約70mol％、約10mol％至約75mol％、約15mol％至約20mol％、約15mol％至約25mol％、約15mol％至約30mol％、約15mol％至約35mol％、約15mol％至約40mol％、約15mol％至約45mol％、約15mol％至約50mol％、約15mol％至約55mol％、約15mol％至約60mol％、約15mol％至約65mol％、約15mol％至約70mol％、約15mol％至約75mol％、約15mol％至約80mol％、約20mol％至約25mol％、約20mol％至約30mol％、約20mol％至約35mol％、約20mol％至約40mol％、約20mol％至約45mol％、約20mol％至約50mol％、約20mol％至約55mol％、約20mol％至約60mol％、約20mol％至約65mol％、約20mol％至約70mol％、約20mol％至約75mol％、約20mol％至約80mol％、約25mol％至約30mol％、約25mol％至約35mol％、約25mol％至約40mol％、約25mol％至約45mol％、約25mol％至約50mol％、約25mol％至約55mol％、約25mol％至約60mol％、約25mol％至約65mol％、約25mol％至約70mol％、約25mol％至約75mol％、約25mol％至約80mol％、約30mol％至約35mol％、約30mol％至約40mol％、約30mol％至約45mol％、約30mol％至約50mol％、約30mol％至約55mol％、約30mol％至約60mol％、約30mol％至約65mol％、約30mol％至約70mol％、約30mol％至約75mol％、約30mol％至約80mol％、約35mol％至約40mol％、約35mol％至約45mol％、約35mol％至約50mol％、約35mol％至約55mol％、約35mol％至約60mol％、約35mol％至約65mol％、約35mol％至約70mol％、約35mol％至約75mol％、或約35mol％至約80mol％、約40mol％至約45mol％、約40mol％至約50mol％、約40mol％至約55mol％、約40mol％至約60mol％、約40mol％至約65mol％、約40mol％至約70mol％、約40mol％至約75mol％、約40mol％至約80mol％、約45mol％至約50mol％、約45mol％至約55mol％、約45mol％至約60mol％、約45mol％至約65mol％、約45mol％至約70mol％、約45mol％至約75mol％、或約45mol％至約80mol％、約50mol％至約55mol％、約50mol％至約60mol％、約50mol％至約65mol％、約50mol％至約70mol％、約50mol％至約75mol％、或約50mol％至約80mol％(例如，約21.0mol％、21.2mol％、21.4mol％、21.6mol％、21.8mol％、22mol％、25mol％、26mol％、26mol％、30mol％、35mol％、40mol％、45mol％、48mol％、49mol％、50mol％、55mol％、60mol％、65mol％、70mol％或75mol％)的一種或多種本發(fā)明化合物。

在一些實施方案中，一種或多種陽離子脂質(zhì)以約10mol％至約40mol％的量存在，例如，約10mol％至約15mol％、約10mol％至約20mol％、約10mol％至約25mol％、約10mol％至約30mol％、約10mol％至約35mol％、約15mol％至約20mol％、約15mol％至約25mol％、約15mol％至約30mol％、約15mol％至約35mol％、約15mol％至約40mol％、約20mol％至約25mol％、約20mol％至約30mol％、約20mol％至約35mol％、約20mol％至約40mol％、約25mol％至約30mol％、約25mol％至約35mol％、約25mol％至約40mol％、約30mol％至約35mol％、約30mol％至約40mol％、或約35mol％至約40mol％(例如，約25.1mol％、25.2mol％、25.3mol％、25.4mol％、25.5mol％、25.6mol％、25.7mol％、25.8mol％、25.9mol％、26.0mol％、26.2mol％、26.4mol％、26.6mol％、26.8mol％或27mol％)的一種或多種陽離子脂質(zhì)(例如，dodma或本文描述、例如表1中的任何一個)。

在一些實施方案中，一種或多種peg-脂質(zhì)軛合物以約1mol％至約20mol％的量存在，例如，約1mol％至約5mol％、約1mol％至約10mol％、約1mol％至約15mol％、約2mol％至約5mol％、約2mol％至約10mol％、約2mol％至約15mol％、約2mol％至約20mol％、約5mol％至約10mol％、約5mol％至約15mol％、約5mol％至約20mol％、約10mol％至約15mol％、約10mol％至約20mol％、約15mol％至約20mol％(例如，約2.5mol％、2.6mol％、2.7mol％、2.8mol％、2.9mol％、3mol％、3.5mol％、4mol％、4.3mol％、4.5mol％、4.7mol％、5mol％、5.3mol％、5.5mol％、5.7mol％、6mol％、6.5mol％、6.7mol％、7mol％、7.5mol％、8mol％、8.5mol％或9mol％)的一種或多種peg-脂質(zhì)軛合物(例如，peg-dspe、peg-dmpe和/或本文描述的任何一個)。

在一些實施方案中，一種或多種中性脂質(zhì)以約5mol％至約20mol％的量存在，例如，約5mol％至約10mol％、約5mol％至約15mol％、約5mol％至約20mol％、約7mol％至約10mol％、約7mol％至約15mol％、約7mol％至約20mol％、約10mol％至約15mol％、約10mol％至約20mol％、約15mol％至約20mol％(例如，約13.0mol％、13.2mol％、13.4mol％、13.6mol％、13.8mol％、14mol％、14.1mol％、14.3mol％、14.5mol％、14.7mol％或14.9mol％)的一種或多種中性脂質(zhì)(例如，dspc或本文描述的任何一個)。

在一些實施方案中，一種或多種甾醇衍生物以約20mol％至約40mol％的量存在，例如，約20mol％至約25mol％、約20mol％至約30mol％、約20mol％至約35mol％、約25mol％至約30mol％、約25mol％至約35mol％、約25mol％至約40mol％、約30mol％至約35mol％、約30mol％至約40mol％、或約35mol％至約40mol％(例如，約28.4mol％、28.6mol％、28.8mol％、29.0mol％、30mol％、31mol％、32mol％、33mol％、33.2mol％、33.4mol％、33.6mol％、33.8mol％、34mol％、34.4mol％、34.7mol％或34.9mol％)的一種或多種甾醇衍生物(例如，膽固醇或本文描述的任何一個)。

在一些實施方案中，制劑包括一種或多種脂質(zhì)顆粒，包含一種或多種rna結(jié)合劑和一種或多種轉(zhuǎn)染脂質(zhì)，其中所述一種或多種rna結(jié)合劑包括約10mol％至約40mol％的一種或多種陽離子脂質(zhì)或一種或多種本發(fā)明化合物和約0.5mol％至約10mol％的一種或多種peg-脂質(zhì)；并且其中所述一種或多種轉(zhuǎn)染脂質(zhì)包括約10mol％至約40mol％的一種或多種本發(fā)明化合物、約5mol％至約20mol％的一種或多種中性脂質(zhì)、約0.5mol％至約10mol％的一種或多種peg-脂質(zhì)軛合物、和約20mol％至約40mol％的一種或多種甾醇衍生物。其他制劑和百分比如本文描述。

在一些實施方案中，制劑還包括聚陽離子有效載荷或反義有效載荷。在一些實施方案中，聚陽離子有效載荷是rnai劑(例如，dsrna、sirna、mirna、shrna、ptgsrna或dsirna，例如dsirna)。在一些實施方案中，在一些實施方案中，rnai劑具有10至40個核苷酸的長度，例如10至15個核苷酸、10至20個核苷酸、10至25個核苷酸、10至30個核苷酸、10至35個核苷酸、15至20個核苷酸、15至25個核苷酸、15至30個核苷酸、15至35個核苷酸、15至40個核苷酸、16至20個核苷酸、16至25個核苷酸、16至30個核苷酸、16至35個核苷酸、16至40個核苷酸、20至25個核苷酸、18至20個核苷酸、18至25個核苷酸、18至30個核苷酸、18至35個核苷酸、18至40個核苷酸、19至20個核苷酸、19至25個核苷酸、19至30個核苷酸、19至35個核苷酸、19至40個核苷酸、20至30個核苷酸、20至35個核苷酸、20至40個核苷酸、25至35個核苷酸、25至40個核苷酸、30至35個核苷酸、30至40個核苷酸、或35至40個核苷酸的長度，例如25至35個核苷酸的長度，例如16至30個核苷酸的長度，例如19至19個核苷酸的長度。在一些實施方案中，反義有效載荷具有8至50個核苷酸的長度(例如，8至10個核苷酸、8至15個核苷酸、8至15個核苷酸、8至20個核苷酸、8至25個核苷酸、8至30個核苷酸、8至35個核苷酸、8至40個核苷酸、或8至45個核苷酸的長度)，例如，14至35個核苷酸的長度(例如，14至15個核苷酸、14至20個核苷酸、14至25個核苷酸、14至30個核苷酸的長度)，例如，17至24個核苷酸的長度，例如17至20個核苷酸的長度)。

在一些實施方案中，制劑包括約1：10(w/w)至約1：100(w/w)比率的所述聚陽離子有效載荷與所述制劑中存在的總脂質(zhì)，例如約1：10(w/w)至約1：15(w/w)比率、約1：10(w/w)至約1：20(w/w)比率、約1：10(w/w)至約1：40(w/w)比率、約1：10(w/w)至約1：50(w/w)比率、約1：10(w/w)至約1：60(w/w)比率、約1：10(w/w)至約1：70(w/w)比率、約1：10(w/w)至約1：80(w/w)比率、約1：10(w/w)至約1：90(w/w)比率、約1：10(w/w)至約1：95(w/w)比率、約1：20(w/w)至約1：40(w/w)比率、約1：20(w/w)至約1：50(w/w)比率、約1：20(w/w)至約1：60(w/w)比率、約1：20(w/w)至約1：70(w/w)比率、約1：20(w/w)至約1：80(w/w)比率、約1：20(w/w)至約1：90(w/w)比率、約1：20(w/w)至約1：95(w/w)比率、約1：20(w/w)至約1：100(w/w)比率、約1：40(w/w)至約1：50(w/w)比率、約1：40(w/w)至約1：60(w/w)比率、約1：40(w/w)至約1：70(w/w)比率、約1：40(w/w)至約1：80(w/w)比率、約1：40(w/w)至約1：90(w/w)比率、約1：40(w/w)至約1：95(w/w)比率、約1：40(w/w)至約1：100(w/w)比率、約1：50(w/w)至約1：60(w/w)比率、約1：50(w/w)至約1：70(w/w)比率、約1：50(w/w)至約1：80(w/w)比率、約1：50(w/w)至約1：90(w/w)比率、約1：50(w/w)至約1：95(w/w)比率、約1：50(w/w)至約1：100(w/w)比率、約1：60(w/w)至約1：70(w/w)比率、約1：60(w/w)至約1：80(w/w)比率、約1：60(w/w)至約1：90(w/w)比率、約1：60(w/w)至約1：95(w/w)比率、約1：60(w/w)至約1：100(w/w)比率、約1：80(w/w)至約1：90(w/w)比率、約1：80(w/w)至約1：95(w/w)比率、或約1：80(w/w)至約1：100(w/w)比率的聚陽離子有效載荷與所述制劑中存在的總脂質(zhì)。

在一些實施方案中，制劑包括脂質(zhì)體(例如，脂質(zhì)納米顆粒)、脂質(zhì)體復(fù)合物(lipoplex)或膠團。

一方面，本發(fā)明特征為藥物組合物，包含本文描述的任何化合物(例如，一種或多種表1提供的化合物)或其藥學(xué)可接受的鹽、或本文描述的任何制劑；和藥學(xué)可接受的賦形劑。

另一方面，本發(fā)明特征為治療或預(yù)防性治療受試者疾病的方法，所述方法包括給所述受試者施用足以治療所述疾病(例如，肝癌(例如，肝細胞癌、肝母細胞瘤、膽管癌(cholangiocarcinoma)、血管肉瘤或惡性血管瘤)、肺癌(例如，小細胞肺癌、非小細胞肺癌)、前列腺癌或成神經(jīng)細胞瘤)的量的本文描述的任何化合物(例如，一種或多種表1提供的化合物)或其藥學(xué)可接受的鹽、本文描述的任何制劑、或本文描述的任何組合物。本發(fā)明進一步特征為治療或預(yù)防性治療腫瘤疾病和相關(guān)并發(fā)癥的方法，包括但不限于癌(例如，肺、乳腺、胰腺、結(jié)腸、肝細胞、腎、女性生殖道、前列腺、鱗狀細胞原位癌)、淋巴瘤(例如，組織細胞淋巴瘤、非霍奇金淋巴瘤)、men2綜合征、多發(fā)性神經(jīng)纖維瘤(包括schwann細胞瘤)、骨髓增生異常綜合征、白血病、腫瘤血管生成、甲狀腺癌、肝、骨、皮膚、腦、中樞神經(jīng)系統(tǒng)、胰腺、肺(例如，小細胞肺癌、非小細胞肺癌)、乳腺、結(jié)腸、膀胱、前列腺、胃腸道、子宮內(nèi)膜、輸卵管、睪丸和卵巢、胃腸道間質(zhì)腫瘤(gist)、前列腺腫瘤、肥大細胞腫瘤(包括犬肥大細胞腫瘤)、急性髓性骨髓纖維化、白血病、急性淋巴細胞白血病、慢性髓性白血病、慢性淋巴細胞白血病、多發(fā)性骨髓瘤、黑素瘤、肥大細胞增多癥、神經(jīng)膠質(zhì)瘤、成膠質(zhì)細胞瘤、星形細胞瘤、成神經(jīng)細胞瘤、肉瘤(例如，神經(jīng)外胚層起源的肉瘤或平滑肌肉瘤)、腫瘤向其他組織的轉(zhuǎn)移和化療引起的缺氧。

另一方面，本發(fā)明特征為調(diào)節(jié)受試者中靶核酸表達的方法，所述方法包括施用足以減少所述受試者中所述靶基因(例如，本文描述的任何一個，例如，一種或多種選自由以下組成的組的靶基因：abl1、ar、β-連環(huán)蛋白(ctnnb1)、bcl1、bcl2、bcl6、cbfa2、cbl、csf1r、erba1、erba2、erbb1、erbb2、erbb3、erbb4、ets1、ets2、etv6、fgr、fos、fyn、hcr、hras、jun、kras、lck、lyn、met、mdm2、mll1、mll2、mll3、myb、myc、mycl1、mycn、nras、pim1、pml、ret、src、tal1、tal2、tcl3、tcl5、yes、brca1、brca2、madh4、mcc、nf1、nf2、rb1、tp53、wt1、apob100、csn5、cdk6、itgb1、tgfβ1、細胞周期蛋白d1、hepcidin、pcsk9、ttr、plk1和kif1-結(jié)合蛋白)表達的量的本文描述的任何化合物(例如，一種或多種表1提供的化合物)或其藥學(xué)可接受的鹽、本文描述的任何制劑、或本文描述的任何組合物(例如，其中所述方法包括減少受試者中靶基因的表達)。

在另一實施方案中，本發(fā)明特征為每天一次或多次(例如，每天1、2、3或4次)、每周一次或多次(例如，每周2、3、4、5、6或7次)或每月一次或多次(例如，每周2、3、4、5、6、7或10次)給受試者施用一定劑量的本發(fā)明的聚陽離子有效載荷或反義有效載荷。受試者可以任何給藥方案(例如，每天一次或多次(例如，每天1、2、3或4次)、每周一次或多次(例如，每周2、3、4、5、6或7次)或每月一次或多次(例如，每周2、3、4、5、6、7或10次))接受約0.0001至約10mg/kg、例如，約0.0001至約1mg/kg、約0.0001至約5mg/kg、約0.001至約1mg/kg、約0.001至約5mg/kg、約0.001至約10mg/kg、約0.01至約1mg/kg、約0.01至約5mg/kg、約0.01至約10mg/kg、約1至約5mg/kg、或約1至約10mg/kg范圍內(nèi)的聚陽離子有效載荷或反義有效載荷劑量。

在一些實施方案中，本發(fā)明特征為每天一次或多次(例如，每天1、2、3或4次)、每周一次或多次(例如，每周2、3、4、5、6或7次)或每月一次或多次(例如，每周2、3、4、5、6、7或10次)給受試者施用本發(fā)明制劑。受試者可以任何給藥方案(例如，每天一次或多次(例如，每天1、2、3或4次)、每周一次或多次(例如，每周2、3、4、5、6或7次)或每月一次或多次(例如，每周2、3、4、5、6、7或10次))接受約0.001至約200mg/kg、例如，約0.001至約1mg/kg、約0.001至約10mg/kg、約0.001至約20mg/kg、約0.001至約50mg/kg、約0.001至約100mg/kg、約0.01至約1mg/kg、約0.01至約10mg/kg、約0.01至約20mg/kg、約0.01至約50mg/kg、約0.01至約100mg/kg、約0.01至約200mg/kg、約0.1至約1mg/kg、約0.1至約10mg/kg、約0.1至約20mg/kg、約0.1至約50mg/kg、約0.1至約100mg/kg、約0.1至約200mg/kg、約1至約10mg/kg、約1至約20mg/kg、約1至約50mg/kg、約1至約100mg/kg、約1至約200mg/kg、約10至約20mg/kg、約10至約50mg/kg、約10至約100mg/kg、約10至約200mg/kg、約20至約50mg/kg、約20至約100mg/kg、或約20至約200mg/kg范圍內(nèi)的制劑劑量。

另一方面，本發(fā)明特征為將聚陽離子有效載荷或反義有效載荷遞送至特定組織類型的方法?？梢韵蚱溥f送所述有效載荷的特定組織類型的實例包括但不限于肝、胰腺、肺、前列腺、腎、骨髓、脾、胸腺、淋巴結(jié)、腦、脊髓、心、骨骼肌、皮膚、口腔黏膜、食道、胃、回腸、小腸、結(jié)腸、膀胱、子宮頸、卵巢、睪丸、乳腺、腎上腺、脂肪組織(白色和/或棕色)、血液(例如，造血細胞，例如人類造血祖細胞、人類造血干細胞、cd34+細胞、cd4+細胞)、淋巴細胞和其他血細胞譜系。

在上述方面的任何一個，本發(fā)明化合物包括兩個不飽和的脂質(zhì)尾基(例如，每個r¹和r²獨立地為任選取代的c11-24烯基、任選取代的c11-24炔基、任選取代的c11-24雜烯基或任選取代的c11-24雜炔基)。

在上述方面的任何一個，本發(fā)明化合物包括脂質(zhì)尾基，其中這些基團不包括與–chr³r⁴相鄰的氧(例如，每個r¹和r²獨立地為任選取代的c11-24烷基、任選取代的c11-24烯基或任選取代的c11-24炔基)。

在上述方面的任何一個，本發(fā)明化合物包括脂質(zhì)尾基，其中這些基團不包括一種或多種生物可降解基團(例如，一種或多種酯基團)。

在上述方面的任何一個，本發(fā)明化合物包括兩個具有超過11、12、13、14、15、16或18個碳的脂質(zhì)尾基(例如，每個r¹和r²獨立地為任選取代的c17-24烯基、任選取代的c15-24炔基、任選取代的c15-24雜烯基或任選取代的c15-24雜炔基；每個r¹和r²獨立地為任選取代的c16-24烯基、任選取代的c16-24炔基、任選取代的c16-24雜烯基、或任選取代的c16-24雜炔基；每個r¹和r²獨立地為任選取代的c17-24烯基、任選取代的c17-24炔基、任選取代的c17-24雜烯基、或任選取代的c17-24雜炔基；或者每個r¹和r²獨立地為任選取代的c18-24烯基、任選取代的c18-24炔基、任選取代的c18-24雜烯基、或任選取代的c18-24雜炔基)。

在上述方面的任何一個，本發(fā)明化合物不含有脲基(例如，r³或r⁴都不是任選取代的酰胺)。在一些實施方案中，所述化合物不含有氨甲?；?。在一些實施方案中，所述化合物不含有超過一種伯胺基團(例如，在r¹-r⁶的一個或多個中，例如在r³或r⁴中不含有兩個伯胺基團或不含有任何伯胺基團)。在特定實施方案中，所述化合物包括僅一個伯胺或沒有伯胺(例如，在r¹-r⁶的一個或多個中，例如在r³或r⁴中存在僅一個伯胺或沒有伯胺)。

在上述方面的任何一個，本發(fā)明化合物不含有羥基(例如，r¹或r²都沒有經(jīng)1、2或3個羥基取代；或者r³或r⁴都沒有經(jīng)1、2或3個羥基取代)。在一些實施方案中，當(dāng)r¹或r²是飽和c11-24烷基(例如，飽和c15烷基、飽和c16烷基、飽和c17烷基或飽和c18烷基)時，r¹和/或r²未經(jīng)1、2或3個羥基取代。在一些實施方案中，當(dāng)r¹或r²是飽和c11-24烷基(例如，飽和c15烷基、飽和c16烷基、飽和c17烷基或飽和c18烷基)時，r³和/或r⁴未經(jīng)1、2或3個羥基取代。

在上述方面的任何一個，本發(fā)明化合物包括不超過兩個酰胺基團(例如，化合物的頭基中不超過兩個或一個酰胺基團)。在其他實施方案中，化合物在r¹-r⁶的一個或多個中包括0、1或2個酰胺基團(例如，r³或r⁴中0、1或2個酰胺基團)。而在其他實施方案中，化合物可以包括一個且僅一個酰胺基團(例如，可以在r³或r⁴中包括一個且僅一個酰胺基團)。在其他實施方案中，化合物包括一個且僅一個酰胺基團或沒有酰胺基團(例如，在r³或r⁴中包括一個且僅一個酰胺基團或沒有酰胺基團)。

在上述方面的任何一個，本發(fā)明化合物排除了n-(4-n’，n’-二甲基氨基)丁?；?(6z，9z，28z，31z)-三十五烷-6，9，28，31-四烯-19-胺或n-(3-n’，n’-二甲基氨基)丙酰基-(6z，9z，28z，31z)-三十五烷-6，9，28，31-四烯-19-胺或其鹽。在一些實施方案中，本發(fā)明化合物排除了n-甲基-n-(4-n’，n’-二甲基氨基)丁?；?(6z，9z，28z，31z)-三十五烷-6，9，28，31-四烯-19-胺或n-甲基-n-(3-n’，n’-二甲基氨基)丙?；?(6z，9z，28z，31z)-三十五烷-6，9，28，31-四烯-19-胺或其鹽。

在上述方面的任何一個，本發(fā)明化合物排除了n-(4-n’，n’-二甲基氨基)丁?；?(6z，9z，28z)-三十五烷-6，9，28-三烯-19-胺、n-甲基-n-(4-n’，n’-二甲基氨基)丁?；?(6z，9z，28z)-三十五烷-6，9，28-三烯-19-胺、n-(4-n’，n’-二甲基氨基)丁酰基-(6z，9z，28z，31z，34z)-三十五烷-6，9，28，31，34-五烯-19-胺、n-甲基-n-(4-n’，n’-二甲基氨基)丁?；?(6z，9z，28z，31z，34z)-三十五烷-6，9，28，31，34-五烯-19-胺、n-(3-n’，n’-二甲基氨基)丙酰基-(6z，9z，28z)-三十五烷-6，9，28-三烯-19-胺、n-甲基-n-(3-n’，n’-二甲基氨基)丙?；?(6z，9z，28z)-三十五烷-6，9，28-三烯-19-胺、n-(3-n’，n’-二甲基氨基)丙酰基-(6z，9z，28z，31z，34z)-三十五烷-6，9，28，31，34-五烯-19-胺、n-甲基-n-(3-n’，n’-二甲基氨基)丙?；?(6z，9z，28z，31z，34z)-三十五烷-6，9，28，31，34-五烯-19-胺或其鹽。

在上述方面的任何一個，本發(fā)明化合物排除了二((z)-壬-2-烯-1-基)9-((3-(二甲基氨基)丙?；?氨基)十七烷二酸酯、二((z)-壬-2-烯-1-基)9-((4-(二甲基氨基)丁?；?氨基)十七烷二酸酯、二((z)-壬-2-烯-1-基)9-((5-(二甲基氨基)新戊?；?氨基)十七烷二酸酯或其鹽。

在上述方面的任何一個，本發(fā)明化合物具有小于6.2和大于6.5的pka值(例如，如下的pka值：4.0至6.2，例如4.0至5.2、4.0至5.6、或4.0至5.8；或6.5至8.5，例如，6.5至7.0、6.5至7.5、或6.5至8.0)。在特定實施方案中，pka值是約5.0至約6.0(例如，5.0至5.5、5.0至5.6、5.0至5.7、5.0至5.8、5.0至5.9、5.0至6.0、5.2至5.5、5.2至5.6、5.2至5.7、5.2至5.8、5.2至5.9、5.2至6.0、5.4至5.5、5.4至5.6、5.4至5.7、5.4至5.8、5.4至5.9、5.4至6.0、5.6至5.7、5.6至5.8、5.6至5.9、或5.6至6.0)。pka值可以通過任何有用的方法測定，例如，測量2-(對-甲苯氨基)-6-萘磺酸(tns)的熒光、ζ電勢測量值等。在特定實施方案中，pka值是帶電陽離子脂質(zhì)的濃度和未帶電脂質(zhì)的濃度之比(例如，通過原位tns熒光滴定測定的，其中pka測定為在半數(shù)最大熒光強度處的ph)。

定義

如本文使用的，術(shù)語“約”表示引用值的平均值±10％。

除非另外指明，“烯基”表示含有一個或多個碳-碳雙鍵的2至24個碳原子的單價直鏈或支鏈基團。烯基的實例有乙烯基、1-丙烯基、2-丙烯基、2-甲基-1-丙烯基、1-丁烯基、2-丁烯基、油烯基、亞油烯基、亞麻烯基等。術(shù)語“cx-y烯基”代表具有x至y個碳的烯基。x的示例性值是2、3、4、5和11；y的示例性值是3、4、5、6和24；并且x至y的示例性值是2至10、2至9、2至8、2至7、2至6、2至5、2至4、10至24、11至24、12至24、14至24、16至24、18至24、10至22、11至22、12至22、14至22、16至22、18至22、10至20、11至20、12至20、14至20、16至20、或18至20。在一些實施方案中，烯基可以經(jīng)1、2、3或4個本文針對烷基所定義的取代基進一步取代。

除非另外指明，“烷基”表示1至24個碳原子的單價直鏈或支鏈飽和基團。烷基的實例有甲基、乙基、正丙基、異丙基、正丁基、仲丁基、異丁基、叔丁基、新戊基、月桂基、肉豆蔻基、棕櫚基、硬脂基等，并且可以任選地經(jīng)1、2、3或在兩個碳或更多碳的烷基情況下經(jīng)4個取代基取代，所述取代基獨立地選自由以下組成的組：(1)烷氧基；(2)如本文定義的氨基；(3)鹵素，例如f、cl、br或i；(4)(雜環(huán)基)氧基；(5)雜環(huán)基；(6)烷基；(7)烯基；(9)炔基；(10)環(huán)烷基；(11)羥基；(12)硝基；或(13)氧(例如，醛或?；?。在一些實施方案中，這些基團的每一個可以如本文描述的進一步取代。術(shù)語“cx-y烷基”代表具有x至y個碳的烷基。x的示例性值是1、2、3、4、5和11；y的示例性值是2、3、4、5、6和24；并且x至y的示例性值是1至10、1至9、1至8、1至7、1至6、1至5、1至4、10至24、11至24、12至24、14至24、16至24、18至24、10至22、11至22、12至22、14至22、16至22、18至22、10至20、11至20、12至20、14至20、16至20、或18至20。

如本文使用的，術(shù)語“亞烷基”和前綴“烷-”代表通過去除兩個氫原子而從直鏈或支鏈烴衍生的多價(例如，二價)烴基。亞烷基的實例有甲撐、乙撐、異丙撐等。術(shù)語“cx-y亞烷基”代表具有x至y個碳的亞烷基基團。x的示例性值是1、2、3、4和5，并且y的示例性值是2、3、4、5和6。在一些實施方案中，亞烷基可以經(jīng)1、2、3或4個如本文針對烷基定義的取代基進一步取代。

除非另外指明，“炔基”表示含有一個或多個碳-碳三鍵的2至24個碳原子的單價直鏈或支鏈基團。炔基實例有乙炔、1-丙炔等。術(shù)語“cx-y炔基”代表具有x至y個碳的炔基。x的示例性值是2、3、4、5和11；y的示例性值是3、4、5、6和24；并且x至y的示例性值是2至10、2至9、2至8、2至7、2至6、2至5、2至4、10至24、11至24、12至24、14至24、16至24、18至24、10至22、11至22、12至22、14至22、16至22、18至22、10至20、11至20、12至20、14至20、16至20、或18至20。在一些實施方案中，炔基可以經(jīng)1、2、3或4個本文針對烷基所定義的取代基進一步取代。

“酰胺”表示通過羰基與母分子基團連接的如本文定義的胺基。

如本文使用的，“氨基”表示–n(rⁿ¹)2，其中每個rⁿ¹獨立地為h、oh、no2、n(rⁿ²)2、so2orⁿ²、so2rⁿ²、sorⁿ²、n-保護基、烷基、烯基、炔基、烷氧基、芳基、烷芳基、環(huán)烷基、烷環(huán)烷基、雜環(huán)基(例如，雜芳基)、烷雜環(huán)基(例如，烷雜芳基)，或者兩個rⁿ¹結(jié)合形成雜環(huán)基或n-保護基，并且其中每個rⁿ²獨立地為h、烷基或芳基。在一個優(yōu)選的實施方案中，氨基是–nh2或–nhrⁿ¹，其中rⁿ¹獨立地為oh、no2、nh2、nrⁿ²2、so2orⁿ²、so2rⁿ²、sorⁿ²、烷基或芳基，并且每個rⁿ²可以是h、烷基或芳基?！安贰北硎揪哂薪Y(jié)構(gòu)–nh2的基團。

如本文使用的，術(shù)語“氨基烷基”代表經(jīng)本文定義的氨基取代的如本文定義的烷基。烷基和氨基各自可以經(jīng)1、2、3或4個本文針對各個基團描述的取代基進一步取代。

如本文使用的，術(shù)語“氨甲?；敝妇哂薪Y(jié)構(gòu)-nrⁿ¹c(＝o)or或-oc(＝o)n(rⁿ¹)2的氨基甲酸酯基團，其中每個rⁿ¹的含義參見本文提供的“氨基”的定義，并且r是如本文定義的烷基、環(huán)烷基、烷環(huán)烷基、芳基、烷芳基、雜環(huán)基(例如，雜芳基)或烷雜環(huán)基(例如，烷雜芳基)。

如本文使用的，術(shù)語“羰基”代表c(o)基團，其還可以表示為c＝o。

“環(huán)烷基”表示單價飽和或部分不飽和的3-至10-元單環(huán)或多環(huán)(例如，雙環(huán)或三環(huán))烴環(huán)系統(tǒng)。實例包括環(huán)丙基、環(huán)丁基、環(huán)戊基、環(huán)己基和環(huán)庚基。

如本文使用的，術(shù)語“鹵素”表示選自溴、氯、碘或氟的鹵素。

“雜烯基”表示如本文定義的烯基，其中一個或多個組成的碳原子已經(jīng)各自被o、n或s所替代。示例性的雜烯基包括經(jīng)氧基取代和/或通過氧原子與母分子基團連接的如本文描述的烯基。在一些實施方案中，雜烯基可以經(jīng)1、2、3或4個本文針對烷基描述的取代基進一步取代。

“雜烷基”表示如本文定義的烷基，其中一個或多個組成碳原子已經(jīng)各自被o、n或s替代。示例性的雜烷基包括經(jīng)氧基取代和/或通過氧原子與母分子基團連接的如本文描述的烷基。在一些實施方案中，雜烷基可以經(jīng)1、2、3或4個本文針對烷基描述的取代基進一步取代。

如本文使用的，術(shù)語“雜亞烷基”指如本文定義的亞烷基基團，其中1或2個組成碳原子各自已經(jīng)被o、n或s替代。在一些實施方案中，雜亞烷基基團可以經(jīng)1、2、3或4個本文針對亞烷基基團描述的取代基進一步取代。術(shù)語“cx-y雜亞烷基”代表具有x至y個碳的雜亞烷基基團。x的示例性值是1、2、3、4、5和11；y的示例性值是2、3、4、5、6和24；并且x至y的示例性值是1至10、1至9、1至8、1至7、1至6、1至5、1至4、10至24、11至24、12至24、14至24、16至24、18至24、10至22、11至22、12至22、14至22、16至22、18至22、10至20、11至20、12至20、14至20、16至20或18至20。

“雜炔基”表示如本文定義的炔基，其中一個或多個組成碳原子已經(jīng)各自被o、n或s替代。示例性的雜炔基包括經(jīng)氧基取代和/或通過氧原子與母分子基團連接的如本文描述的炔基。在一些實施方案中，雜炔基可以經(jīng)1、2、3或4個本文針對烷基描述的取代基進一步取代。

如本文使用的，術(shù)語“雜芳基”表示作為芳香族的如本文定義的雜環(huán)基子集：即，它們含有單環(huán)或多環(huán)系統(tǒng)內(nèi)的4n+2pi電子。在一些實施方案中，雜芳基經(jīng)1、2、3或4個本文針對雜環(huán)基描述的取代基取代。

除非另外指明，如本文使用的術(shù)語“雜環(huán)基”表示含有1、2、3或4個雜原子的3-、4-、5-、6-、7-或8-元環(huán)，所述雜原子獨立地選自由氮、氧和硫組成的組。雜環(huán)基可以是飽和的或不飽和的，并且含有0至3個不飽和鍵。例如，5-元環(huán)具有0至2個雙鍵，并且6-和7-元環(huán)具有0至3個雙鍵。某些雜環(huán)基包括2至9個碳原子，例如3至7個碳原子。其他此類基團可以包括最多12個碳原子。術(shù)語“雜環(huán)基”還表示具有橋接多環(huán)結(jié)構(gòu)的雜環(huán)化合物，其中一個或多個碳和/或雜原子橋接單環(huán)、例如奎寧環(huán)基的兩個非相鄰成員。雜環(huán)基的實例包括氮丙啶基、吖丁啶基、吡咯啉基、吡咯基、吡咯烷基、吡唑基、吡唑啉基、吡唑烷基、咪唑基、咪唑啉基、咪唑烷基、吡啶基、嘧啶基、哌啶基、氮雜環(huán)庚烷基、吡嗪基、哌嗪基、二氮雜環(huán)庚烷基、嗎啉基、四氫呋喃基、二氫呋喃基等。

如本文使用的，術(shù)語“(雜環(huán)基)氧基”表示通過氧原子與母分子基團連接的如本文定義的雜環(huán)基。在一些實施方案中，雜環(huán)基可以經(jīng)1、2、3或4個如本文定義的取代基取代。

如本文使用的，術(shù)語“(雜環(huán)基)?；北硎就ㄟ^羰基連接至母分子基團的如本文定義的雜環(huán)基。在一些實施方案中，雜環(huán)基可以經(jīng)1、2、3或4個如本文定義的取代基取代。

如本文使用的，術(shù)語“羥基”表示-oh基團。

“連接體”表示含有一個或多個原子的任選取代的多價(例如，二價)基團。連接體的實例包括任選取代的如本文定義的亞烷基和雜亞烷基基團。

如本文使用的，術(shù)語“n-保護基”表示預(yù)期保護氨基在合成過程中免受不希望的反應(yīng)的那些基團。常用的n-保護基公開于greene，“protectivegroupsinorganicsynthesis，”第3版(johnwiley&sons，newyork，1999)，其通過引用并入本文。n-保護基包括?；?、芳基?；虬奔柞；?，例如甲?；?、乙?；?、丙?；⑿挛祯；⑹宥』阴；?-氯乙?；?-溴乙?；?、三氟乙?；⑷纫阴；?、鄰苯二甲酰基、鄰硝基苯氧基乙?；?、α-氯丁?；⒈郊柞；?、4-氯苯甲?；?、4-溴苯甲?；?、4-硝基苯甲?；?，和手性助劑，例如保護或未保護的d、l或d，l-氨基酸，例如丙氨酸、亮氨酸、苯丙氨酸等；含磺?；幕鶊F，例如苯磺酰基、對甲苯磺酰基等；氨基甲酸酯形成基團，例如芐基氧基羰基、對-氯芐基氧基羰基、對-甲氧基芐基氧基羰基、對-硝基芐基氧基羰基、2-硝基芐基氧基羰基、對-溴芐基氧基羰基、3，4-二甲氧基芐基氧基羰基、3，5-二甲氧基芐基氧基羰基、2，4-二甲氧基芐基氧基羰基、4-甲氧基芐基氧基羰基、2-硝基-4，5-二甲氧基芐基氧基羰基、3，4，5-三甲氧基芐基氧基羰基、1-(對-聯(lián)苯基)-1-甲基乙氧基羰基、α，α-二甲基-3，5-二甲氧基芐基氧基羰基、二苯甲基氧基羰基、叔丁基氧基羰基、二異丙基甲氧基羰基、異丙基氧基羰基、乙氧基羰基、甲氧基羰基、烯丙基氧基羰基、2，2，2，-三氯乙氧基羰基、苯氧基羰基、4-硝基苯氧基羰基、芴基-9-甲氧基羰基、環(huán)戊基氧基羰基、金剛烷基氧基羰基、環(huán)己基氧基羰基、苯基硫代羰基等，烷芳基，例如芐基、三苯基甲基、芐基氧基甲基等，和甲硅烷基，例如三甲基甲硅烷基等。優(yōu)選的n-保護基是甲酰基、乙酰基、苯甲酰基、新戊?；?、叔丁基乙?；?、丙氨酰基、苯磺?；?、芐基、叔丁基氧基羰基(boc)和芐基氧基羰基(cbz)。

如本文使用的，術(shù)語“氧代”表示＝o。

術(shù)語“脲”指具有結(jié)構(gòu)nrⁿ¹c(＝o)nrⁿ¹的基團，其中每個rⁿ¹的含義參見本文提供的“氨基”的定義。

劑的“足量”表示足以實現(xiàn)有益或想要結(jié)果、例如臨床結(jié)果的劑的量，因此，足量取決于其應(yīng)用的上下文。例如，在施用降低靶基因表達水平的制劑的上下文中，制劑的足量是足以實現(xiàn)靶基因表達水平與不施用制劑時獲得的反應(yīng)相比減少的量。

“陰離子脂質(zhì)”表示在生理ph下具有凈負電荷的任何脂質(zhì)分子。

如本文使用的，術(shù)語“反義化合物”或“反義有效載荷”特別涵蓋單鏈反義寡核苷酸(dna、dna樣、rna、rna樣)或包含反義定向寡核苷酸、反義pna、核酶和外部指導(dǎo)序列(募集rna酶p的序列，如例如guerrier-takada等人，proc.natl.acad.sci.usa94：8468，1997中所描述的)的某些雙鏈或自雜交構(gòu)建體。反義化合物可以通過許多方式發(fā)揮其作用。一種方式是反義介導(dǎo)定向真核生物中的內(nèi)源性核酸酶、例如rna酶h或原核生物中的rna酶p(chiang等人，j.biol.chem.1266：18162，1991；forster等人，science，249：783，1990)。

“陽離子脂質(zhì)”表示在生理ph下具有凈正電荷的任何脂質(zhì)分子。示例性陽離子脂質(zhì)包括本文描述的、例如表1中的任何一個。

“dicer-底物rna”或“dsirna”表示能夠基因沉默的一類25-35(例如，25-27，例如27)核苷酸雙鏈分子。由于其與其他rnai劑相比更長的長度，dsirna很可能是dicer的底物。

“雙鏈分子”表示可用于通過rna干擾沉默基因產(chǎn)物的雙鏈rna：rna或rna：dna分子。

“表達”表示通過本領(lǐng)域已知的方法檢測基因或多肽。例如，經(jīng)常通過southern印跡或聚合酶鏈式反應(yīng)(pcr)檢測dna表達，并且經(jīng)常通過northern印跡、rt-pcr、基因芯片技術(shù)或rna酶保護測定來檢測rna表達。測量蛋白質(zhì)表達水平的方法一般包括但不限于western印跡、免疫印跡、酶聯(lián)免疫吸附測定(elisa)、放射性免疫測定(ria)、免疫沉淀、免疫熒光、表面等離子共振、化學(xué)發(fā)光、熒光偏振、磷光、免疫組織化學(xué)分析、基質(zhì)輔助激光解吸/電離飛行時間(maldi-tof)質(zhì)譜、顯微細胞計量術(shù)(microcytometry)、顯微鏡檢查法、熒光激活的細胞分選(facs)和流式細胞儀以及基于蛋白性質(zhì)的測定，包括但不限于酶活性或與其他蛋白配偶體的相互作用。

“雜交”表示如本文定義的足夠互補的多核苷酸或其部分在各種嚴格度條件下配對形成雙鏈分子。(參見例如，wahl等人，methodsenzymol.152：399(1987)；kimmel，methodsenzymol.152：507(1987))。例如，高嚴格度鹽濃度通常小于約750mmnacl和75mm檸檬酸三鈉、小于約500mmnacl和50mm檸檬酸三鈉或小于約250mmnacl和25mm檸檬酸三鈉。低嚴格度雜交可以在有機溶劑、例如甲酰胺缺乏下獲得，而高嚴格度雜交可以在至少約35％甲酰胺或至少約50％甲酰胺存在下獲得。高嚴格度溫度條件通常將包括至少約30℃、37℃或42℃的溫度。各種其他參數(shù)，例如雜交時間、去污劑例如十二烷基硫酸鈉(sds)的濃度和加入或排除載體dna是本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的。通過按需要組合這些各種條件來實現(xiàn)各種嚴格度水平。在一個實施方案中，雜交將在750mmnacl、75mm檸檬酸三鈉和1％sds中30℃下進行。在一個可選實施方案中，雜交在ph6.4下、在50℃或70℃下、在400mmnacl、40mmpipes和1mmedta中進行，雜交持續(xù)12-16小時之后，進行洗滌。額外的優(yōu)選雜交條件包括在70℃在lxssc中或在50℃在lxssc、50％甲酰胺中雜交，隨后在70℃在0.3xssc中洗滌，或者在70℃在4xssc或在50℃在4xssc、50％甲酰胺中雜交，隨后在67℃在lxssc中洗滌。針對這些條件的有用變化對于本領(lǐng)域技術(shù)人員而言是特別明顯的。一種這樣的示例性變化包括評估設(shè)計以模擬生理細胞內(nèi)條件的條件下的雜交，其中陽離子和陰離子以如下比例配合：對于陽離子，鈉：鉀：鈣：鎂為10：160：2：26；并且對于陰離子，氯離子：碳酸氫根：磷酸根：硫酸根：葡萄糖酸根為3：10：100：20：65。

“脂質(zhì)載體”表示脂質(zhì)體、脂質(zhì)體復(fù)合物(lipoplex)、膠團、脂質(zhì)納米顆粒、基于核心的顆粒、與轉(zhuǎn)染脂質(zhì)結(jié)合的包含rna結(jié)合劑-rna聚集物的顆粒、或包含一種或多種本發(fā)明化合物的基于囊的顆粒。

“微rna”(mirna)表示可用來通過rna干擾沉默基因產(chǎn)物的單鏈rna分子。

“調(diào)節(jié)”表示基因表達、或者編碼一種或多種蛋白或蛋白亞基的rna分子或等同rna分子的水平、或者一種或多種蛋白或蛋白亞基的活性被上調(diào)或下調(diào)，使得表達、水平或活性大于或小于在缺乏調(diào)節(jié)劑時所觀察到的。例如，術(shù)語調(diào)節(jié)可以包括抑制或基因沉默，并且基因表達水平或rna分子水平或其等同物與對照相比降低至少10％(例如，15％、20％、25％、30％、35％、40％、50％、60％、70％、80％、85％、90％、95％、97％、98％、99％或100％)。

“中性脂質(zhì)”表示在生理ph下以不帶電或中性兩性離子形式存在的任何脂質(zhì)分子。

“聚陽離子有效載荷”表示包含多個帶負電荷原子的化學(xué)部分，其可加入制劑。聚陽離子有效載荷的實例包括核酸、rnai劑、sirna、dsrna、mirna、shrna、dsirna和反義有效載荷。

“rna結(jié)合劑”表示能夠結(jié)合或雜交核酸、例如治療制劑的核酸有效載荷的任何劑或劑組合。rna結(jié)合劑包括本文描述的任何脂質(zhì)(例如，一種或多種陽離子脂質(zhì)，一種或多種陽離子脂質(zhì)的組合、例如本文描述或表1中的那些，以及一種或多種陽離子脂質(zhì)和任何其他脂質(zhì)的組合、例如中性脂質(zhì)或peg-脂質(zhì)軛合物)。rna結(jié)合劑可以在制劑內(nèi)形成任何有用的結(jié)構(gòu)，例如內(nèi)部聚集體。

“rnai劑”表示通過雜交靶核酸而發(fā)揮基因沉默作用的任何劑或化合物。rnai劑包括能夠介導(dǎo)序列特異性rnai(例如，在嚴格條件下)的任何核酸分子，例如，短干擾rna(sirna)、雙鏈rna(dsrna)、微rna(mirna)、短發(fā)夾rna(shrna)、短干擾寡核苷酸、短干擾核酸、短干擾修飾的寡核苷酸、化學(xué)修飾的sirna、轉(zhuǎn)錄后基因沉默rna(ptgsrna)和dicer-底物rna(dsirna)。

“短發(fā)夾rna”或“shrna”表示形成緊密發(fā)夾環(huán)并且能夠基因沉默的rna序列。

“有義區(qū)”表示與另一核酸的反義區(qū)具有足夠互補性的本發(fā)明核酸的核苷酸序列。此外，本發(fā)明核酸的有義區(qū)可以包括與靶基因核苷酸序列具有同源性的核苷酸序列?！胺戳x區(qū)”表示與靶基因核苷酸序列具有足夠互補性的本發(fā)明核酸的核苷酸序列。

“沉默”或“基因沉默”表示基因表達或者編碼一種或多種蛋白的rna分子的水平在rnai劑存在下減少至低于對照條件下所觀察到的(例如，在缺乏rnai劑或者存在失活或減弱分子、例如具有錯亂序列或錯配的rnai分子下)?；虺聊梢允够虍a(chǎn)物表達減少1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、50％、60％、70％、80％、85％、90％、95％、97％、98％、99％或100％(即，完全抑制)。

“小抑制rna”、“短干擾rna”或“sirna”表示能夠基因沉默的一類10-40(例如，15-25，例如21)核苷酸雙鏈分子。最值得注意的，sirna通常參與rna干擾(rnai)途徑，sirna借助該途徑干擾特定基因產(chǎn)物的表達。

“基本同一性”或“基本上同一的”表示多肽或多核苷酸序列，其分別與參考序列具有相同的多肽或多核苷酸序列，或者分別具有指定百分比的在兩條序列最佳比對時在參考序列內(nèi)的相應(yīng)位置相同的氨基酸殘基或核苷酸。例如，與參考序列“基本上同一的”氨基酸序列具有與參考氨基酸序列至少50％、60％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的同一性。對于多肽，對比序列的長度一般是至少5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20個連續(xù)氨基酸，更優(yōu)選至少25、50、75、90、100、150、200、250、300或350個連續(xù)氨基酸，并且最優(yōu)選是全長氨基酸序列。對于核酸，對比序列的長度一般是至少5個連續(xù)核苷酸，優(yōu)選至少10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24或25個連續(xù)核苷酸，并且最優(yōu)選是全長核苷酸序列?？梢允褂眯蛄蟹治鲕浖谀J設(shè)置來測量序列同一性(例如，sequenceanalysissoftwarepackageofthegeneticscomputergroup，universityofwisconsinbiotechnologycenter，1710universityavenue，madison，wi53705)。這種軟件可以通過給各種取代、缺失和其他修飾分配同源性度來匹配相似序列。

“足夠互補的”表示多核苷酸序列，其與靶核酸具有精確互補多核苷酸序列，或者具有指定百分比的在兩條序列最佳比對時在靶核酸內(nèi)的相應(yīng)位置精確互補的核苷酸。例如，與靶核酸序列“基本上互補的”多核苷酸序列與靶核酸序列具有至少50％、60％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％互補性。對于具有10至40個核苷酸長度的rnai劑，足夠互補的序列包括具有1、2、3、4或5個非互補核苷酸的那些。實際上，在包括例如dsirna劑的某些實施方案中，活性雙鏈rnai劑可以具有少達15至19個連續(xù)核苷酸的與靶核酸足夠互補的指導(dǎo)鏈，而不要求指導(dǎo)鏈的其余部分具有與靶核酸任何程度的互補性(盡管在某些實施方案中，指導(dǎo)鏈的其余部分可以部分或完全地與靶向的核酸(例如，mrna)互補。

“靶核酸”表示其表達或活性待調(diào)節(jié)的任何核酸序列。靶核酸可以是dna或rna。在某些實施方案中，靶核酸是靶mrna。

“轉(zhuǎn)染脂質(zhì)”表示能夠遞送核酸、例如核酸有效載荷的任何脂質(zhì)或脂質(zhì)組合(任選地，核酸有效載荷與rna結(jié)合劑、例如一種或多種陽離子脂質(zhì)結(jié)合)。轉(zhuǎn)染脂質(zhì)包括本文描述的任何脂質(zhì)(例如，一種或多種陽離子脂質(zhì)，一種或多種陽離子脂質(zhì)的組合、例如本文描述或表1中的那些，以及一種或多種陽離子脂質(zhì)和任何其他脂質(zhì)或劑的組合、例如中性脂質(zhì)、陰離子脂質(zhì)、peg-脂質(zhì)軛合物或甾醇衍生物)。轉(zhuǎn)染脂質(zhì)或包括這種轉(zhuǎn)染脂質(zhì)的組合可以在制劑內(nèi)形成任何有用的結(jié)構(gòu)，例如外部聚集體表面。

“藥物組合物”表示含有本文描述的化合物的組合物，其用藥學(xué)可接受賦形劑配制并經(jīng)政府監(jiān)管機構(gòu)批準作為用于治療哺乳動物疾病的治療方案的部分而生產(chǎn)或銷售。藥物組合物可以被配制用于例如以單位劑量形式(例如，片劑、膠囊、薄膜衣片(caplet)、囊形片(gelcap)或糖漿)的口服施用；用于局部施用(例如，作為乳霜、凝膠、洗劑或軟膏)；用于靜脈內(nèi)施用(例如，作為不含栓子粒子的無菌溶液和在適合靜脈內(nèi)使用的溶劑系統(tǒng)中)；或者以本文描述的任何其他制劑。

“藥學(xué)可接受的賦形劑”表示不同于本文描述的化合物并且在患者中具有非毒性和非炎性性質(zhì)的任何成分(例如，能夠懸浮或溶解活性化合物的媒介物)。賦形劑可以包括例如：防粘劑、抗氧化劑、粘合劑、包衣、壓縮助劑、崩解劑、染料(著色劑)、軟化劑、乳化劑、填充劑(稀釋劑)、成膜劑或包衣、調(diào)味劑、香味劑、助流劑(流動增強劑)、潤滑劑、防腐劑、印墨、吸收劑、懸浮或分散劑、增添劑和水合水。示例性的賦形劑包括但不限于：丁基化羥基甲苯(bht)、碳酸鈣、磷酸鈣(二堿式)、硬脂酸鈣、交聯(lián)羧甲基纖維素、交聯(lián)聚乙烯比咯烷酮、檸檬酸、交聚維酮、半胱氨酸、乙基纖維素、明膠、羥丙基纖維素、羥丙基甲基纖維素、乳糖、硬脂酸鎂、麥芽糖醇、甘露糖醇、蛋氨酸、甲基纖維素、伯尼金甲酯、微晶纖維素、聚乙二醇、聚乙烯比咯烷酮、聚維酮、預(yù)膠化淀粉、伯尼金丙酯、棕櫚酸視黃酯、紫膠、二氧化硅、羧甲基纖維素鈉、檸檬酸鈉、羥乙酸淀粉鈉、山梨糖醇、淀粉(玉米)、硬脂酸、蔗糖、滑石、二氧化鈦、維生素a、維生素e、維生素c和木糖醇。

“藥學(xué)可接受的鹽”表示在合理醫(yī)療判斷范圍內(nèi)適合用于與人和動物組織接觸而無過度毒性、刺激、變應(yīng)性反應(yīng)等并且與合理益處/風(fēng)險比相稱的那些鹽。藥學(xué)可接受的鹽是本領(lǐng)域公知的。例如，藥學(xué)可接受的鹽描述于：berge等人，j.pharm.sci.66(1)：1，1977和pharmaceuticalsalts：properties，selection，anduse，p.h.stahl和c.g.wermuth(編輯)，wiley-vch，2008。鹽可以在本發(fā)明化合物的最后分離和純化期間原位制備或者單獨地通過使游離堿基于適合的有機酸反應(yīng)來制備。代表性的酸加成鹽包括醋酸鹽、己二酸鹽、藻酸鹽、抗壞血酸鹽、天冬氨酸鹽、苯磺酸鹽、苯甲酸鹽、硫酸氫鹽、硼酸鹽、丁酸鹽、樟腦酸鹽、樟腦磺酸鹽、檸檬酸鹽、環(huán)戊烷丙酸鹽、二葡糖酸鹽、十二烷基硫酸鹽、乙烷磺酸鹽、富馬酸鹽、葡庚糖酸鹽、甘油磷酸鹽、半硫酸鹽、庚糖酸鹽、己酸鹽、氫溴酸鹽、鹽酸鹽、氫碘酸鹽、2-羥基-乙烷磺酸鹽、乳糖酸鹽、乳酸鹽、月桂酸鹽、月桂基硫酸鹽、蘋果酸鹽、馬來酸鹽、丙二酸鹽、甲烷磺酸鹽、2-萘磺酸鹽、煙酸鹽、硝酸鹽、油酸鹽、草酸鹽、棕櫚酸鹽、帕莫酸鹽、果膠酸鹽、過硫酸鹽、3-苯基丙酸鹽、磷酸鹽、苦味酸鹽、新戊酸鹽、丙酸鹽、硬脂酸鹽、琥珀酸鹽、硫酸鹽、酒石酸鹽、硫氰酸鹽、甲苯磺酸鹽、十一烷酸鹽、戊酸鹽等。代表性的堿金屬或堿土金屬鹽包括鈉、鋰、鉀、鈣、鎂等，以及無毒的銨、季銨和胺陽離子，包括但不限于銨、四甲基銨、四乙基銨等。

“受試者”表示人或非人動物(例如，哺乳動物)。

如本文使用以及如本領(lǐng)域公知的，“治療”是用于獲得有益或想要結(jié)果、例如臨床結(jié)果的方法。有益或想要的結(jié)果可以包括但不限于緩解或減輕一種或多種癥狀或病狀；降低疾病、病癥或病狀的程度；疾病、病癥或病狀狀態(tài)的穩(wěn)定(即，不惡化)；防止疾病、病癥或病狀的傳播；延遲或減緩疾病、病癥或病狀的進展；緩解或減輕疾病、病癥或病狀；和消除(部分或完全)，無論是可檢測的還是不可檢測的?！皽p輕”疾病、病癥或病狀表示與缺乏治療的程度或時間進程相比，疾病、病癥或病狀的程度和/或不想要的臨床表現(xiàn)被減少和/或時間進程被減緩或延長?！爸委煱┌Y”、“預(yù)防癌癥”或“抑制癌癥”表示引起腫瘤尺寸或癌細胞數(shù)量的減少，減緩或抑制腫瘤尺寸或癌細胞增殖的增加，增加腫瘤或其他癌癥的消失與其再現(xiàn)之間的無疾病存活時間，預(yù)防或減少腫瘤或其他癌癥的初始或隨后出現(xiàn)的可能性，或減少與腫瘤或其他癌癥相關(guān)的不良癥狀。在一個想要的實施方案中，如使用任何標準測定測量的，治療后幸存的腫瘤或癌細胞的百分比比腫瘤或癌細胞的初始數(shù)目低至少20、40、60、80或100％。希望地，通過施用本發(fā)明化合物而誘導(dǎo)的腫瘤或癌細胞數(shù)目的減少是非腫瘤或非癌細胞數(shù)目降低的至少2、5、10、20或50倍。希望地，如使用標準方法測定的，本發(fā)明方法導(dǎo)致腫瘤尺寸或癌細胞數(shù)目的20、40、60、80或100％的減少。希望地，至少20、40、60、80、90或95％的受治療的受試者具有其中腫瘤或癌癥的所有證據(jù)消失的完全消除。希望地，腫瘤或癌癥沒有重新出現(xiàn)，或者在不少于5、10、15或20年之后重新出現(xiàn)。“預(yù)防性治療”受試者疾病或病狀(例如，癌癥)表示減少疾病癥狀出現(xiàn)之前疾病或病狀的發(fā)生(即，發(fā)病率)或減少其嚴重度。預(yù)防性治療可以完全預(yù)防或減少疾病或其癥狀的出現(xiàn)，和/或可以在部分或完全治愈疾病和/或歸因于疾病的不良作用方面是治療性的。預(yù)防性治療可以包括減少或預(yù)防疾病或病狀(例如，預(yù)防癌癥)在可能易患該病但還沒有被診斷患有該病的個體中出現(xiàn)。

附圖說明

圖1顯示了氨基-酰胺(標記的“酰胺”)和氨基-胺(標記的“胺”)的示例性實施方案。對于這些化合物，r¹和r²可以是本文描述的任何尾基，例如任選取代的c11-24烷基、烯基、炔基、雜烷基、雜烯基或雜炔基。

圖2a-2b顯示了示例性化合物l-1至l-14。

圖3顯示了具有叔胺的示例性化合物l-15至l-21。

圖4顯示了l-2的示例性類似物，包括化合物l-5、l-6、l-22和l-23。

圖5顯示了l-6的示例性類似物，包括化合物l-24至l-29。

圖6顯示了l-9的示例性酰胺類似物，包括化合物l-30至l-36。

圖7顯示了具有哌嗪基的化合物l-37至l-41，其中每個r¹和r²獨立地為本文描述的任何尾基，例如任選取代的c11-24烷基、烯基、炔基、雜烷基、雜烯基或雜炔基。

圖8顯示了其他示例性氨基胺陽離子脂質(zhì)結(jié)構(gòu)l-42、l-43和l-44。

圖9顯示了本發(fā)明l-6、l-45、l-46和l-47的其他示例性陽離子脂質(zhì)結(jié)構(gòu)。

圖10是顯示含有化合物l-1或l-2的脂質(zhì)顆粒與未治療的對照相比的體外敲除的圖。

圖11是顯示使用包含l-1、l-2、l-5、l-6、l-7、l-8、l-22或l-30和5mg/kg的dsirna的單劑脂質(zhì)顆粒體內(nèi)敲除小鼠肝中hprt1mrna、隨后在48小時之后收集組織的圖。

圖12是顯示使用包含l-2、l-5、l-6或l-30和1mg/kg或5mg/kg的dsirna的單劑脂質(zhì)顆粒體內(nèi)敲除小鼠肝中hprt1mrna、隨后在48小時之后收集組織的圖。

圖13是顯示使用用l-6或l-30和5mg/kg的dsirna配制的兩劑脂質(zhì)顆粒體內(nèi)敲除小鼠肝和原位hep3b腫瘤中hprt1mrna、隨后在48小時之后收集組織的圖。

圖14是顯示使用用l-6或l-30和5mg/kg的dsirna配制的兩劑脂質(zhì)顆粒體內(nèi)敲除小鼠肝和原位hepg2腫瘤中hprt1mrna、隨后在48小時之后收集組織的圖。

圖15是顯示具有活性dsirna的脂質(zhì)顆粒制劑l-6和l-30(“l(fā)-6活性”和“l(fā)-30活性”)在體內(nèi)hep3b模型中對血清α-甲胎蛋白(afp)水平的影響。提供了沒有dsirna的制劑(“l(fā)-6對照”和“l(fā)-30對照”)和緩沖液(“pbs”)的對照。

圖16是顯示具有活性dsirna的脂質(zhì)顆粒制劑l-6和l-30(“l(fā)-6活性”和“l(fā)-30活性”)在體內(nèi)hep3b模型中對腫瘤重量的影響的圖。提供了沒有dsirna的制劑(“l(fā)-6對照”和“l(fā)-30對照”)和緩沖液(“pbs”)的對照。

圖17顯示具有二油烯基尾基的示例性化合物l-48和l-49。

圖18是顯示使用包含l-30和1、3或10mg/kg的dsirna的單iv劑脂質(zhì)顆粒體內(nèi)敲除小鼠肝和原位hep3b腫瘤(0.5g±0.1)中hprt1mrna、隨后在48小時之后收集組織的圖。n＝7/組肝和腫瘤(具有sem的平均值)。測試了兩個制劑：如本文描述的l-30[1]和l-30[2]。

圖19是顯示使用包含l-30[1]制劑和dsirna的單劑脂質(zhì)顆粒體內(nèi)敲除多個原位肝癌模型中hprt1mrna的圖。hep3b和hepg2模型作為細胞懸液植入；并且huh1、huh7和mhcc97h作為套管片段(trocarfragment)植入。n＝5-7/組，以5mg/kgiv，q2dx1。所有組中的靶敲除相對于pbs而言是顯著的(p<0.05)。

圖20是顯示使用包含l-30[1]制劑和各種獨立地dsirna的單劑脂質(zhì)顆粒體內(nèi)敲除原位hep3bhcc腫瘤模型中各種mrna的圖。n＝6-7/組，以5mg/kgiv，tiwx2；全部以10mg/kg通過口服施用給予索拉非尼，qdx14。**＝p<0.01，*＝p<0.05。

圖21是顯示使用在l-30的七種不同的制劑([a]至[g])中包含5mg/kg的dsirna的單劑脂質(zhì)顆粒體內(nèi)敲除hep3bhcc腫瘤組織中hprt1mrna、隨后在72小時之后收集組織的圖。帶有誤差的條形圖值代表平均值+sem(n＝7/組)。

圖22是顯示在第1天和第3天使用兩種制劑l-6[2]和l-30[2]中包含10mg/kg的dsirna的脂質(zhì)顆粒劑體內(nèi)敲除h1975nsclcsc異種移植肺腫瘤組織中hprt1mrna、隨后在第5天收集組織的圖。帶有誤差的條形圖值代表平均值+sem(n＝7/組)。

圖23是顯示在第1天和第3天使用兩種制劑l-6[2]和l-30[2]中包含10mg/kg的dsirna的脂質(zhì)顆粒劑體內(nèi)敲除22rv1前列腺癌sc異種移植中hprt1mrna、隨后在第5天收集組織的圖。帶有誤差的條形圖值代表平均值+sem(n＝7/組)。

圖24是顯示在第1天和第3天使用三種制劑l-6[1]、l-30[a]和l-30[e]中包含10mg/kg的dsirna的脂質(zhì)顆粒劑體內(nèi)敲除植入肝中的22rv1前列腺癌中hprt1mrna、隨后在第5天收集組織的圖。帶有誤差的條形圖值代表平均值+sem(n＝7/組)。

具體實施方式

我們現(xiàn)在已經(jīng)開發(fā)了可以配制成脂質(zhì)顆粒的氨基-胺和氨基-酰胺陽離子脂質(zhì)。本發(fā)明的制劑可以用于遞送聚陽離子有效載荷(例如，核酸分子或rnai劑)至細胞(例如，在受試者體外或體內(nèi))。聚陽離子有效載荷的遞送可以實現(xiàn)細胞內(nèi)序列特異性的基因沉默。

氨基-胺和氨基-酰胺脂質(zhì)

本發(fā)明化合物包括任何式(i)化合物。在特定實施方案中，所述化合物選自表1。

表1。

本發(fā)明化合物(例如，如表1中提供的)可以通過類似于本領(lǐng)域建立的那些方法來制備，例如，通過方案1-4所示的反應(yīng)序列。這些反應(yīng)序列或其調(diào)整產(chǎn)生的示例性脂質(zhì)提供于圖1-9和圖17。

方案1

可以通過在還原胺化條件下用其中r⁴如本文所述的伯胺b1處理其中r¹和r²是如本文所述的脂質(zhì)尾基的酮a1，來制備式c1的仲胺。還原胺化條件包括將酮a1和伯胺b1與還原劑、例如氰基硼氫化鈉或三乙酰氧基硼氫化鈉在適當(dāng)溶劑中混合。在特定實施方案中，c1的氨基-胺脂質(zhì)被進一步氧化以形成在r³中相鄰氮的碳上具有氧基的相應(yīng)的氨基-酰胺脂質(zhì)。在其他實施方案中，c1的氨基-胺脂質(zhì)在氮或r⁴的任何碳上進一步經(jīng)歷烷基化。可以使用該方案產(chǎn)生的示例性化合物提供于圖1。

方案2

可以通過在還原胺化條件下用其中r³和r⁴如本文所述的仲胺d2處理其中r¹和r²是如本文所述的脂質(zhì)尾基的酮a2，來制備式e2的叔胺。還原胺化條件包括將酮a2和伯胺d2與還原劑、例如氰基硼氫化鈉或三乙酰氧基硼氫化鈉在適當(dāng)溶劑中混合。在d2的一些實施方案中，r³和r⁴結(jié)合形成含有一個或多個雜原子的雜環(huán)，并且得到的叔胺e2包括這種r³和r⁴基團。在特定實施方案中，e2的氨基-胺脂質(zhì)被進一步氧化以形成在r³或r⁴中相鄰氮的碳上具有氧基的相應(yīng)的氨基-酰胺脂質(zhì)。在其他實施方案中，e2的氨基-胺脂質(zhì)在r³和/或r⁴的任何碳上進一步經(jīng)歷烷基化。

方案3

可以通過在適當(dāng)溶劑中、任選高壓下混合酮a3、氨水、二氫和催化劑來制備式f3的胺。可以通過在適當(dāng)溶劑中混合胺f3與活化的羧酸g3來制備式h3的氨基-酰胺脂質(zhì)，其中l(wèi)g是離去基團并且r⁴如本文所述。示例性的lg包括鹵素(例如，氯、溴或碘)、甲苯磺酸鹽和三氟甲磺酸鹽?？梢酝ㄟ^混合酰胺h3與還原劑(例如，氫化鋁鋰、硼烷-四氫呋喃或硼烷-二甲基硫醚)來制備i3的氨基-胺脂質(zhì)。在特定實施方案中，h3的氨基-酰胺脂質(zhì)在氮或r^4’的任何碳上進一步經(jīng)歷烷基化。在其他實施方案中，i3的氨基-胺脂質(zhì)在氮或r⁴的任何碳上進一步經(jīng)歷烷基化。

方案4

可以通過在適當(dāng)溶劑中混合酮a4和胺j4來制備式k4的氨基-酰胺脂質(zhì)，其中l(wèi)g是離去基團并且r¹、r²和r⁴如本文所述。示例性的lg包括鹵素(例如，氯、溴或碘)、甲苯磺酸鹽和三氟甲磺酸鹽?？梢酝ㄟ^混合酰胺k4與還原劑(例如，氫化鋁鋰、硼烷-四氫呋喃或硼烷-二甲基硫醚)來制備l4的氨基-胺脂質(zhì)。在其他實施方案中，k4的氨基-酰胺脂質(zhì)在氮或r^4’的任何碳上進一步經(jīng)歷烷基化。在其他實施方案中，l4的氨基-胺脂質(zhì)在氮或r⁴的任何碳上進一步經(jīng)歷烷基化。由該方法制備的示例性化合物提供于圖7。

在上述方案的任何一個中，r⁴可以是如本文描述的任選取代的雜環(huán)基、任選取代的-l¹-nr⁵r6⁵、任選取代的-c(o)-l¹-nr⁵r⁶或任選取代的-l¹-雜環(huán)基。

在上述方案的任何一個中，化合物可以被進一步烷基化以在n上引入任選取代的c1-6烷基(即，r³是任選取代的c1-6烷基)以形成叔胺。具有叔胺的示例性化合物提供于圖3。

通過應(yīng)用上文或?qū)嵤├?-5中提供的合成方案并且在需要時通過做出本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的調(diào)整，可以制備本文所述、例如圖1-9和圖17中的脂質(zhì)的任何一個。

脂質(zhì)頭基

本發(fā)明化合物一般包括一個脂質(zhì)頭基、一個頭段(headpiece)和一個或多個脂質(zhì)尾基。頭段例如>ch-連接頭基與尾基。在特定實施方案中，頭基包括兩個或多個氮原子。本文描述的、例如表2或3中的頭基的任何一個可以任選地經(jīng)一個或多個取代基(例如，一個或多個本文針對烷基描述的取代基)取代。

表2提供了具有胺基的頭基的非限制性清單。本文描述的頭基、例如表2中的頭基h-1至h-39的任何一個可以與本文描述的、例如表4中的尾基的任何一個通過頭段>ch-組合形成發(fā)明化合物。

表2：脂質(zhì)頭基的實例

表3提供了具有酰胺基團的頭基的非限制性清單。本文描述的頭基、例如表3中的頭基h-40至h-52的任何一個可以與本文描述的、例如表4中的尾基的任何一個通過頭段>ch-組合形成發(fā)明化合物。

表3：含有酰胺的脂質(zhì)頭基的實例

脂質(zhì)尾基

如本文描述的，本發(fā)明化合物一般包括一個或多個尾基，所述尾基可以任選地包括一個或多個雜原子。對于每種化合物，尾基可以相同或不同。本文描述的、例如表4中的尾基的任何一個可以任選地經(jīng)一個或多個取代基(例如，一個或多個本文針對烷基描述的取代基)取代。

示例性尾基包括具有碳或一個或多個雜原子(例如，o)的飽和和不飽和基團，例如亞麻烯基(c18：3)、亞麻烯基氧基(c18：3)、亞麻酰基(c18：3)、亞油烯基(c18：2)、亞油烯基氧基(c18：2)和亞油?；?c18：2)；和本文描述的通過亞甲基連接至頭段的任何雜原子尾基，例如選自由亞麻烯基氧基亞甲基(c18：3)、亞麻?；鶃喖谆?c18：3)和亞油烯基氧基亞甲基(c18：2)或亞油?；鶃喖谆?c18：2)組成的組的尾基。表4提供了脂質(zhì)尾基的其他非限制性清單。

表4：脂質(zhì)尾基的實例

制劑

本發(fā)明化合物可以與一種或多種脂質(zhì)分子(例如，陽離子、陰離子或中性脂質(zhì))組合產(chǎn)生制劑。制劑還可以包括一種或多種組分(例如，甾醇衍生物、peg-脂質(zhì)軛合物、聚酰胺-脂質(zhì)軛合物、神經(jīng)節(jié)苷脂、抗氧化劑、表面活性劑、兩親劑或鹽)和/或一種或多種聚陽離子有效載荷(例如，一種或多種核酸或rnai劑)。已經(jīng)描述了配制脂質(zhì)以加入核酸有效載荷的方法，參見例如judge等人，j.clin.invest.119(3)：661，2009；noble等人，cancerchemother.pharmacol.64(4)：741，2009；abrams等人，mol.ther.18(1)：171，2009；yagi等人，cancerres.69(16)：6531，2009；ko等人，j.control.release133(2)：132，2009；mangala等人，methodsmol.biol.555：29，2009，其在此通過引用并入。

具有超過一個脂質(zhì)分子的制劑

本發(fā)明制劑可以包括任何有用的脂質(zhì)分子組合(例如，本發(fā)明化合物、陽離子脂質(zhì)(任選包括一種或多種陽離子脂質(zhì)，例如，一種或多種如本文描述的本發(fā)明陽離子脂質(zhì)和/或任選包括一種或多種本領(lǐng)域已知的陽離子脂質(zhì))、中性脂質(zhì)、陰離子脂質(zhì)和peg-脂質(zhì)軛合物)，包括多肽-脂質(zhì)軛合物和輔助如本文描述的脂質(zhì)載體的形成或穩(wěn)定性的其他組分。本領(lǐng)域技術(shù)人員知道如何優(yōu)化有利于特定劑的包封、脂質(zhì)制劑的穩(wěn)定性、放大反應(yīng)條件或任何其他相關(guān)因素的組合。本發(fā)明制劑可以包括輔助形成或穩(wěn)定性的其他組分。

可以平衡制劑中每種組分的百分比以產(chǎn)生能夠包封rnai劑并將該劑轉(zhuǎn)染進入細胞的脂質(zhì)載體。示例性制劑包括約10mol％至約40mol％的一種或多種本發(fā)明化合物、約10mol％至約40mol％的一種或多種陽離子脂質(zhì)、約1mol％至約20mol％的一種或多種peg-脂質(zhì)軛合物、約5mol％至約20mol％的一種或多種中性脂質(zhì)和約20mol％至約40mol％的一種或多種甾醇衍生物。在特定實施方案中，制劑包括約20mol％至約25mol％(例如，約21.0mol％、21.2mol％、21.4mol％、21.6mol％、21.8mol％或22mol％)的一種或多種本發(fā)明化合物、約25mol％至約30mol％(例如，約25.1mol％、25.2mol％、25.3mol％、25.4mol％、25.5mol％、25.6mol％、25.7mol％、25.8mol％、25.9mol％、26.0mol％、26.2mol％、26.4mol％、26.6mol％、26.8mol％或27mol％)的一種或多種陽離子脂質(zhì)(例如，dodma)、約10mol％至約15mol％(例如，約13.0mol％、13.2mol％、13.4mol％、13.6mol％、13.8mol％、14mol％、14.1mol％、14.3mol％、14.5mol％、14.7mol％或14.9mol％)的一種或多種中性脂質(zhì)(例如，dspc)、約2.5mol％至約10mol％(例如，約2.5mol％、2.6mol％、2.7mol％、2.8mol％、2.9mol％、3mol％、3.5mol％、4mol％、4.3mol％、4.5mol％、4.7mol％、5mol％、5.3mol％、5.5mol％、5.7mol％、6mol％、6.5mol％、6.7mol％、7mol％、7.5mol％、8mol％、8.5mol％或9mol％)的一種或多種peg-脂質(zhì)軛合物(例如，約2.8mol％、2.9mol％、3.0mol％、3.5mol％、3.7mol％、3.9mol％、4mol％、4.1mol％、4.3mol％、4.5mol％、4.7mol％、4.9mol％、5mol％、5.1mol％、5.3mol％、5.5mol％、5.7mol％、5.9mol％、6mol％、6.3mol％、6.5mol％、6.7mol％或7mol％的peg2000-dspe和/或peg2000-dmpe和/或3mol％、3.5mol％、3.7mol％、3.9mol％、4mol％、4.1mol％、4.3mol％、4.5mol％、4.7mol％、4.9mol％、5mol％、5.1mol％、5.3mol％、5.5mol％、5.7mol％、5.9mol％、6mol％、6.3mol％、6.5mol％、6.7mol％或7mol％的peg2000-dmg)和約25mol％至約35mol％(例如，約28.4mol％、28.6mol％、28.8mol％、29.0mol％、30mol％、31mol％、32mol％、33mol％、33.2mol％、33.4mol％、33.6mol％、33.8mol％、34mol％、34.4mol％、34.7mol％或34.9mol％)的甾醇衍生物(例如，膽固醇)。

制劑可以包括任何有用量的一種或多種陽離子脂質(zhì)。在一些實施方案中，制劑中陽離子脂質(zhì)的含量是約10mol％至約40mol％(例如，約10mol％至15mol％、約15mol％至20mol％、約20mol％至25mol％、約25mol％至30mol％、約30mol％至35mol％、和約35mol％至40mol％)。在特定實施方案中，使用了混合的陽離子脂質(zhì)(例如，10.8mol％的l-1和10.8mol％的l-2)。

在一些實施方案中，制劑包括具有一種或多種rna結(jié)合劑和一種或多種轉(zhuǎn)染脂質(zhì)的脂質(zhì)顆粒，其中所述一種或多種rna結(jié)合劑包括約10mol％至約40mol％的一種或多種陽離子脂質(zhì)(例如，dodma)和約0.5mol％至約10mol％的一種或多種peg-脂質(zhì)軛合物(例如，peg-dspe，例如peg2000-dspe，和/或peg-dmpe，例如peg2000-dmpe)；并且其中所述一種或多種轉(zhuǎn)染脂質(zhì)包括約10mol％至約40mol％的一種或多種本發(fā)明化合物(例如，l-6、l-30或表1中的任何一個)、約5mol％至約20mol％的一種或多種中性脂質(zhì)(例如，dspc)、約0.5mol％至約10mol％的一種或多種peg-脂質(zhì)軛合物(例如，peg-dspe，例如peg2000-dspe和/或peg-dmpe，例如peg2000-dmpe)和約20mol％至約40mol％的一種或多種甾醇衍生物(例如，膽固醇)。

脂質(zhì)顆粒的rna結(jié)合劑可以包括任何有用的脂質(zhì)和軛合物的組合。在特定實施方案中，陽離子脂質(zhì)(例如，dodma)的含量是約10mol％至約40mol％(例如，約20mol％至40mol％、20mol％至35mol％、20mol％至30mol％、15mol％至40mol％、15mol％至35mol％、15mol％至25mol％、或15mol％至20mol％)。在一些實施方案中，peg-脂質(zhì)軛合物(例如，peg-dspe，例如peg2000-dspe，和/或peg-dmpe，例如peg2000-dmpe)是約0.5mol％至約10mol％(例如，約0.5mol％至1mol％、0.5mol％至5mol％、0.5mol％至10mol％、1mol％至5mol％、或1mol％至10mol％)。

脂質(zhì)顆粒的轉(zhuǎn)染脂質(zhì)可以包括任何有用的脂質(zhì)和軛合物的組合。在特定實施方案中，一種或多種本發(fā)明化合物(例如，l-6、l-30或表1中的任何一個)的含量是約10mol％至約40mol％(例如，約10mol％至20mol％、10mol％至30mol％、10mol％至35mol％、15mol％至20mol％、15mol％至25mol％、15mol％至30mol％、15mol％至35mol％、15mol％至40mol％、20mol％至25mol％、20mol％至30mol％、20mol％至35mol％、20mol％至40mol％、25mol％至30mol％、25mol％至35mol％、或25mol％至40mol％)。在一些實施方案中，一種或多種中性脂質(zhì)(例如，dspc)的含量是約5mol％至約20mol％(例如，約5mol％至10mol％、5mol％至15mol％、7mol％至10mol％、7mol％至15mol％、7mol％至20mol％、10mol％至15mol％、或10mol％至20mol％)。在一些實施方案中，一種或多種peg-脂質(zhì)軛合物(例如，peg-dspe，例如peg2000-dspe，和/或peg-dmpe，例如peg2000-dmpe)的含量是約0.5mol％至約10mol％(例如，約0.5mol％至1mol％、0.5mol％至5mol％、0.5mol％至10mol％、1mol％至5mol％、或1mol％至10mol％)。在一些實施方案中，一種或多種甾醇衍生物(例如，膽固醇)的含量是約20mol％至約40mol％(例如，約20mol％至25mol％、20mol％至30mol％、20mol％至35mol％、20mol％至40mol％、25mol％至30mol％、25mol％至35mol％、或25mol％至40mol％)。

在其他實施方案中，本發(fā)明化合物用于rna結(jié)合劑的制劑(例如，約25.9mol％的l-6、l-30、l-48或l-49)。在特定實施方案中，rna結(jié)合劑制劑中使用的本發(fā)明化合物不同于轉(zhuǎn)染脂質(zhì)制劑中使用的本發(fā)明化合物(例如，25.9mol％l-48作為rna結(jié)合劑，并且21.6mol％l-30作為轉(zhuǎn)染脂質(zhì))。在制劑的一些實施方案中，一種或多種rna結(jié)合劑形成內(nèi)部聚集體，并且一種或多種轉(zhuǎn)染脂質(zhì)形成外部聚集體表面。在特定實施方案中，外部聚集體表面不是膜、脂質(zhì)雙層和/或多層。

制劑還可以包括任何有用量的一種或多種peg-脂質(zhì)軛合物。在一些實施方案中，制劑中peg-脂質(zhì)軛合物的含量是約1mol％至約20mol％(例如，約1mol％至約2mol％、約2mol％至約4mol％、約2mol％至約7mol％、約4mol％至約8mol％、約8mol％至約12mol％、約12mol％至約16mol％、或約16mol％至約20mol％)。在其他實施方案中，peg-脂質(zhì)軛合物的含量是約7mol％、6mol％、3.0mol％、或2.5mol％。而且，peg-脂質(zhì)含量可以通過適當(dāng)調(diào)整dspc或膽固醇或兩者的含量而變化，約1mol％至約20mol％。通過使用c14：0(如表4中，例如，peg-dspe或peg-dmpe等)、c16(peg-dppe、peg-dpg等)、c18：0(peg-dspe、peg-dsg等)、或c18：1(peg-dope、peg-dog等)，可以改變peg-脂質(zhì)。而且，可以使用不同分子量的peg部分(peg2000、peg3400、peg5000等)。在特定實施方案中，如本文使用的，使用混合的peg-軛合物。在特定實施方案中，使用peg2000-dspe。在特定實施方案中，使用peg2000-dmpe。

含有rnai劑的制劑

可以通過本文描述的任何方法用氨基-胺陽離子脂質(zhì)和/或氨基-酰胺脂質(zhì)與rnai劑配制本發(fā)明的制劑。例如，參見：judge等人，j.clin.invest.119(3)：661，2009；noble等人，cancerchemother.pharmacol.64(4)：741，2009；abrams等人，mol.ther.18(1)：171，2009；yagi等人，cancerres.69(16)：6531，2009；ko等人，j.control.release133(2)：132，2009；mangala等人，methodsmol.biol.555：29，2009，其在此通過引用并入。

制劑可以包括任何有用比率的rnai劑和脂質(zhì)分子和/或一種或多種組分。示例性比率包括約1：10至約1：100(w/w)(例如，約1：10至約1：50，例如約1：20)的rnai劑：總脂質(zhì)比率的(w/w)比率，其中總脂質(zhì)比率是一種或多種脂質(zhì)分子(例如，陽離子、陰離子或中性脂質(zhì))和一種或多種組分(例如，甾醇衍生物、peg-脂質(zhì)軛合物、聚酰胺-脂質(zhì)軛合物、神經(jīng)節(jié)苷脂、抗氧化劑、表面活性劑、兩親劑或鹽)的組合的重量。

制劑可以包括范圍約1mg/kg至約10mg/kg的本文描述的任何rnai劑的劑量的rnai劑。示例性劑量包括在制劑中1mg/kg、2mg/kg、3mg/kg、4mg/kg、5mg/kg、6mg/kg、7mg/kg、8mg/kg、9mg/kg和10mg/kg的rnai劑。

制備制劑的方法

可以使用任何有用的方法來制備本發(fā)明制劑。在一個示例性程序中，制劑的組分(例如，一種或多種rna結(jié)合劑、轉(zhuǎn)染脂質(zhì)或本文描述的任何脂質(zhì))溶解于溶劑(例如，水性溶劑、非水性溶劑或其溶劑混合物)。得到的脂質(zhì)懸液可以任選地被過濾、混合(例如，批混合、在線混合和/或渦旋)、蒸發(fā)(例如，使用氮或氬流)、重懸(例如，在水性溶劑、非水性溶劑或其溶劑混合物中)、凍融、擠出和/或超聲。而且，可以任選地通過添加任何想要的組分(例如，一種或多種rnai劑、rna結(jié)合劑、轉(zhuǎn)染脂質(zhì)和/或本文描述的任何脂質(zhì))來處理脂質(zhì)懸液以產(chǎn)生最終懸液?？梢詰乙盒问皆谙嗤虿煌軇┲刑峁┮环N或多種想要的組分。例如，脂質(zhì)懸液可以提供于第一溶劑或溶劑系統(tǒng)(例如，一種或多種水性或非水性溶劑，例如水、水-hcl、水-乙醇、緩沖液(例如，磷酸鹽緩沖鹽水(pbs)、hank平衡鹽溶液(hbss)、dulbecco磷酸鹽緩沖鹽水(dpbs)、earle平衡鹽溶液(ebss)、碳酸鹽、乳酸鹽、抗壞血酸鹽和檸檬酸鹽，例如5mm、10mm、50mm、75mm、100mm或150mm))、生理滲透壓溶液(290mosm/kg，例如0.9％鹽水、5％右旋糖和10％蔗糖)、鹽水、甲醇、乙醇、正丙醇、異丙醇、正丁醇、異丁醇、叔丁醇、甘油、乙二醇、丙二醇、聚乙二醇、氯仿、二氯甲烷、己烷、環(huán)己烷、丙酮、乙醚、二乙醚、二噁烷、異丙醚、四氫呋喃或其組合)，并且rnai劑可以提供于第二溶劑或溶劑系統(tǒng)，例如，一種或多種水性或非水性溶劑，例如水、水-hcl、水-乙醇、緩沖液(例如，磷酸鹽緩沖鹽水(pbs)、hank平衡鹽溶液(hbss)、dulbecco磷酸鹽緩沖鹽水(dpbs)、earle平衡鹽溶液(ebss)、碳酸鹽、乳酸鹽、抗壞血酸鹽和檸檬酸鹽，例如5mm、10mm、50mm、75mm、100mm或150mm))、生理滲透壓溶液(290mosm/kg，例如0.9％鹽水、5％右旋糖和10％蔗糖)、鹽水、甲醇、乙醇、正丙醇、異丙醇、正丁醇、異丁醇、叔丁醇、甘油、乙二醇、丙二醇、聚乙二醇、氯仿、二氯甲烷、己烷、環(huán)己烷、丙酮、乙醚、二乙醚、二噁烷、異丙醚、四氫呋喃或其組合)。水性溶劑和/或緩沖液的示例性濃度包括約4％至約8％乙醇(例如，約4％至5％、5％至6％、6％至7％、或7％至8％)、約10mm至約100mm檸檬酸鹽(例如，約10mm至30mm、30mm至50mm、50mm至70mm、70mm至90mm、或90mm至100mm)。任何溶劑或溶劑系統(tǒng)可以包括一種或多種穩(wěn)定劑，例如抗氧化劑、鹽(例如，氯化鈉)、檸檬酸、抗壞血酸、甘氨酸、半胱氨酸、乙二胺四乙酸(edta)、甘露醇、乳糖、海藻糖、麥芽糖、甘油、和/或葡萄糖。在其他實例中，使用第一溶劑或溶劑系統(tǒng)將一種或多種rna結(jié)合劑引入脂質(zhì)懸液，然后在第二溶劑或溶劑系統(tǒng)中添加一種或多種轉(zhuǎn)染脂質(zhì)，其中第一和第二溶劑或溶劑系統(tǒng)相同或不同(例如，第一溶劑或溶劑系統(tǒng)是本文描述的任何一個；并且第二溶劑或溶劑系統(tǒng)是本文描述的任何一個)。在特定實施方案中，第二溶劑或溶劑系統(tǒng)包括一種或多種選自由鹽水、緩沖液(例如，檸檬酸鹽或pbs)、水和乙醇組成的組的水性或非水性溶劑。最終懸液可以任選地被分離(例如，通過超速離心)、混合(例如，批混合、在線混合和/或渦旋)、重懸、調(diào)節(jié)(例如，用一種或多種溶劑或緩沖液系統(tǒng))、超聲、凍融、擠出和/或純化。

陽離子脂質(zhì)

一種或多種陽離子脂質(zhì)可以包括在制劑中。除了本發(fā)明化合物外，其他陽離子脂質(zhì)包括但不限于：n，n-二油烯基-n，n-二甲基氯化銨(dodac)、1，2-二-o-十八烯基-3-三甲基銨丙烷(dotma)、n，n-二硬脂基-n，n-二甲基銨(ddab)、1，2-二油?；?3-三甲基銨-丙烷(dotap)，包括手性形式r-dotap和s-dotap)、n-(1-(2，3-二油烯基氧基)丙基)-n-2-(精胺羧酰胺基)乙基)-n，n-二甲基銨(dospa)、二十八烷基酰氨基甘氨酰羧基精胺(dogs)、1，2-二油?；?3-二甲基銨丙烷(dodap)、n，n-二甲基-(2，3-二油烯基氧基)丙基胺(dodma)、n-(1，2-二肉豆蔻基氧基丙-3-基)-n，n-二甲基-n-羥基乙基銨(dmrie)、1，2-二亞油烯基氧基-3-二甲基氨基丙烷(dlindma)、1，2-二亞麻烯基氧基-3-二甲基氨基丙烷(dlendma)、1，2-二亞油?；?3-二甲基氨基丙烷(dlindap)、1-亞油?；?2-亞油烯基氧基-3-二甲基氨基丙烷(dlin-2-dmap)、1，2-二亞油烯基氨基甲?；趸?3-二甲基氨基丙烷(dlin-c-dap)、1，2-二亞油烯基硫代-3-二甲基氨基丙烷(dlin-s-dma)、2，2-二亞油烯基-4-二甲基氨基甲基-[1，3]-二氧戊環(huán)(dlin-k-dma)、2，2-二亞油烯基-4-(2-二甲基氨基乙基)-[1，3]-二氧戊環(huán)(dlin-kc2-dma)、1，2-二棕櫚?；?sn-甘油基-o-乙基-3-膽堿磷酸(dpepc)、二硬脂基二甲基氯化銨(dsdma)、1，2-二月桂?；?sn-甘油基-3-乙基膽堿磷酸(12：0epc，例如，或其氯鹽)、1，2-二棕櫚酰基-sn-甘油基-3-乙基膽堿磷酸(16：0epc，例如，或其氯鹽)、1，2-二硬脂?；?sn-甘油基-3-乙基膽堿磷酸(18：0epc，例如，或其氯鹽)、1，2-二油?；?sn-甘油基-3-乙基膽堿磷酸(18：1epc，例如，或其氯鹽)、二棕櫚酰基磷脂酰乙醇酰氨基精胺(dppes)、二棕櫚?；字Ｒ掖减０被鵯-賴氨酸(dppel)、1-[2-二油?；趸?乙基]-2-油烯基-3-(2-羥基乙基)氯化咪唑啉(dotim)、(1-甲基-4-(順-9-二油烯基)甲基-氯化吡啶))(saint)和c12-200，如在love等人，procnatlacadsciusa，107(5)：1864-1869(2010)中描述的，其通過引用并入本文。

陽離子脂質(zhì)包括不同手性形式(例如，本文描述的任何陽離子脂質(zhì)的r或s形式)或任何鹽形式(例如，本文描述的任何陽離子脂質(zhì)的氯鹽、溴鹽、三氟乙酸鹽或甲磺酸鹽)的那些。

此外，陽離子脂質(zhì)的許多商業(yè)化制品可以包括在制劑中。這種商業(yè)化制品包括但不限于：來自invitrogencorp.的lipofectamine^tm(dospa和dope的組合)和(dotma和dope的組合)；和來自promegacorp.的(包括dogs的組合物)和transfast^tm。

陰離子脂質(zhì)

一種或多種陰離子脂質(zhì)可以包括在制劑中。這種陰離子脂質(zhì)包括但不限于：磷脂酰甘油(pg)、心磷脂(cl)、二?；字＝z氨酸(ps)、二?；字?pa)、磷脂酰肌醇(pi)、n-?；字Ｒ掖及?nape)、n-琥珀酰磷脂酰乙醇胺、n-戊二酰磷脂酰乙醇胺、賴氨酰磷脂酰甘油和棕櫚?；王；字８视?popg)以及不同手性形式(例如、r或s形式)、鹽形式(例如、氯鹽、溴鹽、三氟乙酸鹽或甲磺酸鹽)及其混合物。

中性脂質(zhì)

一種或多種中性脂質(zhì)可以包括在制劑中。這種中性脂質(zhì)包括但不限于：神經(jīng)酰胺、鞘磷脂(sm)、二?；视?dag)、1，2-二硬脂?；?sn-甘油基-3-膽堿磷酸(dspc，包括手性形式r-dspc和s-dspc)、1，2-二油?；?sn-甘油基-3-膽堿磷酸(dopc)、1，2-二棕櫚酰基-sn-甘油基-3-膽堿磷酸(dppc)、1，2-二油?；?甘油基-sn-3-磷酸乙醇胺(dope)、1-棕櫚?；?2-油?；?sn-甘油基-3-膽堿磷酸(popc)、1-棕櫚?；?2-油酰基-sn-甘油基-3-磷酸乙醇胺(pope)、1，2-二棕櫚?；?sn-甘油基-3-磷酸乙醇胺(dppe)、1，2-二肉豆蔻?；?sn-甘油基-3-磷酸乙醇胺(dmpe)、1，2-二硬脂?；?sn-甘油基-3-磷酸乙醇胺(dspe)、1，2-二反油?；?sn-甘油基-3-磷酸乙醇胺(depe)、1-硬脂?；?2-油?；?sn-甘油基-3-磷酸乙醇胺(sope)、1，2-二亞油?；?sn-甘油基-3-膽堿磷酸(dlpc)以及不同的手性形式(例如，r或s形式)、鹽形式(例如，氯鹽、溴鹽、三氟乙酸鹽或甲磺酸鹽)及其混合物。其他的二?；?sn-甘油基-3-膽堿磷酸和二酰基-甘油基-sn-3-磷酸乙醇胺脂質(zhì)也可以用于本發(fā)明的脂質(zhì)顆粒。

在一些實施方案中，制劑中存在的中性脂質(zhì)組分包括一種或多種磷脂。在其他實施方案中，中性脂質(zhì)組分包括一種或多種磷脂和膽固醇的混合物。在一些實施方案中，考慮藥代動力學(xué)和/或藥效動力學(xué)性質(zhì)，例如脂質(zhì)顆粒尺寸和在血流中的穩(wěn)定性，來指導(dǎo)用于制劑的中性脂質(zhì)的選擇。

甾醇衍生物

一種或多種甾醇衍生物可以包括在制劑中。不希望受理論束縛，甾醇衍生物可用于穩(wěn)定制劑和/或增加轉(zhuǎn)染。示例性的甾醇衍生物包括膽固醇、膽固醇衍生物(例如，膽甾烷酮、膽甾烯酮或糞甾醇)；3β-[-(n-(n’，n’-二甲基氨基乙烷)-氨基甲酰基]膽固醇(dc-膽固醇，例如，其鹽酸鹽)；雙胍-三氨乙基胺-膽固醇(bgtc)；(2s，3s)-2-(((3s，10r，13r，17r)-10，13-二甲基-17-((r)-6-甲基庚-2-基)-2，3，4，7，8，9，10，11，12，13，14，15，16，17-十四氫-1h-環(huán)戊二烯并[a]菲-3-基氧基)羰基氨基)乙基2，3，4，4-四羥基丁酸酯(dpc-1)；(2s，3s)-((3s，10r，13r，17r)-10，13-二甲基-17-((r)-6-甲基庚-2-基)-2，3，4，7，8，9，10，11，12，13，14，15，16，17-十四氫-1h-環(huán)戊二烯并[a]菲-3-基)2，3，4，4-四羥基丁酸酯(dpc-2)；雙((3s，10r，13r，17r)-10，13-二甲基-17-((r)-6-甲基庚-2-基)-2，3，4，7，8，9，10，11，12，13，14，15，16，17-十四氫-1h-環(huán)戊二烯并[a]菲-3-基)2，3，4-三羥基戊二酸酯(dpc-3)；和6-(((3s，10r，13r，17r)-10，13-二甲基-17-((r)-6-甲基庚-2-基)-2，3，4，7，8，9，10，11，12，13，14，15，16，17-十四氫-1h-環(huán)戊二烯并[a]菲-3-基氧基)氧代磷?；趸?-2，3，4，5-四羥基己酸酯(dpc-4)。

peg-脂質(zhì)軛合物

一種或多種peg-脂質(zhì)軛合物可以包括在制劑中。不希望受理論束縛，peg-脂質(zhì)軛合物可以減少脂質(zhì)載體的聚集。peg-脂質(zhì)軛合物描述于美國專利號5,885,613和美國專利公布號2003/0077829，其通過引用并入本文。

可以包括在制劑中的peg-脂質(zhì)軛合物包括但不限于：1，2-二肉豆蔻酰基-sn-甘油基-3-磷酸乙醇胺-n-(羰基-甲氧基-聚乙二醇)(peg-dmpe)(例如，1，2-二肉豆蔻?；?sn-甘油基-3-磷酸乙醇胺-n-(羰基-甲氧基-聚乙二醇-2000)(peg-2000-dmpe))、1，2-二棕櫚酰基-sn-甘油基-3-磷酸乙醇胺-n-(羰基-甲氧基-聚乙二醇)(peg-dppe)、1，2-二硬脂酰基-sn-甘油基-3-磷酸乙醇胺-n-(羰基-甲氧基-聚乙二醇)(peg-dspe)、1，2-二油?；?sn-甘油基-3-磷酸乙醇胺-n-(羰基-甲氧基-聚乙二醇)(peg-dope)、1，2-二肉豆蔻酰基-sn-甘油-3-(甲氧基-聚乙二醇)(peg-dmg)(例如，1，2-二肉豆蔻酰基-sn-甘油-3-(甲氧基-聚乙二醇)(peg-2000-dmg))、1，2-二棕櫚?；?sn-甘油-3-(甲氧基-聚乙二醇)(peg-dpg)、1，2-二硬脂?；?sn-甘油-3-(甲氧基-聚乙二醇)(peg-dsg)、1，2-二油酰基-sn-甘油-3-(甲氧基-聚乙二醇)(peg-dog)、3-n-[(ω-甲氧基聚(乙二醇)2000)氨基甲酰基]-1，2-二肉豆蔻基氧基-丙基胺(peg-c-dma)、r-3-[(ω-甲氧基聚(乙二醇)2000)氨基甲酰基)]-1，2-二肉豆蔻基氧基丙基-3-胺(peg-2000-c-domg)和peg-神經(jīng)酰胺軛合物(例如，peg-cerc14或peg-cerc20，其描述于通過引用并入本文的美國專利號5,820,873)。其他peg-脂質(zhì)軛合物包括與本文描述的任何脂質(zhì)、例如磷脂酰乙醇胺或神經(jīng)酰胺軛合的peg(參見，美國專利號5,820,873；5,534,499；和5,885,613，其通過引用并入本文)，以及本文描述的任何peg-脂質(zhì)軛合物的鹽形式(例如，鈉、銨或三甲基銨鹽)。

peg-脂質(zhì)軛合物可以包括一種或多種不同的修飾，例如用本文描述的任何脂質(zhì)分子或不同分子量(例如，300至5,000道爾頓)的peg部分取代。示例性取代包括與聚乙二醇部分(例如，peg2000、peg3400、peg5000等)組合使用一種或多種c14：0(如表4中)、c16(peg-dppe、peg-dpg等)、c18：0(peg-dspe、peg-dsg等)或c18：1(peg-dope、peg-dog等)來形成peg-脂質(zhì)軛合物(例如，mpeg2000-dmg)。具有不同分子量的peg部分的實例包括peg350、peg550、peg750、peg1000、peg2000、peg3000、peg3400、peg4000和peg5000。

其他組分

制劑可以包括任何其他組分以幫助穩(wěn)定脂質(zhì)載體，減少脂質(zhì)載體的聚集，和/或遞送治療劑(例如，rnai劑)。示例性組分包括基于ω-氨基(寡聚乙二醇)鏈烷酸單體的聚酰胺-脂質(zhì)軛合物(atta-脂質(zhì))，例如美國專利號6,320,017和6,586,559中描述的那些，其通過引用并入本文；神經(jīng)節(jié)苷脂(例如，無唾液酸神經(jīng)節(jié)苷脂gm1或gm2；雙唾液酸神經(jīng)節(jié)苷脂gd1a、gd1a-nacgal、gd1-b、gd2或gd3；紅細胞糖苷、單唾液酸神經(jīng)節(jié)苷脂gm1、gm2或gm3、四唾液酸神經(jīng)節(jié)苷脂gq1b和三唾液酸神經(jīng)節(jié)苷脂gt1a或gt1b)；抗氧化劑(例如，α-生育酚或β-羥基甲苯胺)；一種或多種表面活性劑(例如，失水山梨糖醇單棕櫚酸酯或失水山梨糖醇單棕櫚酸酯，油性蔗糖酯、聚氧乙烯失水山梨糖醇脂肪酸酯、聚氧乙烯山梨糖醇脂肪酸酯、氧乙烯脂肪酸酯、聚氧乙烯烷基醚、聚氧乙烯甾醇醚、聚氧乙烯-聚丙氧基烷基醚、嵌段聚合物和鯨蠟基醚以及聚氧乙烯蓖麻油或氫化蓖麻油衍生物和聚甘油脂肪酸酯，例如或(例如具有甘油-聚乙二醇蓖麻醇酸酯與聚乙二醇脂肪酸酯的主要組分的el)；一種或多種兩親劑(例如植物油，例如大豆油、紅花油、橄欖油、麻油、玻璃苣油、蓖麻油和棉籽油；礦物油和海洋油、來自此類來源的氫化和/或分餾的甘油三酸酯；中鏈三酸甘油酯(mct-油、例如、)和各種合成或半合成的單-、二-或三酸甘油酯，例如wo92/05571中公開的定義的非極性脂質(zhì)，以及乙?；瘑嗡岣视王セ蛑舅岬耐榛ィ缍罐⑺岙惐?、油酸乙酯(參見ep0353267)或脂肪酸醇，例如油烯基醇、鯨蠟醇)；和一種或多種鹽，例如本文描述的任何鹽。通常，被選擇減少聚集的脂質(zhì)組分的濃度是約1mol％至15mol％。

脂質(zhì)載體

本發(fā)明制劑可以包括一種或多種本發(fā)明化合物(例如，式(i)或選自表1的化合物)和能夠運輸治療劑(例如，rnai劑)的任何基于脂質(zhì)的組合物。示例性的基于脂質(zhì)的組合物包括一種或多種脂質(zhì)分子(例如，本發(fā)明化合物、陽離子脂質(zhì)、陰離子脂質(zhì)或中性脂質(zhì))和/或一種或多種組分(例如，甾醇衍生物和/或peg-脂質(zhì)軛合物)。

可以使用任何生物相容性脂質(zhì)或能夠形成脂質(zhì)載體(例如，脂質(zhì)體、脂質(zhì)體復(fù)合物和膠團)的脂質(zhì)組合形成脂質(zhì)載體。將治療劑包封入脂質(zhì)載體可以保護治療劑免受損害或降解，或者促進其進入細胞。脂質(zhì)載體由于電荷相互作用(例如，陽離子脂質(zhì)載體和陰離子細胞膜)而與細胞膜相互作用并融合，從而將治療劑釋放進入細胞質(zhì)。脂質(zhì)體是包含一種或多種本發(fā)明化合物、脂質(zhì)分子和/或組分的雙層囊。脂質(zhì)納米顆粒是尺寸范圍從約1nm至約1,000nm的脂質(zhì)體。脂質(zhì)體復(fù)合物是與陽離子脂質(zhì)分子形成的脂質(zhì)體，以賦予脂質(zhì)體總體上正的電荷。膠團是具有單層脂質(zhì)分子的囊。

脂質(zhì)體

在某些實施方案中，脂質(zhì)載體是脂質(zhì)體。通常，使用的脂質(zhì)能夠形成雙層并且是陽離子的。適合的脂質(zhì)分子的類別包括磷脂(例如，磷脂酰膽堿)、脂肪酸、糖脂、神經(jīng)酰胺、甘油酯和膽固醇或其任意組合?？蛇x地或附加地，脂質(zhì)載體可以包括中性脂質(zhì)(例如，二油?；字Ｒ掖及?dope))?？梢孕纬芍|(zhì)載體的其他脂質(zhì)是本領(lǐng)域已知的并且在本文描述。

如本文使用的，“脂質(zhì)分子”是具有疏水性頭部分和親水性尾部分的分子，并且能夠形成脂質(zhì)體，包括本發(fā)明化合物或本文描述的任何陽離子、中性或陰離子脂質(zhì)。脂質(zhì)分子可以任選地被修飾以包括親水性聚合物基團。此類脂質(zhì)分子的實例包括1，2-二硬脂?；?sn-甘油基-3-磷酸乙醇胺-n-[甲氧基(聚乙二醇)-2000](peg2000-dspe)，例如其銨鹽)和1，2-二硬脂?；?sn-甘油基-3-磷酸乙醇胺-n-[羧基(聚乙二醇)-2000](peg2000-dspe羧基)。

脂質(zhì)分子的實例包括天然脂質(zhì)，例如心磷脂(cl)、磷脂酸(pa)、磷脂酰膽堿(pc)、溶血卵磷脂(lpc)、磷脂酰乙醇胺(pe)、磷脂酰甘油(pg)、磷脂酰肌醇(pi)和磷脂酰絲氨酸(ps)；脂質(zhì)混合物，例如卵磷脂(lechitin)；鞘脂，例如鞘氨醇、神經(jīng)酰胺、鞘磷脂、腦苷脂、硫肝脂、神經(jīng)節(jié)苷脂和植物鞘氨醇；陽離子脂質(zhì)，例如1，2-二油?；?3-三甲基銨-丙烷(dotap)、1，2-二油酰基-3-二甲基銨-丙烷(dodap)、二甲基雙十八烷基溴化銨(ddab)、3-β-[n-(n’，n’-二甲基氨基乙烷)氨甲?；鵠膽固醇(dc-chol)、n-[1-(2，3，-雙十四烷基氧基)丙基]-n，n-二甲基-n-羥基乙基溴化銨(dmrie)、n-[1-(2，3，-二油烯基氧基)丙基]-n，n-二甲基-n-羥基乙基溴化銨(dorie)和1，2-二-o-十八烯基-3-三甲基銨丙烷(dotma)；磷脂酰膽堿，例如1，2-二月桂?；?sn-甘油基-3-乙基膽堿磷酸、1，2-二月桂?；?sn-甘油基-3-膽堿磷酸(dlpc)、1，2-二肉豆蔻酰基-sn-甘油基-3-膽堿磷酸(dmpc)、1，2-二棕櫚?；?sn-甘油基-3-膽堿磷酸(dppc)、1，2-二硬脂?；?sn-甘油基-3-膽堿磷酸(dspc)、1，2-二油?；?sn-甘油基-3-膽堿磷酸(dopc)和1-棕櫚?；?2-油酰基-sn-甘油-3-膽堿磷酸(popc)；磷酸乙醇胺，例如1，2-二丁酰基-sn-甘油基-3-磷酸乙醇胺、1，2-二硬脂?；?sn-甘油基-3-磷酸乙醇胺(dspe)、1，2-二肉豆蔻?；?sn-甘油基-3-磷酸乙醇胺(dmpe)、1，2-二棕櫚?；?sn-甘油基-3-磷酸乙醇胺(dppe)、1，2-二油酰基-sn-甘油基-3-磷酸乙醇胺(dope)、1-棕櫚酰基-2-油?；?sn-甘油基-3-磷酸乙醇胺(pope)和1，2-二油?；?sn-甘油基-3-磷酸乙醇胺-n-(戊二酰)；磷脂酸，例如雙十六烷基磷酸酯(dcp)、1，2-二肉豆蔻?；?sn-甘油基-3-磷酸酯、1，2-二棕櫚?；?sn-甘油基-3-磷酸酯和1，2-二油?；?sn-甘油基-3-磷酸酯；磷脂酰甘油，例如二棕櫚酰基磷脂酰甘油(dppg)、二油?；字８视?dopg)、1，2-二肉豆蔻酰基-sn-甘油基-3-磷-(1’-外消旋-甘油)和1，2-二油酰基-sn-甘油基-3-磷-(1’-外消旋-甘油)；磷脂酰絲氨酸，例如1，2-二肉豆蔻?；?sn-甘油基-3-磷-l-絲氨酸、1，2-二棕櫚?；?sn-甘油基-3-磷-l-絲氨酸和1，2-二油?；?sn-甘油基-3-磷-l-絲氨酸；心磷脂，例如1’，3’-雙[1，2-二肉豆蔻酰基-sn-甘油基-3-磷]-sn-甘油；和peg-脂質(zhì)軛合物，例如1，2-二棕櫚?；?sn-甘油基-3-磷酸乙醇胺-n-[甲氧基(聚乙二醇)-750]、1，2-二棕櫚酰基-sn-甘油基-3-磷酸乙醇胺-n-[甲氧基(聚乙二醇)-2000]、1，2-二棕櫚?；?sn-甘油基-3-磷酸乙醇胺-n-[甲氧基(聚乙二醇)-5000]、1，2-二硬脂?；?sn-甘油基-3-磷酸乙醇胺-n-[甲氧基(聚乙二醇)-2000]和1，2-二硬脂?；?sn-甘油基-3-磷酸乙醇胺-n-[羧基(聚乙二醇)-2000]。

本發(fā)明化合物可以與任何有用的脂質(zhì)組合物組合，所述脂質(zhì)組合物包括商業(yè)途徑可獲得的脂質(zhì)組合物。此類組合物的實例包括來自invitrogencorp.的lipofectamine^tm(dospa和dope的組合)和(dotma和dope的組合)；來自promegacorp.的(包括dogs的組合物)和transfast^tm；來自sigma-aldrichco.的neuroporter^tm和escort^tm；來自roche的6；和來自strategene的已知的脂質(zhì)組合物包括trojanhorse脂質(zhì)體技術(shù)，如描述于boado，pharm.res.24：1772-1787(2007)。

脂質(zhì)體還可以包括輔助脂質(zhì)體形成或穩(wěn)定性的其他組分。組分的實例包括膽固醇、抗氧化劑(例如，α-生育酚或β-羥基甲苯胺)、表面活性劑和鹽。

脂質(zhì)體可以是包含脂質(zhì)分子的任何有用的組合物，包括一種或多種本發(fā)明化合物和輔助脂質(zhì)體形成或穩(wěn)定性的其他脂質(zhì)組分。本領(lǐng)域技術(shù)人員將知道如何優(yōu)化有助于特定劑包封、脂質(zhì)體穩(wěn)定性、放大反應(yīng)條件或任何其他相關(guān)因素的組合。示例性的組合描述于boado，pharm.res.24：1772-1787(2007)。

制備脂質(zhì)體通常通過一般的兩步驟過程來進行。在第一步中，在揮發(fā)性有機溶劑或溶劑混合物中混合脂質(zhì)和脂質(zhì)組分以保證均勻的脂質(zhì)混合物。溶劑的實例包括氯仿、甲醇、環(huán)己烷和正丁醇。然后去除溶劑以形成膜、粉末或片形式的干脂質(zhì)混合物。還可以通過使用任何已知的分析技術(shù)，例如通過使用氮、旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)、噴霧干燥、凍干和真空干燥，來去除溶劑。

在第二步驟中，將干脂質(zhì)混合物用水溶液水合以形成脂質(zhì)體?？梢詫┨砑又了芤海@導(dǎo)致具有包封的劑的脂質(zhì)體的形成?？蛇x地，脂質(zhì)體首先用第一水溶液形成，然后暴露于含有所述劑的另一水溶液。可以通過任何已知技術(shù)，例如通過重復(fù)的凍融循環(huán)、超聲或混合來促進劑的包封。該方法的其他實例描述于boado，pharm.res.24：1772-1787(2007)?？蛇x地，劑與疏水部分(例如，膽固醇)偶聯(lián)以產(chǎn)生親脂衍生物，并且所述親脂衍生物與其他脂質(zhì)分子一起使用以形成脂質(zhì)體。

在第二步驟期間，干脂質(zhì)混合物可以或可以不含有多肽-脂質(zhì)軛合物。該過程可以任選地包括各種其他步驟，包括在將其加入干脂質(zhì)混合物之前加熱水溶液超過脂質(zhì)分子的相轉(zhuǎn)變溫度，其中特定的溫度范圍包括約40℃至約70℃；孵育干脂質(zhì)混合物和水溶液的組合，其中特定的時間范圍包括約30分鐘至約2小時；在孵育期間混合干脂質(zhì)混合物和水溶液，例如通過渦旋混合、搖動、攪拌或攪動；向水溶液添加非電解質(zhì)以保證生理滲透壓，例如0.9％鹽水、5％右旋糖和10％蔗糖的溶液；破壞大的多層囊，例如通過擠出或超聲；并與多肽-脂質(zhì)軛合物一起額外孵育預(yù)形成的脂質(zhì)體，其中干脂質(zhì)混合物不含有脂質(zhì)分子。本領(lǐng)域技術(shù)人員能夠鑒定該氫化步驟中的特定溫度和孵育時間，以確保衍生的脂質(zhì)分子加入脂質(zhì)體或獲得穩(wěn)定的脂質(zhì)體。

可以在形成脂質(zhì)體的過程中的任一點添加本發(fā)明化合物。在一個實例中，在干脂質(zhì)混合物形成期間向脂質(zhì)和脂質(zhì)組分添加所述化合物。在另一實例中，將化合物添加至用含有脂質(zhì)和脂質(zhì)組分的干脂質(zhì)混合物預(yù)形成的脂質(zhì)體。而在另一實例中，用化合物形成膠團，用含有脂質(zhì)和脂質(zhì)組分的干脂質(zhì)混合物形成脂質(zhì)體，然后將膠團和脂質(zhì)體一起孵育。水溶液可以包括其他組分以穩(wěn)定劑或脂質(zhì)體，例如緩沖液、鹽、螯合劑、鹽水、右旋糖、蔗糖等。

在該程序的一個實例中，由脂質(zhì)混合物構(gòu)成的干膜用含有劑的水溶液水合。首先將該混合物加熱至50℃持續(xù)30分鐘，然后冷卻至室溫。接下來，將混合物轉(zhuǎn)移至含有多肽-脂質(zhì)軛合物的干膜上。然后在37℃孵育混合物2小時以將多肽-脂質(zhì)軛合物加入含有劑的脂質(zhì)體。參見例如，zhang等人，j.control.release112：229-239(2006)。

具有囊結(jié)構(gòu)的脂質(zhì)顆粒

在某些實施方案中，脂質(zhì)顆粒包括陽離子脂質(zhì)(例如，dodma、dotma和/或氨基-胺脂質(zhì)、氨基-酰胺脂質(zhì)或本發(fā)明的其他脂質(zhì))和rnai劑，以及中性或兩性離子脂質(zhì)、peg-脂質(zhì)軛合物和任選的膽固醇。

具有一種或多種rna結(jié)合劑和一種或多種轉(zhuǎn)染脂質(zhì)的脂質(zhì)顆粒

脂質(zhì)顆粒還包括具有一種或多種rna結(jié)合劑和一種或多種轉(zhuǎn)染脂質(zhì)的那些。在一個實施方案中，一種或多種rna結(jié)合劑形成內(nèi)部聚集體，并且一種或多種轉(zhuǎn)染脂質(zhì)形成外部聚集體表面。在特定實施方案中，外部聚集體表面不是膜、脂質(zhì)雙層和/或多層。在某些實施方案中，一種或多種rna結(jié)合劑(例如，脂質(zhì))代表總脂質(zhì)的約10-90％。在其他實施方案中，一種或多種rna結(jié)合劑(例如，脂質(zhì))代表總脂質(zhì)的約50％。在其他實施方案中，一種或多種rna結(jié)合劑(例如，脂質(zhì))代表總脂質(zhì)的約30％。在某些實施方案中，核酸有效載荷與脂質(zhì)顆粒的一種或多種rna結(jié)合劑的復(fù)合體/聚集體包括陽離子脂質(zhì)(例如，dodma、dotma和/或本發(fā)明的氨基-胺脂質(zhì)或氨基-酰胺)和rnai劑；并且脂質(zhì)顆粒的一種或多種轉(zhuǎn)染脂質(zhì)包括中性或兩性離子脂質(zhì)、peg-脂質(zhì)軛合物和任選的膽固醇。在其他實施方案中，顆粒的一種或多種轉(zhuǎn)染脂質(zhì)包括陽離子脂質(zhì)(例如，dodma、dotma、氨基-胺脂質(zhì)和/或氨基-酰胺脂質(zhì))、中性脂質(zhì)、peg-脂質(zhì)軛合物和任選的膽固醇。

rnai劑

rna干擾(rnai)是通過引起特定rna分子降解或阻礙特定基因轉(zhuǎn)錄而抑制基因表達的機制。性質(zhì)上，rnai靶通常是來自病毒和轉(zhuǎn)座子的rna分子(一種先天免疫應(yīng)答的形式)，盡管它也起著調(diào)節(jié)發(fā)育和基因組維護的作用。rnai機理的關(guān)鍵是小干擾rna鏈(sirna)，其具有與靶信使rna(mrna)分子足夠互補的核苷酸序列。sirna將rnai途經(jīng)內(nèi)的蛋白導(dǎo)向靶mrna并降解它們，將它們分解成不再能被翻譯成蛋白的更小部分。

rnai途經(jīng)由酶dicer引發(fā)，其將長的雙鏈rna(dsrna)分子裂解成sirna分子，其通常約21至約23個核苷酸長度并且含有約19個堿基對雙鏈體。然后將每個片段的兩個鏈中被稱為引導(dǎo)鏈的一條鏈并入rna誘導(dǎo)的沉默復(fù)合體(risc)并與互補序列配對。risc介導(dǎo)了具有與sirna雙鏈體的反義鏈互補的序列的單鏈rna的裂解。靶rna的裂解發(fā)生在與sirna雙鏈體的反義鏈互補的區(qū)域的中間。該識別事件的結(jié)果是轉(zhuǎn)錄后的基因沉默。這在引導(dǎo)鏈特異性配對mrna分子并誘導(dǎo)通過argonaute(risc復(fù)合體的催化組分)的降解時發(fā)生。

本發(fā)明化合物可用于在體外或體內(nèi)(例如，受試者中)遞送一種或多種rnai劑至細胞。rnai劑可以包括不同類型的雙鏈分子，其包括rna：rna或rna：dna鏈。這些劑可以各種結(jié)構(gòu)被引入細胞，包括雙鏈體(例如，在3’末端有或沒有懸突部分)、發(fā)夾環(huán)或表達能夠形成單獨或與另一多核苷酸組合的雙鏈多核苷酸的一種或多種多核苷酸的表達載體。示例性的rnai劑包括本文描述的sirna、shrna、dsirna和mirna劑。一般而言，這些劑的長度是約10至約40個核苷酸，并且下文針對特定rnai劑描述了優(yōu)選的長度。

rnai劑的功能性基因沉默不一定包括靶基因產(chǎn)物的完全抑制。在一些情況下，由rnai劑引起的基因產(chǎn)物表達的邊際下降可以轉(zhuǎn)化為宿主細胞、組織、器官或動物中顯著的功能或表型變化。因此，理解基因沉默是功能性等同的，并且實現(xiàn)沉默的基因產(chǎn)物降解程度可以在基因靶或宿主細胞類型間有差別。

sirna

小干擾rna(sirna)一般是長度為16至30個核苷酸(例如，18至25個核苷酸，例如21個核苷酸)的雙鏈rna分子，在3’末端有一個或兩個核苷酸懸突或者沒有任何懸突。技術(shù)人員可以改變該序列長度(例如，增加或減少基因沉默的總體水平)。在某些實施方案中，懸突是在3’末端的uu或dtdt。一般而言，sirna分子與靶dna分子的一條鏈完全互補，因為甚至單個堿基對錯配已經(jīng)顯示減少沉默。在其他實施方案中，sirna可以具有修飾的骨架組成，例如2’-脫氧-或2’-o-甲基修飾，或本文描述的任何修飾。

sirna指能夠以序列特異性方式抑制或下調(diào)基因表達的核酸分子；參見例如zamore等人，cell101：2533(2000)；bass，nature411：428-429(2001)；elbashir等人，nature411：494-498(2001)；和pct公布號wo00/44895、wo01/36646、wo99/32619、wo00/01846、wo01/29058、wo99/07409和wo00/44914。制備用于基因沉默的sirna分子的方法描述于美國專利號7,078,196，其通過引用并入本文。

shrna

短發(fā)夾rna(shrna)是其中存在發(fā)夾環(huán)結(jié)構(gòu)的單鏈rna分子，發(fā)夾環(huán)結(jié)構(gòu)允許同一鏈中的互補核苷酸形成分子間鍵。shrna可以表現(xiàn)出與sirna相比降低的對核酸酶降解的靈敏度。在某些實施方案中，shrna具有長度為19至29個核苷酸(例如，19至21個核苷酸或25至29個核苷酸)的莖長。在一些實施方案中，環(huán)尺寸是4至23個核苷酸長度。shrna一般可以含有一個或多個錯配，例如，shrna莖的兩條鏈之間的g-u錯配，而不降低效價。

dsirna

dicer-底物rna(dsirna)是25至35個核苷酸的雙鏈rna劑。認為這種長度的劑被rna干擾(rnai)途徑的dicer酶加工，而短于25個核苷酸的劑一般模擬dicer產(chǎn)物并逃避dicer加工。在一些實施方案中，dsirna在1至4個核苷酸(例如，1或2個核苷酸)的反義或有義鏈的3’末端具有單鏈核苷酸懸突。

dsirna劑的某些修飾結(jié)構(gòu)之前如在美國專利公布號2007/0265220中描述，其通過引用并入本文。適合用于本發(fā)明制劑的其他dsirna結(jié)構(gòu)和特定組合物描述于美國專利申請?zhí)?2/586,283；美國專利公布號2005/0244858、2005/0277610、2007/0265220、2011/0021604、2010/0173974、2010/0184841、2010/0249214、2010/0331389、2011/0003881、2011/0059187、2011/0111056；和pct公布號wo2010/080129、wo2010/093788、wo2010/115202、wo2010/115206、wo2010/141718、wo2010/141724、wo2010/141933、wo2011/072292、wo2011/075188，其通過引用并入本文。一般而言，使用如針對19-23mersirna描述的固相寡核苷酸合成方法來合成dsirna構(gòu)建體(參見美國專利號5,804,683；5,831,071；5,998,203；6,117,657；6,353,098；6,362,323；6,437,117；6,469,158；6,111,086；6,008,400；和6,111,086)。

mirna

微rna(mirna)是長度為17至25個核苷酸(例如，21至23個核苷酸)的單鏈rna分子。技術(shù)人員可以改變該序列長度以增加或降低基因沉默的總體水平。這些劑通過結(jié)合靶信使rna上的互補序列來沉默靶基因。如本文使用的，使用術(shù)語“mirna前體”來涵蓋但不限于初級rna轉(zhuǎn)錄物，pri-mirna和pre-mirna。本發(fā)明的“mirna有效載荷”可以包括pri-mirna、pre-mirna和/或mirna(或成熟mirna)。在某些實施方案中，本發(fā)明的sirna(例如，dsirna)可以提供并入了mirna序列或者與mirna序列足夠同源以發(fā)揮所述mirna功能的引導(dǎo)鏈(使這種sirna成為“mirna模擬物”)。

反義化合物

示例性的反義化合物包括連續(xù)的核苷酸長度范圍，其中該范圍的上限是50個核苷酸，并且其中該范圍的下限是8個核苷酸。在某些實施方案中，該范圍的上限是35個核苷酸，并且該范圍的下限是14個核苷酸。在其他實施方案中，該范圍的上限是24個核苷酸，并且該范圍的下限是17個核苷酸。在其他實施方案中，反義化合物是20個連續(xù)的核苷酸。本領(lǐng)域技術(shù)人員容易理解，如本文公開的該范圍的上限包括20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49或50個連續(xù)的核苷酸，并且該范圍的上限包括8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20個連續(xù)的核苷酸。

示例性的反義化合物包括一段至少8、任選至少12、任選至少15個連續(xù)核苷酸，其與靶序列足夠互補以干擾靶序列的轉(zhuǎn)錄、翻譯、促進靶序列降解(任選的核酸酶介導(dǎo)的降解)和/或以其他方式破壞靶序列功能(例如，干擾其他功能性靶序列的功能，例如，通過反義化合物介導(dǎo)的機理破壞啟動子、增強子或其他功能性核酸靶序列)。

修飾可以對反義化合物進行，并且可以包括與選自核堿基位置、糖位置的末端中的一個或核苷酸鍵合中的一個連接的軛合基團。可能的修飾包括但不限于2’-氟代(2’-f)、2’-o甲基(2’-ome)、2’-o-(2-甲氧基乙基)(2’-moe)高親和力糖修飾、倒脫堿基帽、脫氧核堿基和雙環(huán)核堿基類似物，例如鎖核酸(lna)和乙烯橋接的核酸(ena)。

制備rnai劑的方法

rnai劑包括導(dǎo)向靶核酸(例如，靶基因)的至少一個反義核苷酸序列。反義核苷酸是與選定靶序列互補的單鏈dna或rna。在反義rna的情況下，它們通過結(jié)合它而防止互補rna鏈的翻譯。反義dna可用于靶向特異性互補的(編碼或非編碼)rna。在一個特定的實施方案中，反義核苷酸含有約10至約40個核苷酸、更優(yōu)選約15至約30個核苷酸。反義核苷酸可以具有與預(yù)期的靶基因達80％、85％、90％、95％、99％或甚至100％互補性。

制備反義和有義核苷酸以及相應(yīng)的雙鏈體或發(fā)夾環(huán)的方法是本領(lǐng)域已知的，并且可以容易地適于制備靶向任何靶核酸序列的反義寡核苷酸?？梢赃x擇反義核苷酸序列以優(yōu)化靶特異性，例如通過分析靶序列并測定二級結(jié)構(gòu)、tm、結(jié)合能和相對穩(wěn)定性；和/或減少二級結(jié)構(gòu)、例如二聚體、發(fā)夾或?qū)p少或阻止對宿主細胞中靶mrna特異性結(jié)合的其他二級結(jié)構(gòu)的形成。在一些實施方案中，mrna的高度優(yōu)選的靶區(qū)域包括處于或靠近aug翻譯起始密碼子的那些區(qū)域和與mrna的5’區(qū)域基本上互補的那些序列?？梢赃M行這些二級結(jié)構(gòu)分析和靶位點選擇考量，例如使用第4版oligo引物分析軟件(molecularbiologyinsights)和/或blastn2.0.5算法軟件(altschul等人，nucleicacidsres.25(17)：3389-3402，1997)。制備rnai劑的非限制性方法描述于美國專利號5,804,683；5,831,071；5,998,203；6,117,657；6,353,098；6,362,323；6,437,117；6,469,158；6,111,086；6,008,400；和6,111,086，其通過引用并入本文。

rnai劑可以具有任何有用的形式，例如單鏈、雙鏈、線性、環(huán)狀(例如，質(zhì)粒)、切口環(huán)狀、螺旋、超螺旋、連接的(concatemerized)或帶電荷的。此外，核苷酸可以含有5’和3’有義和反義鏈末端修飾，并且可以具有平端或懸突末端核苷酸(例如，在3’末端的uu或tt)或其組合。

修飾的核酸包括修飾的dna或rna分子，可以用于替代本文描述的多核苷酸(例如，rnai劑)中天然存在的核酸。修飾的核酸可以提高本文描述的多核苷酸的半衰期、穩(wěn)定性、特異性、遞送、溶解度和核酸酶抗性。例如，sirna劑可以是部分或完全由賦予上述有益性質(zhì)的核苷酸類似物構(gòu)成。如elmén等人(nucleicacidsres.33：439-447(2005))中描述的，可以使用合成的rna樣核苷酸類似物(例如，鎖核酸(lna))來構(gòu)建表現(xiàn)出抗靶基因產(chǎn)物的沉默活性的sirna分子。

其中磷酸二酯鍵中的非橋氧被硫替代的硫代磷酸酯(ps)骨架修飾是最早且最常見的用于穩(wěn)定核酸藥物抗核酸酶降解的方式中的一個。一般而言，似乎ps修飾可以廣泛針對兩個sirna鏈進行而不過多影響活性(kurreck，eur.j.biochem.270：1628-44(2003))。在特定實施方案中，ps修飾通常限于3’和5’末端的一或兩個堿基。硼烷磷酸酯連接體可用于增強sirna活性，同時具有低毒性(hall等人，nucleicacidsres.32：5991-6000(2004))。對寡核苷酸骨架的其他示例性修飾包括膦酸甲酯、二硫代磷酸酯、磷酸三酯、氨基烷基磷酸三酯、烷基膦酸酯(例如，3’-亞烷基膦酸酯)、手性膦酸酯、亞膦酸酯、磷酰胺酯(例如、3’-氨基磷酰胺酯)、氨基烷基磷酰胺酯、硫羰基磷酰胺酯、硫羰基烷基膦酸酯、硫羰基烷基磷酸三酯和具有通過肽鍵連接的重復(fù)n-(2-氨基乙基)-甘氨酸單元的蛋白核苷酸(pna)骨架，其中代表性的pna化合物包括但不限于以下中描述的那些：美國專利號5,539,082、5,714,331和5,719,262，以及nielsen等人，science254：1497-1500(1991)。

對骨架的其他修飾包括用短鏈烷基或環(huán)烷基核苷酸間鍵、混合雜原子和烷基或環(huán)烷基核苷酸間鍵、或一個或多個短鏈雜原子或雜環(huán)核苷酸間鍵(例如，嗎啉代鍵；硅氧烷骨架；硫化物、亞砜和砜骨架；甲乙酰和硫代甲乙酰骨架；亞甲基甲乙酰和硫代甲乙酰骨架；含烯骨架；氨基磺酸酯骨架；亞甲基亞氨基和亞甲基肼基骨架；磺酸酯和磺酰胺骨架；酰胺骨架；和具有混合的n、o、s和ch2組成部分的其他)替代磷原子的那些。

某些修飾的核堿基特別用于增加本發(fā)明寡聚體化合物的結(jié)合親和力，例如5-取代的嘧啶、6-氮雜嘧啶和n-2、n-6和o-6取代的嘌呤(例如，2-氨基丙基腺嘌呤、5-丙炔基尿嘧啶、5-丙炔基胞嘧啶和5-甲基胞嘧啶)。示例性的修飾核堿基包括5-甲基胞嘧啶(5-me-c或m5c)；5-羥基甲基胞嘧啶、黃嘌呤和次黃嘌呤；2-氨基腺嘌呤、腺嘌呤和鳥嘌呤的6-甲基和其他烷基衍生物；腺嘌呤和鳥嘌呤的2-丙基和其他烷基衍生物；2-硫尿嘧啶；2-硫代胸腺嘧啶；2-硫代胞嘧啶；5-鹵代尿嘧啶和胞嘧啶；5-丙炔基尿嘧啶和胞嘧啶；6-偶氮尿嘧啶、胞嘧啶和胸腺嘧啶；5-尿嘧啶(假尿嘧啶)；4-硫尿嘧啶；8-鹵代、8-氨基、8-硫醇、8-硫代烷基、8-羥基和其他8-取代的腺嘌呤和鳥嘌呤；5-鹵代，特別是5-溴代、5-三氟甲基和其他5-取代的尿嘧啶和胞嘧啶；7-甲基鳥嘌呤；7-甲基腺嘌呤；8-氮雜鳥嘌呤；8-氮雜腺嘌呤；7-去氮雜鳥嘌呤；7-去氮雜腺嘌呤；3-去氮雜鳥嘌呤；和3-去氮雜腺嘌呤。在特定實施方案中，這些修飾的核堿基可以與其他修飾、例如本文描述的任何糖修飾組合。

修飾的寡核苷酸還可以含有一個或多個取代的糖部分，其中修飾可以在核糖環(huán)的任何活性位點(例如，核糖環(huán)的2’-oh)或一個或多個通用堿基上進行。示例性修飾包括2’-鹵代，例如f、br或cl；2’-o-烷基、2’-s-烷基或2’-n-烷基，例如2’-ome；2’-o-(烷基-o)n-烷基，例如2’-o-甲氧基乙基(2’-o-moe)、2’-o[(ch2)no]mch3、2’-o(ch2)noch3、2’-o(ch2)2on(ch3)2o(ch2)nnh2、o(ch2)nch3、2’-o(ch2)nonh2和2’-o(ch2)non[(ch2)nch3)]2，其中n和m是1至約10；2’-o-烯基、2’-s-烯基或2’-n-烯基；2’-o-炔基、2’-s-炔基或2’-n-炔基，其中烷基、烯基和炔基可以是取代的或未取代的c1-10烷基或c2-10烯基和炔基，以及核糖的2’和4’位置之間的橋接修飾以形成鎖核酸(lna)。示例性的通用堿基包括位于修飾核苷酸的核苷酸糖部分的1’位置或者核苷酸糖部分取代中的等同位置的雜環(huán)部分，例如1-β-d-核糖呋喃基-5-硝基吲哚和1-β-d-核糖呋喃基-3-硝基吡咯。

在某些實施方案中，可以采用具有所述的修飾形式和/或修飾模式的核酸。關(guān)于核酸的示例性修飾和修飾模式的其他細節(jié)可以參見例如至少以下參考文獻：us2010/0240734；wo2010/080129；wo2010/033225；us2011/0021604；wo2011/075188；wo2011/072292；wo2010/141724；wo2010/141726；wo2010/141933；wo2010/115202；wo2008/136902；wo/2011/109294；wo/2011/075188；pct/us11/42810；pct/us11/42820；美國序列號61/435,304；美國序列號61/478,093；美國序列號61/497,387；美國序列號61/529,422；美國專利號7,893,245；wo2007/051303；和us2010/0184209。前述文件的每一個通過引用整體并入本文。

rnai基因靶

本發(fā)明特征為通過用化合物或制劑結(jié)合rnai劑治療而沉默患病組織或器官中的靶基因。本發(fā)明的治療潛力在已知或認為參與建立或維持病態(tài)(例如癌癥)的特定的靶向基因的mrna分子被rnai劑降解時得到實現(xiàn)。

用于本發(fā)明的rnai靶的實例包括發(fā)育蛋白，例如粘附分子、細胞周期蛋白激酶抑制劑、wnt家族成員、pax家族成員、wingedhelix家族成員、hox家族成員、細胞因子/淋巴因子及其受體、生長/分化因子及其受體、神經(jīng)遞質(zhì)及其受體；癌基因編碼的蛋白(例如，abl1(uniprot登錄號p00519、ncbigeneid：25)、ar(uniprot登錄號p10275、ncbigeneid：3647)、β-連環(huán)蛋白(ctnnb1、uniprot登錄號p35222、ncbigeneid：1499)、bcl1(uniprot登錄號p24385、ncbigeneid：595)、bcl2(uniprot登錄號p10415、ncbigeneid：596)、bcl6(uniprot登錄號p41182)、cbfa2(uniprot登錄號q01196、ncbigeneid：861)、cbl(uniprot登錄號p22681、ncbigeneid：687)、csf1r(uniprot登錄號p07333、ncbigeneid：1436)、erba1(uniprot登錄號p10827、ncbigeneid：7067)、erba2(uniprot登錄號p10828、ncbigeneid：7068)、erbb(uniprot登錄號p00533、ncbigeneid：1956)、erbb2(uniprot登錄號p04626、ncbigeneid：2064)、erbb3(uniprot登錄號p21860、ncbigeneid：190151)、erbb4(uniprot登錄號q15303、ncbigeneid：600543)、ets1(uniprot登錄號p14921、ncbigeneid：2113)、ets2(uniprot登錄號p15036、ncbigeneid：2114)、etv6(uniprot登錄號41212、ncbigeneid：2120)、fgr(uniprot登錄號p09769、ncbigeneid：2268)、fos(uniprot登錄號p0110、ncbigeneid：2353)、fyn(uniprot登錄號p06241、ncbigeneid：2534)、hcr(uniprot登錄號q8td31、ncbigeneid：54535)、hras(uniprot登錄號p01112、ncbigeneid：3265)、jun(uniprot登錄號p05412、ncbigeneid：3725)、kras(uniprot登錄號p01116、ncbigeneid：3845)、lck(uniprot登錄號p06239ncbigeneid：3932)、lyn(uniprot登錄號p07948、ncbigeneid：4067)、mdm2(uniprot登錄號q00987、ncbigeneid：4193)、mll1(uniprot登錄號q03164、ncbigeneid：4297)、mll2(uniprot登錄號o14686、ncbigeneid：8085)、mll3(uniprot登錄號q8nez4、ncbigeneid：58508)、myb(uniprot登錄號p10242、ncbigeneid：4602)、myc(uniprot登錄號p01106、ncbigeneid：4609)、mycl1(uniprot登錄號p12524、ncbigeneid：4610)、mycn(uniprot登錄號p04198、ncbigeneid：4613)、nras(uniprot登錄號p01111、ncbigeneid：4893)、pim1(uniprot登錄號p11309、ncbigeneid：5292)、pml(uniprot登錄號p29890、ncbigeneid：5371)、ret(uniprot登錄號p07949、ncbigeneid：5979)、src(uniprot登錄號p12931、ncbigeneid：6714)、tal1(uniprot登錄號p17542、ncbigeneid：6886)、tal2(uniprot登錄號q16559、ncbigeneid：6887)、tcl3(uniprot登錄號p31314、ncbigeneid：3195)、tcl5(uniprot登錄號p17542、ncbigeneid：6886)和yes(uniprot登錄號p07947、ncbigeneid：7525))；腫瘤抑制蛋白(例如、brca1(uniprot登錄號p38398、ncbigeneid：672)、brca2(uniprot登錄號p51587、ncbigeneid：675)、madh4(uniprot登錄號q13485、ncbigeneid：4089)、mcc(uniprot登錄號p23508、ncbigeneid：4163)、nf1(uniprot登錄號p21359、ncbigeneid：4763)、nf2(uniprot登錄號p35240、ncbigeneid：4771)、rb1(uniprot登錄號p06400、ncbigeneid：5925)、tp53(uniprot登錄號p04637、ncbigeneid：7157)、plk1(uniprot登錄號p53350、ncbigeneid：9606)、kif1-結(jié)合蛋白(uniprot登錄號q96ek5、ncbigeneid：9606)和wt1(uniprot登錄號p19544、ncbigeneid：4790))；脂蛋白(例如、載脂蛋白b(apob100、uniprot登錄號p04114、ncbigeneid：338))；酶(例如、acc合成酶和氧化酶、acp脫氫酶和羥化酶、adp-葡萄糖焦磷酸化酶、atp酶、醇脫氫酶、淀粉酶、淀粉葡糖苷酶、過氧化氫酶、纖維素酶、查耳酮合成酶、殼多糖酶、環(huán)加氧酶、脫羧酶、糊精酶、dna和rna聚合酶、半乳糖苷酶、葡聚糖酶、葡萄糖氧化酶、顆粒結(jié)合的淀粉合成酶、gtp酶、解旋酶、半纖維素酶、整合酶、菊粉酶、轉(zhuǎn)化酶、異構(gòu)酶、激酶(例如，plk1(uniprot登錄號p53350、ncbigeneid：9606))、乳糖酶、連接酶(例如，含有環(huán)指-和wd重復(fù)序列的蛋白2(rfwd2)，還稱為cop1)、脂肪酶、脂肪氧合酶、溶菌酶、胭脂氨酸合成酶、章魚氨酸合成酶、果膠甲酯酶、過氧化物酶、磷酸酶、磷脂酶、磷酸化酶、植酸酶、植物生長調(diào)節(jié)劑合成酶、多聚半乳糖醛酸酶、蛋白酶和肽酶、普魯蘭酶、重組酶、逆轉(zhuǎn)錄酶、核酮酶-1、5-二磷酸羧化酶加氧酶(rubiscos)、拓撲異構(gòu)酶、轉(zhuǎn)移酶，例如次黃嘌呤鳥嘌呤磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶1(hprt1)和木聚糖酶)。

考慮其在代謝(例如，在各種高膽固醇血癥中的脂蛋白代謝)和循環(huán)蛋白(例如，血友病中的凝血因子)分泌中的重要作用，肝是核酸療法的最重要的靶組織中的一個。此外，獲得性病癥，例如慢性肝炎和硬化是常見的，并且也可能通過基于多核苷酸的肝療法來治療。影響肝或受肝影響的許多疾病或病狀可能通過肝中基因表達的敲除(抑制)來治療。示例性的肝病和病狀可以選自包括以下的清單：肝癌(包括肝細胞癌、hcc)、病毒感染(包括肝炎)、代謝病癥(包括高脂血癥和糖尿病)、纖維化和急性肝損傷。肝治療劑(例如，包括特別是靶向hcc的治療劑)的示例性分子靶–和任選解決其他靶、疾病和/或病癥(包括其他癌癥)的治療劑的示例性分子靶–包括csn5(uniprot登錄號q92905、ncbigeneid：10987)、cdk6(uniprot登錄號q00534、ncbigeneid：1021)、itgb1(uniprot登錄號p05556、ncbigeneid：3688)、myc(uniprot登錄號p01106、ncbigeneid：4609)、tgfβ1(uniprot登錄號p01137、ncbigeneid：7040)、細胞周期蛋白d1(uniprot登錄號q9h014、ncbigeneid：595)、鐵調(diào)素(hepcidin)(uniprot登錄號p81172、ncbigeneid：57817)、pcsk9(uniprot登錄號q8nbp7、ncbigeneid：255738)和運甲狀腺素蛋白(ttr、uniprot登錄號p02766、ncbigeneid：7276)等。

本發(fā)明制劑任選地可以靶向正常組織(例如，正常肝組織)以及各種模型(例如，原位肝模型、皮下肝模型等)。

本發(fā)明制劑的一個示例性靶是載脂蛋白b(apob)，其存在于不同類別的脂蛋白：乳糜微粒、極低密度脂蛋白(vldl)、中間密度脂蛋白(idl)和低密度脂蛋白(ldl)。apob作用為通過apob/e受體對ldl顆粒的細胞結(jié)合和內(nèi)化的識別信號。含有載脂蛋白b的脂蛋白的累積或過?？梢詫?dǎo)致脂質(zhì)相關(guān)的病癥，例如動脈粥樣硬化。減少apob的定制療法可用于治療脂質(zhì)相關(guān)的病癥。以反義療法形式的一種基于核酸的療法已經(jīng)顯示減少小鼠體內(nèi)的apob水平，并且治療隨后減少了血清膽固醇和三酸甘油酯水平(美國公布號2003/0215943)。這些結(jié)果說明了apob的適度下調(diào)及其作為治療脂質(zhì)相關(guān)病癥的靶的用途。

本發(fā)明制劑的另一個示例性靶是蛋白c，其可以靶向例如血友病的治療。

治療劑的遞送

本發(fā)明制劑可用于遞送治療劑(例如，聚陰離子劑、核酸或rnai劑)至細胞。通過所述制劑遞送的劑可用于基因沉默(例如，在體外或受試者體內(nèi))或治療或預(yù)防性治療受試者疾病(例如，癌癥)。

可以通過使用任何有用的方法來評估治療劑的遞送。例如，可以通過以下評估使用含有本發(fā)明化合物的制劑的遞送：1)靶基因的敲除或2)與等同劑量對照相比的毒性或耐受性。這些評估可以使用制劑中任何有用的脂質(zhì)組合來確定，例如與本發(fā)明化合物(例如，式(i)或表1中的任何化合物)組合的本文描述的任何陽離子脂質(zhì)(例如，dotap、dodma、dlindma和/或dlin-kc2-dma)。在特定實施方案中，當(dāng)使用本發(fā)明化合物時觀察到治療劑遞送的改善，其中所述改善與對照相比超過25％(例如，超過2倍、5倍、10倍、100倍或1000倍的遞送改善)。

rnai劑的遞送

rnai沉默可用于許多種細胞，其中helas3、cos7、293、nih/3t3、a549、ht-29、cho-ki和mcf-7細胞系易受一定水平的sirna沉默。而且，可以在對靶向基因具有特異性的rna水平下發(fā)生哺乳動物細胞中的抑制，其中已經(jīng)觀察到了rna與蛋白抑制之間的強關(guān)聯(lián)。相應(yīng)地，本發(fā)明化合物及其制劑可用于遞送rnai劑至一種或多種細胞(例如，體外或體內(nèi))。示例性rnai劑包括如本文描述的sirna、shrna、dsrna、mirna和dsirna劑。

體外靶敲除

可以通過任何有用的方法評估rnai劑的遞送。例如，可以在細胞培養(yǎng)模型(例如，hela細胞)中體外轉(zhuǎn)染包含治療劑的制劑，其中終點測量包括但不限于以下的一種或多種：(i)使用qpcr的mrna定量；(ii)使用western印跡的蛋白定量；(iii)劑和/或本發(fā)明的氨基-胺或氨基-酰胺陽離子脂質(zhì)的標記的細胞內(nèi)化。可以針對上述終點的程度和持續(xù)時間評價攝取或遞送。在遞送之前，可以在室溫下細胞培養(yǎng)液中稀釋制劑約30分鐘，并且最終濃度可以在劑量-響應(yīng)實驗中變化0至50nm治療劑或氨基-胺或氨基-酰胺陽離子脂質(zhì)。對于時程實驗，可以針對各種孵育時間、例如30分鐘至7天來研究劑量實驗的最佳濃度。

還可以通過用熒光標簽差異標記脂質(zhì)化合物和治療劑并進行熒光共定位研究來測試聚陽離子有效載荷和脂質(zhì)制劑的功能?？梢酝ㄟ^測量細胞內(nèi)的總熒光并通過測量與內(nèi)涵體或溶酶體室不穩(wěn)定結(jié)合的熒光(為了發(fā)揮功能，要求觸發(fā)rnai的治療劑不僅到達細胞內(nèi)部，而且要到達細胞的細胞質(zhì))來評估本發(fā)明化合物遞送聚陽離子有效載荷和/或連接的熒光標記的能力?，F(xiàn)有技術(shù)已經(jīng)描述了熒光定位和細胞運輸研究的性能(lu，等人，mol.pharm.6(3)：763，2009；mcnaughton等人，proc.natl.acad.sci.u.s.a.106(15)：6111，2009)。

遞送至特定靶細胞類型和靶組織

本發(fā)明化合物可用于遞送治療劑至各種器官和組織以治療各種疾病。示例性的靶向組織或器官包括但不限于肝、胰腺、肺、前列腺、腎、骨髓、脾、胸腺、淋巴結(jié)、腦、脊髓、心、骨骼肌、皮膚、口腔黏膜、食道、胃、回腸、小腸、結(jié)腸、膀胱、子宮頸、卵巢、睪丸、乳腺、腎上腺、脂肪組織(白色和/或棕色)、血液(例如造血干細胞，例如人類造血祖細胞、人類造血干細胞、cd34+細胞、cd4+細胞)、淋巴細胞和其他血液譜系細胞。

癌癥療法

本發(fā)明化合物可用于遞送一種或多種治療劑(例如，rnai劑)至具有癌癥或處于發(fā)展癌癥風(fēng)險(例如，至少10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或100％的增加的風(fēng)險)的受試者。示例性癌癥包括肝癌(例如，肝細胞癌、肝母細胞瘤、膽管癌、血管肉瘤或惡性血管瘤)或成神經(jīng)細胞瘤。示例性腫瘤疾病和相關(guān)并發(fā)癥包括但不限于癌(例如，原位的肺、乳腺、胰腺、結(jié)腸、肝細胞、腎、女性生殖道、鱗狀細胞癌)、淋巴瘤(例如、組織細胞淋巴瘤、非霍奇金淋巴瘤)、men2綜合征、多發(fā)性神經(jīng)纖維瘤(包括schwann細胞瘤)、骨髓增生異常綜合征、白血病、腫瘤血管生成、甲狀腺癌、肝、骨、皮膚、腦、中樞神經(jīng)系統(tǒng)、胰腺、肺(例如、小細胞肺癌、非小細胞肺癌(nsclc))、乳腺、結(jié)腸、膀胱、前列腺、胃腸道、子宮內(nèi)膜、輸卵管、睪丸和卵巢、胃腸道間質(zhì)瘤(gist)、前列腺腫瘤、肥大細胞瘤(包括犬肥大細胞瘤)、急性髓性骨髓纖維化、白血病、急性淋巴細胞白血病、慢性髓性白血病、慢性淋巴細胞白血病、多發(fā)性骨髓瘤、黑素瘤、肥大細胞增多癥、神經(jīng)膠質(zhì)瘤、成膠質(zhì)細胞瘤、星形細胞瘤、成神經(jīng)細胞瘤、肉瘤(例如，神經(jīng)外胚層起源的肉瘤或平滑肌肉瘤)、腫瘤轉(zhuǎn)移至其他組織和化療引起的缺氧。

施用和劑量

本發(fā)明還涉及含有化合物或治療有效量的組合物的藥物組合物，例如包含治療劑(例如，rnai劑)的制劑。所述組合物可以被配制用于許多藥物遞送系統(tǒng)。一種或多種生理上可接受的賦形劑或載體還可以包含在適當(dāng)制劑的組合物中。用于本發(fā)明的適當(dāng)制劑參見remington’spharmaceuticalsciences，mackpublishingcompany，philadelphia，pa，第17版，1985。有關(guān)藥物遞送方法的簡要綜述，參見例如langer，science249：1527-1533，1990。

藥物組合物預(yù)期用于胃腸外、鼻內(nèi)、表面、口服或局部施用，例如通過透皮方式，用于預(yù)防性和/或治療性治療。藥物組合物可以胃腸外施用(例如，通過靜脈內(nèi)、肌肉內(nèi)或皮下注射)，或通過口服，或通過在受血管或癌癥病狀影響的區(qū)域的表面施用或關(guān)節(jié)內(nèi)注射。其他施用途徑包括血管內(nèi)、動脈內(nèi)、腫瘤內(nèi)、腹膜內(nèi)、心室內(nèi)、硬膜內(nèi)以及鼻、眼、鞏膜內(nèi)、眼窩內(nèi)、直腸、表面或氣溶膠吸入施用。持續(xù)釋放施用也特別包括在本發(fā)明中，通過諸如長效注射劑或可侵蝕的植入物或組分的方式。因此，本發(fā)明提供了用于胃腸外施用的組合物，其包含溶解或懸浮于可接受載體、優(yōu)選水性載體、例如水、緩沖水、鹽水、pbs等中的上述劑。組合物可以含有適當(dāng)生理條件所需的藥學(xué)可接受的輔助物質(zhì)，例如ph調(diào)節(jié)劑和緩沖劑、滲透壓調(diào)節(jié)劑、潤濕劑、去污劑等。本發(fā)明還提供了用于口服遞送的組合物，其可以含有惰性成分，例如用于片劑、膠囊等制劑的粘合劑或填充劑。而且，本發(fā)明提供了用于局部施用的組合物，其可以含有惰性成分，例如用于乳霜、軟膏等制劑的溶劑或乳化劑。

這些組合物可以通過常規(guī)滅菌技術(shù)來滅菌，或者可以無菌過濾。得到的水溶液可以包裝原樣使用或者凍干，凍干的制品在施用之前與無菌水性載體組合。制品的ph通常在3至11，更優(yōu)選5至9或6至8，并且最優(yōu)選7至8，例如7至7.5。得到的固體形式的組合物可以多個單劑單位包裝，每個含有固定量的上述劑或多種劑，例如在密封包裝的片劑或膠囊中。固體形式的組合物還可以包裝在靈活數(shù)量的容器中，例如在設(shè)計用于表面應(yīng)用的乳霜或軟膏的可擠壓管中。

含有有效量的組合物可以被施用用于預(yù)防性或治療性治療。在預(yù)防性應(yīng)用中，可以將組合物施用給具有臨床確定的易感性或增加的發(fā)展腫瘤或癌癥的易感性的患者?？梢越o患者(例如，人)施用足以延遲、減少或優(yōu)選預(yù)防臨床疾病發(fā)生或腫瘤發(fā)生的量的本發(fā)明化合物。在治療應(yīng)用中，給已經(jīng)罹患癌癥的患者(例如，人)施用足以治愈或至少部分停止病狀及其并發(fā)癥的癥狀量的組合物。足以實現(xiàn)該目的的量被定義為“治療有效劑量”，是足以實質(zhì)改善與疾病或醫(yī)學(xué)病狀相關(guān)的一些癥狀的化合物的量。例如，在癌癥治療中，減少、預(yù)防、延遲、抑制或停止疾病或病狀的任何癥狀的劑或化合物將是治療上有效的。治療有效量的劑或化合物不是治愈疾病或病癥所必需的，但是將提供對疾病或病狀的治療以使個體中疾病或病狀的發(fā)生被延遲、阻礙或預(yù)防，或者疾病或病狀癥狀被緩解，或者疾病或病狀的期限被改變，或者例如較不嚴重或者加速恢復(fù)。

該用途的有效量可根據(jù)疾病或病狀的嚴重度和患者的體重和一般狀態(tài)，但是一般范圍從每患者每劑約0.5mg至約3000mg的所述劑或多種劑。適合初次施用和加強施用的方案典型為：初次施用，隨后以每小時、每日、每周或每月的間隔通過后續(xù)施用重復(fù)劑量一次或多次。本發(fā)明組合物中存在的劑的總有效量可以在相對短的時期以單劑(作為快速濃注或輸注)施用給哺乳動物，或者可以使用分次治療方案施用，其中在更長的時期施用多劑(例如，每4-6、8-12、14-16或18-24小時或每2-4天、1-2周、每月一劑)?？蛇x地，考慮足以維持血液中治療有效濃度的的連續(xù)靜脈內(nèi)輸注。

本發(fā)明組合物中存在的并且在本發(fā)明方法中應(yīng)用給哺乳動物(例如，人)的一種或多種劑的治療有效量可以由本領(lǐng)域普通技術(shù)人員考慮哺乳動物年齡、體重和病狀的個體差異來確定。本發(fā)明的劑以有效量施用給受試者(例如哺乳動物，例如人)，所述有效量是在受治療的受試者中產(chǎn)生希望結(jié)果(例如，減緩或消除癌癥或神經(jīng)變性病癥)的量。這種治療有效量可以由本領(lǐng)域技術(shù)人員經(jīng)驗確定。

患者還可以接收每周一次或多次(例如，每周2、3、4、5、6或7或更多次)的每劑約0.1至3,000mg、每周0.1至2,500(例如，2,000、1,500、1,000、500、100、10、1、0.5或0.1)mg劑量范圍的劑?；颊哌€可以接收每兩周或每三周一次的每劑0.1至3,000mg范圍的組合物的劑。

待施用的制劑和有效載荷(例如，dsirna)的量(劑量)可以經(jīng)驗確定。在某些實施方案中，使用0.0001-10mg/kg動物體重的核酸有效載荷和0.001-200mg/kg動物體重的遞送制劑觀察到基因表達的有效敲除。小鼠中的示例性量是0.1-5mg/kg核酸有效載荷和0.7-100mg/kg遞送制劑。任選地，施用約1-50mg/kg遞送制劑。因為它通常在較大劑量時是沒有毒性的，所以有效載荷(例如，dsirna)的量容易增加。

在某些實施方案中，根據(jù)例如急性與慢性適應(yīng)癥等，可以經(jīng)數(shù)日、數(shù)周或更長時間(例如，1至28天或更長)每日、或僅一次或以其他間隔施用劑。

可以使用治療醫(yī)師選擇的劑量水平和模式進行包含有效量的本發(fā)明組合物的單次或多次施用。可以基于患者疾病或病狀的嚴重度來確定并調(diào)整劑量和施用時間表，疾病或病狀的嚴重度可以在整個治療過程中根據(jù)醫(yī)師常用的方法或本文描述的方法來監(jiān)測。

本發(fā)明化合物和制劑可以與常規(guī)治療方法或療法組合使用，或者可以與常規(guī)治療方法或療法分開使用。當(dāng)本發(fā)明的化合物和制劑以與其他劑的組合療法施用時，它們可以連續(xù)或共時施用給個體?？蛇x地，根據(jù)本發(fā)明的藥物組合物包括如本文所述與藥學(xué)可接受的賦形劑結(jié)合的本發(fā)明化合物或制劑和本領(lǐng)域已知的另一治療劑或預(yù)防劑的組合。

配制的劑可以包裝在一起作為藥盒。非限制性實例包括含有例如兩種丸劑、一種丸劑和一種粉劑、一種栓劑和一種管形瓶中的液體、兩種表面乳霜等。藥盒可以包括輔助單位劑量施用給患者的任選組成部分，例如用于重構(gòu)粉劑形式的管形瓶、用于注射的注射器、定制的iv遞送系統(tǒng)、吸入器等。此外，單位劑量藥盒可以含有用于準備和施用組合物的說明書。藥盒可以被生產(chǎn)為供一個患者單次使用單位劑量、供特定患者多次使用(以恒定劑量，或者其中個體化合物可以在效價上隨治療進展而變化)；或者藥盒可以含有適合施用給多個患者的多個劑(“成批包裝”)。藥盒組分可以組裝在硬紙盒、泡罩包裝、瓶、管和類似物中。

組裝的納米顆粒中脂質(zhì)的pka值的測量

當(dāng)存在于不同環(huán)境中時，脂質(zhì)的不同的生理化學(xué)性質(zhì)極大地決定脂質(zhì)的行為。一個這種重要的性質(zhì)是脂質(zhì)的電離常數(shù)(ka)。當(dāng)存在于組裝的納米顆粒中時，脂質(zhì)的固有pka可能不是其行為的正確表示。當(dāng)存在于水性環(huán)境中時，脂質(zhì)經(jīng)歷了具有高介電常數(shù)的環(huán)境，而存在于組裝的納米顆粒/囊中時，其被提供低介電常數(shù)的脂質(zhì)包圍。此外，周圍脂質(zhì)、膽固醇和peg化的脂質(zhì)都影響制劑的表觀pka。陽離子脂質(zhì)和核酸之間的相互作用性質(zhì)是靜電的，制劑的表觀pka決定納米顆粒中核酸的包封以及其隨后的細胞內(nèi)釋放。

tns熒光方法可用于確定制劑中脂質(zhì)的表觀pka。tns(2-(對甲苯氨基)-6-萘磺酸)是帶負電荷的熒光染料，其熒光在水存在下猝滅。tns分配進入帶正電荷的膜，并且這導(dǎo)致歸因于水去除的熒光增加。因此，熒光增加可以用于估計陽離子脂質(zhì)存在于不同ph環(huán)境中時的電離。使用tns確定pka的方法是本領(lǐng)域已知的，例如，如實施例中所描述的。

實施例

實施例1：從酮和伯胺合成氨基-胺脂質(zhì)l-1

完全在n2氣氛下將酮a(1當(dāng)量)和胺b(1.1當(dāng)量)溶解于干燥燒瓶中的二氯乙烷中，并在室溫(rt)下攪拌30分鐘。添加三乙酰氧基硼氫化物(1.5當(dāng)量)，并在室溫攪拌混合物過夜。用1nnaoh猝滅反應(yīng)。用dcm稀釋猝滅的反應(yīng)并用水萃取一次、用鹽水萃取一次，并且經(jīng)na2so4干燥有機相。過濾干燥的溶液并在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀上濃縮。通過二氧化硅柱純化殘余物(步驟梯度開始于1％meoh/dcm至5％meoh/dcm，產(chǎn)率變化從60％至90％)以產(chǎn)生化合物l-1。h¹nmr(cdcl3)：5.41-5.30(m，8h)，3.12(t，2h)，2.91(m，1h)，2.77(t，6h)，2.48(bs，6h)，2.20(m，2h)，2.05(q，8h)，1.80-1.69(m，4h)，1.38-1.25(m，40h)，0.89(t，3h)；ms：電噴：[m+1]理論：613，實測：613。

通過調(diào)整該實施例的合成步驟，制備了其他氨基-胺脂質(zhì)，例如圖2a、2b和3中提供的那些

實施例2：從酮和仲胺合成氨基-胺脂質(zhì)l-2

完全在n2氣氛下將酮a(1當(dāng)量)溶解于干燥燒瓶中的干meoh中。添加胺b(1.1當(dāng)量)，隨后添加三乙酰氧基硼氫化物(1.5當(dāng)量)和acoh(1當(dāng)量)，并在室溫攪拌反應(yīng)過夜。用dcm稀釋反應(yīng)并用水萃取一次、用鹽水萃取一次，并且經(jīng)na2so4干燥有機相。過濾干燥的溶液并在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀上濃縮。通過二氧化硅柱純化殘余物(步驟梯度開始于1％meoh/dcm至5％meoh/dcm，產(chǎn)率變化從60％至90％)以產(chǎn)生化合物l-2。h¹nmr：(cd3od)5.39-5.30(m，8h)，2.78(t，4h)，2.59-2.52(m，10h)，2.33(bs，8h)，2.07(q，8h)，1.25(m，2h)，1.40-1.26(m，40h)，0.914(t，6h)；ms：電噴pos.[m+1]理論668，實測668。

通過調(diào)整該實施例的合成步驟，制備了其他氨基-胺脂質(zhì)，例如圖4和5中提供的l-2和l-6類似物。

實施例3：從酮和嗎啉合成脂質(zhì)l-46

向酮a(2.66g；5.05mmol)、嗎啉b(1.34ml；15mmol)和acoh(1.77ml；30mmol)在dce(12ml)中的混合物添加nabh(aco)3(1.6g；7.5mmol)。在室溫攪拌反應(yīng)混合物72小時。tlc測試(二氧化硅凝膠；用己烷：etac-et3n95：5洗脫)指示大約45％轉(zhuǎn)化。用5％k2co3水溶液稀釋反應(yīng)混合物并用dcm萃取。經(jīng)k2co3干燥溶劑并在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀上蒸發(fā)。通過在二氧化硅凝膠上的lc分離殘余物(用己烷：etac90：10洗脫)。以39％產(chǎn)率(1.18g)獲得想要的產(chǎn)物l-46并通過nmr檢測是純的。

實施例4：從酮和哌啶合成脂質(zhì)l-47

向二亞油烯基酮a(3.99g；7.58mmol)、哌啶b(2.25ml；22mmol)和acoh(1.33ml；23mmol)在dce(24ml)中的混合物添加nabh(aco)3(2.4g；11.3mmol)。在室溫攪拌反應(yīng)混合物96小時。tlc測試(二氧化硅凝膠；用己烷：etac-et3n95：5洗脫)指示大約35％轉(zhuǎn)化。用5％k2co3水溶液稀釋反應(yīng)混合物并用dcm萃取。經(jīng)k2co3干燥溶劑并在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀上蒸發(fā)。通過在二氧化硅凝膠上的lc分離殘余物(用己烷：etac90：10洗脫)。以29％產(chǎn)率(1.30g)獲得想要的產(chǎn)物l-47并通過nmr檢測是純的。

通過使用本實施例以及實施例3中提供的方法，可以制備具有各種頭基的陽離子脂質(zhì)，例如圖9中提供的那些。

實施例5：從伯胺和羧酸合成酰胺陽離子脂質(zhì)

使用以下一般程序制備以下二亞油烯基酰胺衍生物。向二亞油烯基胺(338mg；0.64mmol)、hobt(65mg；0.5mmol)、氨基酸(1mmol)和dipea(1當(dāng)量)在dcm(15g/ml)中的溶液組合，隨后添加edc(1.2mmol)。在室溫攪拌反應(yīng)混合物過夜。tlc指示反應(yīng)完全。用0.5％k2co3水溶液稀釋反應(yīng)混合物并用dcm萃取。在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀上濃縮之后，通過二氧化硅凝膠色譜純化粗產(chǎn)物(梯度從己烷：et3n95：5至己烷：chcl3：et3n46：44：5)。獲得產(chǎn)率為80-85％。

基于以下提供的方案還制備了二油烯基衍生物：

從伯胺和羧酸合成脂質(zhì)l-30

從伯胺和羧酸合成脂質(zhì)l-31

從伯胺和羧酸合成脂質(zhì)l-32

從伯胺和羧酸合成脂質(zhì)l-42

通過調(diào)整本實施例的合成步驟，制備了其他酰胺-胺脂質(zhì)，例如圖6-8中提供的那些。

實施例6：胺脂質(zhì)制劑的制備

為了測試脂質(zhì)l-1和l-2的效力，使用陽離子脂質(zhì)(dodma)、中性脂質(zhì)(dspc)、peg-脂質(zhì)軛合物(peg-dmpe和peg-dmg)和膽固醇與具有以下結(jié)構(gòu)的rnai劑(對hprt1而言是dsirna)制備制劑：

5′-gccagacuuuguuggauuugaaatt(seqidno：1)

3′-uucggucugaaacaaccuaaacuuuaa(seqidno：2)，

其中大寫字母表示rna核苷酸，下劃線的大寫字母表示2’-o-甲基-rna核苷酸，并且小寫字母表示dna核苷酸。

dsirna鏈的制備：寡核苷酸合成和純化

合成了個體rna鏈并根據(jù)標準方法(integrateddnatechnologies，coralville，iowa)hplc純化。例如，使用固相亞磷酰胺化學(xué)合成rna寡核苷酸，脫保護并使用標準技術(shù)(damha和olgivie，methodsmol.biol.20：81，1993；wincott等人，nucleicacidsres.23：2677，1995)在nap-5柱(amershampharmaciabiotech，piscataway，n.j.)上脫鹽。使用amershamsource15q柱(1.0cmx25cm；amershampharmaciabiotech，piscataway，n.j.)上離子交換高效液相色譜(ie-hplc)純化寡聚體，使用15分鐘逐步線性梯度。梯度從90：10緩沖液a：b至52：48緩沖液a：b，其中緩沖液a是100mmtrisph8.5，并且緩沖液b是100mmtrisph8.5，1mnacl。在260nm監(jiān)測樣品，并且收集相應(yīng)于全長寡核苷酸物類的峰，匯集，并在nap-5柱上脫鹽，并凍干。

通過在beckmanpace5000(beckmancoulter，inc.，fullerton，calif.)上毛細管電泳(ce)來測定每個寡聚體的純度。ce毛細管具有100μm內(nèi)徑并且含有ssdna100rgel(beckman-coulter)。通常，將約0.6納摩爾的寡核苷酸注射進入毛細管，在444v/cm的電場中運行并通過在260nm的uv吸光度檢測。變性tris-borate-7m-尿素運行緩沖液購自beckman-coulter。獲得如通過ce評估的至少90％純的寡核糖核苷酸用于下述實驗。根據(jù)生產(chǎn)商推薦方案，通過voyagerdetmbiospectometryworkstation(appliedbiosystems，fostercity，calif.)上基質(zhì)輔助的激光解吸電離飛行時間(maldi-tof)質(zhì)譜，確認了化合物身份。獲得所有寡聚體的相對分子量，通常在0.2％的預(yù)期分子量內(nèi)。

dsirna雙鏈體的制備

將單鏈rna(ssrna)寡聚體以例如100μm濃度重懸于由100mm醋酸鉀、30mmhepes，ph7.5組成的緩沖液。以等摩爾量混合互補的有義和反義鏈，以產(chǎn)生例如50μm雙鏈體的最終溶液。在rna緩沖液(idt)中加熱樣品至100℃持續(xù)5分鐘并允許在使用之前冷卻至室溫。在-20℃下儲存雙鏈rna(dsrna)寡聚體。將單鏈rna寡聚體凍干儲存或者儲存在-80℃無核酸酶的水中。

基于囊的脂質(zhì)制劑的制備

用表5中提供的mol％制備脂質(zhì)顆粒?？傊|(zhì)與dsirna比率為約1：7。

表5

rna結(jié)合劑和轉(zhuǎn)染脂質(zhì)制劑的制備

用表6中提供的mol％制備脂質(zhì)顆粒。總脂質(zhì)與dsirna比率為約1：20。

表6

在表5和6中，peg-dmpe是1，2-二肉豆蔻?；?sn-甘油基-3-磷酸乙醇胺-n-[甲氧基(聚乙二醇)-2000]，并且peg-dmg是(r)-3-[(ω-甲氧基-peg2000-氨基甲?；?]-1，2-二-o-十四烷基-sn-甘油酯。

實施例7：胺脂質(zhì)制劑的體外性能

為了評估各種脂質(zhì)制劑的效力，使用靶向hprt1的dsirna分子進行體外測定。如以上實施例6中所述，使用針對hprt1的dsirna制備脂質(zhì)制劑。

細胞培養(yǎng)和rna轉(zhuǎn)染

hela細胞獲自atcc并在37℃、5％co2下維持于補充有10％胎牛血清(hyclone)的dulbecco改良的eagle培養(yǎng)基(hyclone)。通過與終濃度為1nm、5nm或25nm的本發(fā)明制劑孵育而將本發(fā)明的dsrna-陽離子脂質(zhì)制劑轉(zhuǎn)染進入hela細胞。使用0.1nm或1nm的lipofectamine^tmrnaimax(invitrogen)dsrna作為陽性對照。簡言之，每種dsrna的2.5μl的0.2μm或0.02μm儲液與47.5μlopti-memi(invitrogen)混合。對于lipofectamine^tm對照，每種dsrna的2.5μl的0.2μm或0.02μm儲液與46.5μlopti-memi(invitrogen)和1μllipofectamine^tmrnaimax混合。將得到的50μl混合物加入12孔板的單個孔，并在室溫孵育20分鐘以允許形成dsrna：lipofectamine^tmrnaimax復(fù)合體。

同時，使hela細胞胰蛋白酶化并以約367細胞/μl的終濃度重懸于培養(yǎng)基中。最后，將450μl細胞懸液加至每個孔(終體積500μl)并將板放入孵育器持續(xù)24小時。對于劑量響應(yīng)研究，dsrna的濃度變化從最初10pm至100nm。對于時程研究，研究了約4小時至約72小時的孵育時間。

抑制的評估

通過qrt-pcr測定靶基因敲除，值被標準化為hprt表達對照治療，包括單獨lipofectamine^tmrnaimax(媒介物對照)或未治療的。

rna分離和分析

用2mlpbs洗滌細胞一次，并使用rneasyminikit^tm(qiagen)萃取總rna并以30μl總體積洗脫。使用transcriptor1^ststrandcdnakit^tm(roche)和隨機六聚體根據(jù)生產(chǎn)商說明書反轉(zhuǎn)錄1μg總rna。將得到的cdna的三十分之一(0.66μl)與5μliqmultiplexpowermix(bio-rad)、3.33μlh2o和1μl含有特異性針對人類基因hprt-1(登錄號nm_000194)靶序列的引物和探針的3μm混合物混合在一起。

定量rt-pcr

具有c1000熱循環(huán)儀(bio-rad)的cfx96實時系統(tǒng)用于擴增反應(yīng)。pcr條件是：95℃持續(xù)3分鐘；然后以95℃、10秒鐘循環(huán)；并以55℃、1分鐘進行40個循環(huán)。每個樣品三次重復(fù)測試。將相對的hprtmrna水平標準化為靶mrna水平并與用單獨轉(zhuǎn)染劑治療或未治療的對照樣品中獲得的mrna水平對比。使用bio-radcfxmanager版本1.0軟件分析數(shù)據(jù)。表達數(shù)據(jù)表示為dsrna的氨基-胺陽離子脂質(zhì)制劑與沒有氨基-胺陽離子脂質(zhì)的dsrna制劑治療下的表達對比。

結(jié)果

圖10提供了使用含有氨基-胺脂質(zhì)l-1或l-2的脂質(zhì)顆粒的體外敲除的結(jié)果?？傮w上，當(dāng)施用至hela細胞時，l-1和l-2有效抑制了靶mrna水平。具體地，l-1在最低濃度1nm下提供了約70％的剩余mrna水平。相應(yīng)地，當(dāng)通過轉(zhuǎn)染施用至hela細胞時，氨基-胺脂質(zhì)提供了rnai劑的有效遞送。因此，本發(fā)明化合物的任何一個，例如其任何脂質(zhì)或制劑，將用于遞送聚陽離子有效載荷，例如rnai劑或反義有效載荷。

實施例8：胺脂質(zhì)制劑的體內(nèi)性能

為了進一步評估脂質(zhì)的性能，使用具有針對hprt1的dsirna的制劑進行體內(nèi)實驗。

使用以下適當(dāng)百分比制備制劑：20mol％的l-1、l-2、l-5、l-6、l-7、l-8、l-22或l-30中的一個；26mol％的dodma；3mol％的peg2000-dmpe；3mol％的peg2000-dmg；13mol％的dspc；和33mol％的膽固醇。制劑還包括比率約1：20(w/w)的dsirna：總脂質(zhì)。

通過經(jīng)由尾靜脈的靜脈內(nèi)施用給大約4周大的cd1雌性小鼠施用單劑(1mg/kg或5mg/kg)脂質(zhì)顆粒制劑，給藥體積為10μl/g體重。48小時(給藥后)后，在rnalater(qiagen)中收集組織。在終點分析中，從小鼠肝分離總rna來進行rt-qpcr。室溫之前，在70℃加熱rna樣品與oligo(dt)引物持續(xù)5分鐘。在pcr反應(yīng)中，用rpl23(管家基因，在這里用作對照)標準化mhprt表達。圖11和12顯示了具有誤差棒的數(shù)據(jù)，n＝5只動物/組的平均值±sd。

在第一組實驗中，脂質(zhì)制劑的劑量時單劑5mg/kg(圖11)。以該劑量，化合物l-1和l-7提供了約80％至約90％的剩余mrna水平。如約15％的剩余mrna水平所證明的，頭基中、例如l-30中氧基團的添加提供了基因沉默的明顯增加。此外，頭基中具有雜環(huán)基的化合物(例如，l-2、l-5、l-6、l-8和l-22)提供了具有約15％至約45％的剩余mrna水平的化合物。各種制劑的％mrna敲除示于表7。表7還顯示了每種脂質(zhì)的pka值，如通過tns熒光方法所測量的。

為了測定本發(fā)明陽離子脂質(zhì)的pka值，在不同ph值的磷酸鹽緩沖液中孵育制劑(濃度為1mm)，向其中添加溶解于dmso的tns(得到的終濃度為6μmtns)。在m3熒光讀板儀上測量得到的溶液的熒光，激發(fā)波長為325nm并且發(fā)射波長為435nm。測量的tns熒光用方程式1所示的三參數(shù)s型函數(shù)擬合。

達到最大熒光一半時的ph被報告為制劑的表觀pka，其中a和b是分別反映觀察到的最大熒光和s型函數(shù)斜率的無因次參數(shù)。

表7

在第二組實驗中，以1mg/kg或5mg/kg的單劑劑量評估化合物l-2、l-5、l-6和l-30(圖12)。具體地，l-5，l-6和l-30以1mg/kg的較低劑量提供了有效的基因沉默?？傮w而言，這些數(shù)據(jù)提供了在體內(nèi)模型中作為靶rna水平的有效抑制劑的各種脂質(zhì)化合物和劑量。

為了評估含有本發(fā)明的氨基-胺或氨基-酰胺陽離子脂質(zhì)和dsrna的脂質(zhì)制劑的耐受性，用l-6和l-30制劑注射雌性cd-1小鼠[以10mg/kgdsirna劑量的2劑施用(qod)，各自約200mg/kg總脂質(zhì)劑量]，并在第二劑之后48小時收集血清樣品。測試血清樣品的一組臨床化學(xué)評估，包括通過測量酶丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶(alt)和天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶(ast)的肝功能測試(lft)。使用磷酸鹽緩沖鹽水(pbs)作為媒介物對照組。制劑l-6和l-30的alt和ast升高是pbs組的<3x。對于l-6和l-30制劑，也沒有觀察到體重或肝的變化。因此，l-6和l-30制劑是良好耐受的。因此，本文描述的任何脂質(zhì)及其制劑可用于遞送一種或多種劑，例如聚陰離子或反義有效載荷。

實施例9：使用含有dsrna的脂質(zhì)制劑來減少皮下動物腫瘤模型中靶基因的表達

為了評估含有氨基-胺或氨基-酰胺陽離子脂質(zhì)和dsrna的脂質(zhì)制劑的遞送效率和后續(xù)功能，使用了具有某些調(diào)整的皮下(s.c.)腫瘤模型(judge等人，j.clin.invest.119：661，2009)。通過s.c.注射50μlpbs中的3×10⁶細胞進入左后側(cè)而在雄性nu/nu小鼠中建立了hep3b腫瘤。在腫瘤播種變得可觸診之后10-17天，將小鼠隨機分成治療組。通過經(jīng)由外側(cè)尾靜脈的標準靜脈內(nèi)(i.v.)注射來施用dsrna或媒介物對照的脂質(zhì)制劑，基于根據(jù)個體動物體重的mgdsrna/kg體重基礎(chǔ)來計算。使用數(shù)字卡尺以2個尺度(寬×長)測量腫瘤以評估腫瘤生長。使用方程式x*y*y/2計算腫瘤體積，其中x＝最大直徑并且y＝最小直徑，并且表示為組平均值±sd。還從不同治療組的動物取出腫瘤組織并證實基因敲除。腫瘤體積、存活和rna表達數(shù)據(jù)表示為dsrna脂質(zhì)制劑的治療與沒有氨基-胺或氨基-酰胺陽離子脂質(zhì)的dsrna制劑的治療之間的對比。

實施例10：使用含有dsrna的脂質(zhì)制劑減少hep3b原位肝腫瘤模型中靶基因的表達

為了評估dsrna的氨基-胺或氨基-酰胺陽離子脂質(zhì)制劑的靶向效率和后續(xù)功能，使用了具有某些調(diào)整的肝內(nèi)腫瘤模型(judge等人，j.clin.invest.119：661，2009)。通過直接肝內(nèi)注射hep3b腫瘤細胞而在小鼠中建立了肝腫瘤。使用雄性nu/nu小鼠作為hep3b腫瘤的宿主。使用2，2，2-三溴乙醇(sigma)使小鼠維持麻醉，在胸骨之下做出跨中線的單個1-cm切口，并且取出左肝外葉。使用hamilton注射器和30號針頭將懸浮于40μl50％pbs/50％matrigel^tm(bd)的大約2×10⁶hep3b細胞以淺角度緩慢注射進入所述葉。然后在縫合之前將拭子應(yīng)用于刺傷以停止任何出血。允許小鼠在無菌籠中從麻醉中恢復(fù)，并在返回常規(guī)圈舍之前嚴密監(jiān)視2-4小時。腫瘤植入之后約三周，將小鼠隨機分成治療組。小鼠(n＝7每組)接收了：(1)dsrna的氨基-胺或氨基-酰胺脂質(zhì)制劑；(2)沒有氨基-胺或氨基-酰胺陽離子脂質(zhì)的dsrna制劑；或(3)媒介物對照，如通過經(jīng)由外側(cè)尾靜脈的標準靜脈內(nèi)(i.v.)注射來施用?；诟鶕?jù)個體動物體重的mgdsrna/kg體重基礎(chǔ)來計算劑量。

對于產(chǎn)生了圖13所示結(jié)果的實驗，動物被給予含有l(wèi)-6-或l-30-配制的脂質(zhì)顆粒的5mg/kgdsirna。表8提供了本研究中使用的包含l-6和l-30脂質(zhì)的脂質(zhì)制劑的具體組成。

表8

在整個研究期間監(jiān)測體重，作為發(fā)生腫瘤負荷和治療耐受性的指標。對于效力研究，測定定義的人性化終點作為存活的替代。根據(jù)臨床體征、體重減輕和腹脹的組合進行評估，以確定由于腫瘤負荷的安樂死日期。從不同治療組的動物取出腫瘤組織并確認基因敲除。

如圖13所示，測試的l-6和l-30制劑在遞送配制的抗hprt1dsirna有效載荷至肝和原位hep3b腫瘤組織方面都非常有效。具體地，與pbs對照相比，在肝和原位hep3b腫瘤組織中觀察到了大于50％敲除(和在某些情況下，60-80％敲除)的hprt1靶mrna。因此，任何脂質(zhì)或其制劑將用于減少靶基因的表達(例如，與癌癥相關(guān)的靶基因)。

實施例11：使用含有dsrna的脂質(zhì)制劑減少hepg2原位肝腫瘤模型中靶基因的表達

為了評估dsrna的氨基-胺或氨基-酰胺陽離子脂質(zhì)制劑的靶向效率和后續(xù)功能，使用了第二肝內(nèi)腫瘤模型。通過hepg2腫瘤細胞的直接肝內(nèi)注射在小鼠中建立了肝腫瘤。使用雌性nu/nu小鼠作為hepg2腫瘤的宿主。使用avertin(sigma)使小鼠維持麻醉，在胸骨之下做出跨中線的單個1-cm切口，并且取出左肝外葉。使用hamilton注射器和30號針頭將懸浮于60μl50％pbs/50％matrigel^tm(bd)的大約3×10⁶hepg2細胞以淺角度緩慢注射進入所述葉。然后在縫合之前將拭子應(yīng)用于刺傷以停止任何出血。允許小鼠在無菌籠中從麻醉中恢復(fù)，并在返回常規(guī)圈舍之前嚴密監(jiān)視2-4小時。腫瘤植入之后約三周，將小鼠隨機分成治療組。小鼠(n＝7每組)接收了：(1)dsrna的氨基-胺或氨基-酰胺脂質(zhì)制劑；(2)沒有氨基-胺或氨基-酰胺陽離子脂質(zhì)的dsrna制劑；或(3)媒介物對照，如通過經(jīng)由外側(cè)尾靜脈的標準靜脈內(nèi)(i.v.)注射來施用?；诟鶕?jù)個體動物體重的mgdsrna/kg體重基礎(chǔ)來計算劑量。產(chǎn)生了圖14所示結(jié)果的實驗給予l-6-或l-30-配制的脂質(zhì)顆粒中的5mg/kgdsirna。表8提供了本研究中使用的包含l-6和l-30脂質(zhì)的脂質(zhì)制劑的具體組成。在整個研究期間監(jiān)測體重，作為發(fā)生腫瘤負荷和治療耐受性的指標。對于效率研究，測定定義的人性化終點作為存活的替代。根據(jù)臨床體征、體重減輕和腹脹的組合進行評估，以確定由于腫瘤負荷的安樂死日期。從不同治療組的動物取出腫瘤組織并確認基因敲除。

如圖14所示，測試的l-6和l-30制劑在遞送配制的抗hprt1dsirna有效載荷至肝組織方面都非常有效。同時，在原位hepg2腫瘤組織中觀察到兩個制劑的20-50％水平的hprt1靶mrna敲除。以上結(jié)果確認這里檢驗的l-6和l-30制劑為有效的dsrna遞送媒介物，用于遞送至正常肝和至少某些腫瘤組織(例如，原位hep3b腫瘤，和其次原位hepg2腫瘤)。因此，任何脂質(zhì)或其制劑將用于減少靶基因的表達(例如，與癌癥相關(guān)的靶基因)。

還可以通過用熒光標簽標記脂質(zhì)和/或dsrna并使用活動物成像系統(tǒng)(xenogen或biorad)進行熒光生物分布研究來測試dsrna的脂質(zhì)制劑供腫瘤細胞攝取的功能(eguchi等人，nat.biotechnol.27：567，2009)。使用該方法，并通過與單獨dsrna制劑的對比，證實了氨基-胺或氨基-酰胺陽離子脂質(zhì)促進腫瘤細胞對dsrna內(nèi)化的能力。相反，在本研究中用作對照的單獨的dsrna制劑不能被相同程度地攝取并遞送至腫瘤表面。效力終點、rna表達和生物分布數(shù)據(jù)被表示為dsrna脂質(zhì)制劑的治療與沒有氨基-胺或氨基-酰胺陽離子脂質(zhì)的dsrna制劑的治療之間的對比。

實施例12：脂質(zhì)制劑的肝細胞癌抗腫瘤效力

通過如實施例10所述直接肝內(nèi)注射hep3b腫瘤細胞而在小鼠中建立了肝腫瘤。在腫瘤植入后約2周，將小鼠隨機分入治療組。小鼠(n＝6每組)接收了：(1)對照dsrna的氨基-胺或氨基-酰胺脂質(zhì)制劑；(2)活性dsrna的氨基-胺或氨基-酰胺脂質(zhì)制劑；或(3)媒介物對照，如通過經(jīng)由外側(cè)尾靜脈的標準靜脈內(nèi)(i.v.)注射來施用?；诟鶕?jù)個體動物體重的mgdsrna/kg體重基礎(chǔ)來計算劑量。在產(chǎn)生了圖15和16所示結(jié)果的實驗中，給予動物含有l(wèi)-6-或l-30-配制的脂質(zhì)顆粒的5mg/kgdsirna。上表8提供了本研究中使用的包含l-6和l-30脂質(zhì)的脂質(zhì)制劑的具體組成。

在整個研究期間監(jiān)測體重，作為發(fā)生腫瘤負荷和治療耐受性的指標。對于效率研究，測定定義的人性化終點作為存活的替代。根據(jù)臨床體征、體重減輕和腹脹的組合進行評估，以確定由于腫瘤負荷的安樂死日期。從不同治療組的動物取出腫瘤組織并測量腫瘤重量以確定不同治療組的效力。還測量了血清α-甲胎蛋白(afp)水平，作為腫瘤負荷的生物標識。

與具有對照有效載荷的l-6和l-30制劑和pbs對照相比，具有活性有效載荷的l-6和l-30制劑在減少血清afp(圖15)和腫瘤重量(圖16)方面非常有效。

實施例13：使用具有dsrna的不同的l-30脂質(zhì)制劑來減少多個原位肝癌模型中各種靶基因的表達

為了評估不同的l-30制劑是否可以調(diào)節(jié)腫瘤中hprt1相對于肝的敲除，調(diào)整了peg-脂質(zhì)含量。表9提供了本研究中使用的包含l-30脂質(zhì)的脂質(zhì)制劑的具體組成。產(chǎn)生了圖18所示結(jié)果的實驗給予l-30[1]配制的脂質(zhì)顆粒中的1、3和10mg/kgdsirna和l-30[2]配制的脂質(zhì)顆粒中的10mg/kgdsirna。可以使用任何有用的溶劑或溶劑系統(tǒng)來將rna結(jié)合劑和dsirna引入制劑，包括與用于轉(zhuǎn)染脂質(zhì)的溶劑相同或不同的溶劑和溶劑系統(tǒng)(例如，水性和/或非水性溶劑)。

如圖18所示，l-30[1]和l-30[2]制劑在遞送配制的抗hprt1dsirna有效載荷至肝組織以及在原位hep3b腫瘤組織中都有效。同時，含有10mg/kgdsirna的l-30[2]與l-30[1]制劑相比，肝敲除顯著減少而對腫瘤敲除無不利影響。這些結(jié)果指示，增加脂質(zhì)制劑中的peg-脂質(zhì)含量可以影響脂質(zhì)顆粒至某些組織的遞送和隨后靶基因的敲除。

在各種原位肝癌模型中使用不同的dsrna測試了l-30[1]制劑作為dsrna遞送媒介物的效力。圖19顯示了從使用不同肝癌模型的實驗產(chǎn)生的結(jié)果，顯示l-30[1]與對照相比在遞送配制的抗hprt1dsirna有效載荷至所有測試癌癥模型方面是有效的。圖20顯示了從使用含有多個獨立dsirna的l-30[1]制劑的實驗產(chǎn)生的結(jié)果和相應(yīng)基因在原位hep3bhcc腫瘤模型中的敲除。相應(yīng)地，本文描述的任何脂質(zhì)可用于替代表9中脂質(zhì)制劑的具體組成中的l-30，并且任何dsrna可用于減少靶基因(例如，與本文描述的癌癥或疾病相關(guān)的靶基因)的表達。

表9

¹純化之前；²脂質(zhì)摩爾百分比

實施例14：使用具有dsrna的不同l-30脂質(zhì)制劑減少hep3bhcc腫瘤組織中的靶基因表達

為了評估dsrna的l-30制劑的靶向效率和后續(xù)功能，測試了脂質(zhì)摩爾百分比變化的l-30制劑。表10提供了包含l-30作為轉(zhuǎn)染脂質(zhì)的脂質(zhì)制劑的具體組成。具體地，l-30[e]和l-30[g]制劑含有替代dodma的l-48作為rna結(jié)合劑。l-48包括h-5頭基和二油烯基尾基(圖17)。任何有用的溶劑或溶劑系統(tǒng)可用于將rna結(jié)合劑和dsirna引入制劑，包括與用于轉(zhuǎn)染脂質(zhì)的溶劑相同或不同的溶劑和溶劑系統(tǒng)(例如，水性和/或非水性溶劑)。

hep3bhcc腫瘤組織中hhprt1敲除的結(jié)果顯示于圖21。所有l(wèi)-30制劑(即，[a]至[g])導(dǎo)致與pbs對照相比，腫瘤組織中的hhprt1表達下降。具體地，l-30[a]提供了hhprt1表達的最大下降，隨后是l-30[d]、l-30[g]和l-30[e]。

表10

¹純化之前；²脂質(zhì)摩爾百分比；³還成功制備了含有8％乙醇的相同制劑

實施例15：使用具有dsrna的不同的l-6和l-30脂質(zhì)制劑減少肺和前列腺腫瘤組織中的靶基因表達

為了評估不同的l-6和l-30制劑的靶向效率和后續(xù)功能，測試了不同腫瘤組織中的hprt1mrna敲除。表9、10和11提供了本研究中使用的包含l-6和l-30脂質(zhì)的脂質(zhì)制劑的具體組成?？梢允褂萌魏斡杏玫娜軇┗蛉軇┫到y(tǒng)來將rna結(jié)合劑和核酸有效載荷(例如，dsirna)引入制劑，包括與用于轉(zhuǎn)染脂質(zhì)的溶劑相同或不同的溶劑和溶劑系統(tǒng)(例如，水性和/或非水性溶劑)。

產(chǎn)生圖22的實驗給予l-6[2]和l-30[2]配制的脂質(zhì)顆粒中10mg/kgdsirna并在實驗第1天和第3天施用。在第5天收獲腫瘤。測量h1975nsclc肺腫瘤組織中hhprt1mrna的敲除。觀察到l-30[2]制劑與l-6[2]制劑相比，更大水平的hprt1靶mrna敲除。

產(chǎn)生圖23的實驗給予l-6[2]和l-30[3]配制的脂質(zhì)顆粒中10mg/kgdsirna并在實驗第1天和第3天施用。在第5天收獲腫瘤。測量22rv1前列腺癌sc異種移植腫瘤組織中hhprt1mrna的敲除。觀察到l-30[3]制劑與l-6[2]制劑相比，更大水平的hprt1靶mrna敲除。圖24顯示了肝中植入的22rv1前列腺癌中hhprt1敲除的結(jié)果。建立與圖23中進行的實驗類似的實驗。在圖24的具體實驗中，觀察到l-6[1]制劑與l-30[a]和l-30[e]制劑兩者相比，更大水平的hprt1靶mrna敲除。相應(yīng)地，本文描述的任何脂質(zhì)可用于替代表9中脂質(zhì)制劑具體組成中的l-6或l-30，并且任何dsrna可用于減少癌癥(例如，本文描述的任何癌癥)相關(guān)靶基因的表達。

表11

¹純化之前；²脂質(zhì)摩爾百分比

實施例16：含有l(wèi)-30與dsrna的脂質(zhì)制劑

表12提供了包含l-30作為轉(zhuǎn)染脂質(zhì)的脂質(zhì)制劑的具體組分?？梢允褂萌魏斡杏玫娜軇┗蛉軇┫到y(tǒng)來將rna結(jié)合劑和dsirna引入制劑，包括與用于轉(zhuǎn)染脂質(zhì)的溶劑相同或不同的溶劑和溶劑系統(tǒng)(例如，水性和/或非水性溶劑)。而且，本文描述的任何脂質(zhì)可用于替代表12中作為轉(zhuǎn)染脂質(zhì)的l-30(例如，本文描述、例如表1中的任何一個)，并且任何dsrna可用于減少靶基因(例如，與本文描述的癌癥或疾病相關(guān)的靶基因)的表達。

表12

¹dodma和l-30的組合

其他實施方案

雖然已經(jīng)結(jié)合其具體實施方案描述了本發(fā)明，但要理解，其能夠做出進一步調(diào)整，并且該適用預(yù)期涵蓋總體遵循本發(fā)明原理并且包括落入本發(fā)明所屬領(lǐng)域已知或慣例內(nèi)的此類與本公開內(nèi)容的偏離的本發(fā)明的任何變化、用途或適應(yīng)，并且可適用于前文提出的基本特征。

所有出版物、專利和專利申請通過引用整體并入本文，程度如同每個出版物、專利或?qū)＠暾埫鞔_且單獨地被指明通過引用整體并入。

序列表

<110>迪克納制藥公司(dicernapharmaceuticals,inc.)

<120>胺陽離子脂質(zhì)及其用途

<130>spi172153-81

<140>pct/us2012/060875

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<222>(25)..(25)

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<222>(26)..(27)

<223>n是2'-o-甲基-u

<400>2

aauuucaaauncnanananunungnnn27