本發(fā)明屬于醫(yī)藥技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種酶法催化合成依折麥布中間體的方法。
背景技術(shù)：
依折麥布是由先靈葆雅(scheringpliugh)公司和默克(merck)共同研發(fā)的一種新型抑制膽固醇吸收的降血脂藥物。該藥品于2002年底被美國食品藥物管理局(fda)批準(zhǔn)在德國和美國上市，商品名為ezetrol(益識純)。依折麥布(ezetimibe)與他汀類藥物聯(lián)合使用成為調(diào)脂治療新方法。專利2016年到期，開發(fā)生產(chǎn)該藥物有重要的社會效益及巨大的經(jīng)濟(jì)效益。
依折麥布結(jié)構(gòu)中有3個手性中心，兩個手性中心在β-內(nèi)酰胺上，另外一個是(s)-羥基的構(gòu)建。構(gòu)建(s)-羥基的方法為化學(xué)法或者生物法還原(4s)-3-[5-(4-氟苯基)-1,5-二氧代戊基)-4-苯基-2-惡唑烷酮，其中化學(xué)法得到的產(chǎn)物光學(xué)純度較低，降低了產(chǎn)品品質(zhì)；而生物法具有反應(yīng)條件溫和，反應(yīng)轉(zhuǎn)化率高，產(chǎn)物化學(xué)純度和光學(xué)純度高等優(yōu)點(diǎn)。目前報(bào)道的生物催化酶主要有羰基還原酶。羰基還原酶是一類通過分子內(nèi)親核取代機(jī)制催化鄰鹵醇轉(zhuǎn)化為環(huán)氧化物的脫鹵酶，可以高效高選擇地催化環(huán)氧化物和鄰鹵醇之間的轉(zhuǎn)化，因而可以用來合成具有光學(xué)純的醇類化合物，具有傳統(tǒng)化學(xué)合成法所無法比擬的優(yōu)越性。羰基還原酶在輔酶作用下就能催化底物(4s)-3-[5-(4-氟苯基)-1,5-二氧代戊基)-4-苯基-2-惡唑烷酮為(4s)-3-[(5s)-5-(4-氟苯基)-5-羥基戊?；?-4-苯基-1,3-氧氮雜環(huán)戊烷-2-酮，如下式所述。
但是，現(xiàn)有的羰基還原酶催化法仍然存在以下不足：(1)目前游離羰基還原酶反應(yīng)結(jié)束后，需要采用活性炭等將羰基還原酶從反應(yīng)體系中吸附出來，一方面，會有少量羰基還原酶殘留在反應(yīng)液中，且在后續(xù)精餾過程中也很難去除，從而影響了產(chǎn)品的品質(zhì)；另一方面，活性炭在吸附羰基還原酶的同時也會吸附一部分(4s)-3-[(5s)-5-(4-氟苯基)-5-羥基戊?；?-4-苯基-1,3-氧氮雜環(huán)戊烷-2-酮，從而影響產(chǎn)品的收率，尤其是增加了后處理的復(fù)雜程度。(2)目前固定化羰基還原酶方法，有效需要用化學(xué)法固載在載體上，酶活力損失大；其次酶占固定化酶中比例低于5％，增加了反應(yīng)器體積，提高了投資成本。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：
本發(fā)明的目的是克服現(xiàn)有羰基還原酶還原(4s)-3-[5-(4-氟苯基)-1,5-二氧代戊基)-4-苯基-2-惡唑烷酮時羰基還原酶易殘留、需要用化學(xué)法固載在載體上，酶活力損失大等問題，提供一種酶法催化合成依折麥布中間體的方法，反應(yīng)條件溫和，反應(yīng)速度快，酶利用率高，酶易于和反應(yīng)體系分離，成本低，產(chǎn)物得率高，光學(xué)純度高，適合工業(yè)化生產(chǎn)。
本發(fā)明是通過以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)上述目的的，一種酶法催化合成依折麥布中間體的方法，所述依折麥布中間體為(4s)-3-[(5s)-5-(4-氟苯基)-5-羥基戊?；?-4-苯基-1,3-氧氮雜環(huán)戊烷-2-酮，包括如下步驟：
1)羰基還原酶的制備：所述羰基還原酶由菌株bacillusamyloliquefaciens發(fā)酵產(chǎn)生，發(fā)酵培養(yǎng)基為：葡萄糖30-50g，蛋白胨3-5g，酵母膏3-5g，檸檬酸0.5-1.5g，na2hpo4·12h2o3-5g，乙醇10-20ml，蒸餾水定容至1l得ph5.5-7.5的懸浮液，經(jīng)121℃滅菌15min得發(fā)酵培養(yǎng)基；然后接種進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)，培養(yǎng)時間24-48小時，發(fā)酵過程中轉(zhuǎn)速200-300轉(zhuǎn)/min，發(fā)酵結(jié)束后過濾掉固體，得到的濾液即為羰基還原酶；
2)將輔酶nadp加入1)產(chǎn)生的羰基還原酶中，并加入磷酸鹽緩沖液調(diào)節(jié)至ph為6.5-7.0得混合酶液；然后將混合酶液加入到一端用膜組件封住的管式反應(yīng)器中，再將管式反應(yīng)器另一端也用膜組件封??；
3)將底物(4s)-3-[5-(4-氟苯基)-1,5-二氧代戊基)-4-苯基-2-惡唑烷酮加入到溶劑中，溶劑中同時加入氫供體nadp和金屬離子，配置成一定濃度底物溶液，然后將底物溶液置于原料槽中；
4)用蠕動泵將原料槽中的底物溶液從管式反應(yīng)器底部加入，流經(jīng)管式反應(yīng)器的底物溶液從管式反應(yīng)器頂部循環(huán)回原料槽中，用高效液相色譜檢測底物轉(zhuǎn)化率，至底物轉(zhuǎn)化率高于99.5％終止循環(huán)，停止反應(yīng)；
具體地，步驟2)所述羰基還原酶濃度為1～50g/l，輔酶nadp濃度為0.2～20g/l；
具體地，步驟2)所述的管式反應(yīng)器的膜組件為聚乙烯管材，管式反應(yīng)器的主體材質(zhì)為不銹鋼管材，所述管式反應(yīng)器的管徑與管長比為1:5～1:20。
具體地，步驟2)所述的膜組件為pvc納濾材料。
具體地，步驟3)所述的溶劑為緩沖溶液與異丙醇混合溶液，比例為1:2～2:1，底物濃度為5～30g/l，緩沖溶液為磷酸鹽緩沖溶液或tris-hcl緩沖溶液，所述溶劑的ph為7.5～8.5。
具體地，步驟3)所述的氫供體nadp濃度為0.2～20g/l，金屬離子為mg2+或mn2+，濃度為0.1-1g/l。
具體地，步驟4)最終轉(zhuǎn)化率為99.5％-99.7％。
與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有如下優(yōu)點(diǎn)：
(1)本發(fā)明將羰基還原酶在管式反應(yīng)器中與底物反應(yīng)，使得酶在反應(yīng)體系充分和底物接觸，提高了反應(yīng)效率，用膜組件截留酶，使后續(xù)分離簡單。
(2)本發(fā)明轉(zhuǎn)化率高，可達(dá)99.5％-99.7％；沒有副反應(yīng)存在，制得的產(chǎn)物光學(xué)純度高。
(3)本發(fā)明反應(yīng)條件溫和，反應(yīng)速度快，成本低，操作穩(wěn)定性好，適合工業(yè)化生產(chǎn)。
本發(fā)明所述的nadp為煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸，nicotinamideadeninedinucleotidephosphate。
附圖說明
圖1為本發(fā)明酶法催化合成依折麥布中間體的工藝流程圖，其中1為管式反應(yīng)器，2為膜組件，3為蠕動泵，4為原料槽。
具體實(shí)施方式
為使本發(fā)明的目的、技術(shù)方案和優(yōu)點(diǎn)更加清楚明了，下面結(jié)合具體實(shí)施方式，對本發(fā)明進(jìn)一步詳細(xì)說明。應(yīng)該理解，這些描述只是示例性的，而并非要限制本發(fā)明的范圍。
實(shí)施例
羰基還原酶的制備：所述羰基還原酶由菌株bacillusamyloliquefaciens發(fā)酵產(chǎn)生，發(fā)酵培養(yǎng)基為：葡萄糖40g，蛋白胨4g，酵母膏4g，檸檬酸1.0g，na2hpo4·12h2o4g，乙醇10-20ml，蒸餾水定容至1l得ph5.5-7.5的懸浮液，經(jīng)121℃滅菌15min得發(fā)酵培養(yǎng)基；然后接種進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)，培養(yǎng)時間36小時，發(fā)酵過程中轉(zhuǎn)速200-300轉(zhuǎn)/min，發(fā)酵結(jié)束后過濾掉固體，得到的濾液即為羰基還原酶。
1)將羰基還原酶和nadp+溶于磷酸緩沖溶液中，配制200ml濃度為3mg/ml的羰基還原酶溶液，0.3mg/mlnadp+溶液。將200ml酶溶液加入到200ml管式反應(yīng)器中，兩端用膜組件，管式反應(yīng)器保溫在25℃；
2)將4g底物溶于200ml溶劑中(異丙醇：磷酸鹽緩沖溶液緩沖溶液＝1:2，溶劑ph＝8.0)，同時加入1mgmgcl2配成底物溶液，將底物溶液放置在原料槽里，并保溫在25℃；
3)開動蠕動泵，將底物溶液從原料槽中加入到管式反應(yīng)器中，流速為10ml/min，高效液相色譜檢測反應(yīng)進(jìn)程，循環(huán)反應(yīng)10h后轉(zhuǎn)化率達(dá)到99.8％，純度達(dá)到99.5％，收率93％；
實(shí)施例2-6與實(shí)施例1基本相同，不同之處如表1。
盡管已經(jīng)詳細(xì)描述了本發(fā)明的實(shí)施方式，但是應(yīng)該理解的是，在不偏離本發(fā)明的精神和范圍的情況下，可以對本發(fā)明的實(shí)施方式做出各種改變、替換和變更。