本發(fā)明涉及一種豬圓環(huán)病毒繁殖培養(yǎng)基及其應(yīng)用，屬于病毒繁殖
技術(shù)領(lǐng)域：
。
背景技術(shù)：
：豬圓環(huán)病毒屬于圓環(huán)病毒科圓環(huán)病毒屬，病毒粒子大小為14-25nm，平均直徑17nm，呈對(duì)稱的二十面體，無囊膜，基因組為單股環(huán)狀dna，由脫氧核糖核酸組成，沉降系數(shù)為52s，是目前發(fā)現(xiàn)的最小的動(dòng)物病毒。pcv對(duì)外界的抵抗力較強(qiáng)，在ph＝3的酸性環(huán)境中很長時(shí)間不被滅活。該病毒對(duì)氯仿不敏感，在56℃或70℃處理一段時(shí)間不被滅活。在高溫環(huán)境也能存活一段時(shí)間。不凝集牛、羊、豬、雞等多種動(dòng)物和人的紅細(xì)胞?，F(xiàn)已知pcv有兩個(gè)血清型，即pcv1和pcv2。pcv1為非致病性的病毒。pcv-1無致病性，1974年由德國學(xué)者tischer從多株連續(xù)傳代的pk-15細(xì)胞中最先發(fā)現(xiàn)，1982年證實(shí)該病毒來源于當(dāng)初制備pk-15細(xì)胞的豬腎組織。后來證實(shí)該病毒只是一種可以感染豬的常規(guī)病毒，不會(huì)對(duì)感染豬造成危害。pcv-2卻具有致病性，能引起豬表現(xiàn)多種臨床癥狀。pcv2及其相關(guān)的豬病，死亡率10％-30％不等，較嚴(yán)重的豬場在暴發(fā)本病時(shí)死淘率高達(dá)40％，給養(yǎng)豬業(yè)造成嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失。目前，本病尚無有效治療方法，要堅(jiān)持預(yù)防為主的方針，除了加強(qiáng)飼養(yǎng)管理和衛(wèi)生防疫措施，杜絕疫病的發(fā)生外，免疫接種圓環(huán)病毒疫苗是預(yù)防該病的最可靠措施。目前，圓環(huán)病毒滅活疫苗很多都需要通過細(xì)胞培養(yǎng)來進(jìn)行生產(chǎn)，在生產(chǎn)過程需要使用血清。在病毒繁殖過程中，病毒裂解細(xì)胞所產(chǎn)生的細(xì)胞碎片、細(xì)胞和培養(yǎng)基的蛋白質(zhì)、糖類、脂類及核酸等雜質(zhì)成分，以及細(xì)胞代謝副產(chǎn)物等，易使接種豬產(chǎn)生過敏，持續(xù)發(fā)熱等副作用。怎么樣減少疫苗副反應(yīng)，提高圓環(huán)病毒滅活疫苗的安全性是目前所有獸用疫苗關(guān)注的焦點(diǎn)問題。在生產(chǎn)過程中使用血清，由于血清成分復(fù)雜，多為白蛋白和免疫球蛋白其分子量相對(duì)較大，在很大程度上影響病毒與這些雜蛋白的分離。所以本發(fā)明了在pk-15細(xì)胞繁殖圓環(huán)病毒的基礎(chǔ)上進(jìn)一步進(jìn)行了研究。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：為了克服現(xiàn)有技術(shù)的不足，本發(fā)明的第一個(gè)目的在于提供一種豬圓環(huán)病毒繁殖培養(yǎng)基，該培養(yǎng)基使用氨基酸、脂肪酸、小肽等物質(zhì)等替代血清，有利于提高病毒與在繁殖過程中產(chǎn)生的雜蛋白分離度，提高圓環(huán)滅活疫苗的品質(zhì)。實(shí)現(xiàn)本發(fā)明的目的可以通過采取如下技術(shù)方案達(dá)到：一種豬圓環(huán)病毒繁殖培養(yǎng)基，包括按體積百分比計(jì)的以下成分：作為優(yōu)選，包括按體積百分比計(jì)的以下成分：作為優(yōu)選，肽類物質(zhì)溶液為明膠酶解物溶液，肽類物質(zhì)的分子量為10-500k，肽在溶液中的濃度為10-60mg/ml。再優(yōu)選地，肽類物質(zhì)的分子量為30-100k，肽在溶液中的濃度為20-30mg/ml。再優(yōu)選地，明膠酶解物溶液通過以下方法制備獲得：使用0.25％edta-胰酶溶液在溫度為37℃的條件下酶解明膠，酶解時(shí)間為24～95h；然后用超濾膜進(jìn)行過濾，得到明膠酶解物溶液。再優(yōu)選地，酶解明膠時(shí)，明膠與edta-胰酶溶液的質(zhì)量體積比為1:10。本發(fā)明的第二個(gè)目的在于提供一種上述培養(yǎng)基的應(yīng)用。實(shí)現(xiàn)本發(fā)明的目的可以通過采取如下技術(shù)方案達(dá)到：一種上述的豬圓環(huán)病毒繁殖培養(yǎng)基的應(yīng)用，將培養(yǎng)基應(yīng)用于豬圓環(huán)病毒的培養(yǎng)中。作為優(yōu)選，豬圓環(huán)病毒的培養(yǎng)包括以下步驟：1)將pk-15細(xì)胞經(jīng)傳代和培養(yǎng)，pk-15細(xì)胞達(dá)到病毒接種的細(xì)胞密度時(shí)，將病毒接種至pk-15細(xì)胞中，并用豬圓環(huán)病毒繁殖培養(yǎng)基替換傳代和培養(yǎng)pk-15細(xì)胞的培養(yǎng)基；2)病毒繁殖結(jié)束后，離心去除細(xì)胞碎片；3)采用超濾的方式去除小分子蛋白質(zhì)，收集被截流的濃縮液；4)使用分子篩層析方法分離豬圓環(huán)病毒，收集第一個(gè)蛋白質(zhì)峰，得到豬圓環(huán)病毒。作為優(yōu)選，步驟2)中，離心的速度為3000-8000rmp/min，離心時(shí)間為10-50min。作為優(yōu)選，步驟3)中，超濾的方式中超濾膜的孔徑為10-500k。本發(fā)明的豬圓環(huán)病毒繁殖培養(yǎng)基設(shè)計(jì)原理如下：豬圓環(huán)病毒在繁殖過程中需要各類營養(yǎng)物質(zhì)，例如氨基酸、多肽等，通常繁殖病毒是需要使用血清，由于血清中存在大量的高分子蛋白質(zhì)等，大大影響了病毒裂解細(xì)胞所產(chǎn)生的細(xì)胞碎片、細(xì)胞和培養(yǎng)基的蛋白質(zhì)、糖類、脂類及核酸等雜質(zhì)成分與病毒的分離，而殘留的雜質(zhì)易使接種豬產(chǎn)生過敏、持續(xù)發(fā)熱等副作用。因此本發(fā)明使用氨基酸、脂肪酸、小肽等物質(zhì)替代血清，通過研究得到培養(yǎng)基的新配方，培養(yǎng)基中不含血清，用于繁殖豬圓環(huán)病毒，再以超濾方式去除雜質(zhì)，有利于病毒繁殖與純化。相比現(xiàn)有技術(shù)，本發(fā)明的有益效果在于：1、本發(fā)明豬圓環(huán)病毒繁殖培養(yǎng)基使用氨基酸、脂肪酸、小肽等物質(zhì)等替代血清，有利于提高病毒與在繁殖過程中產(chǎn)生的雜蛋白分離度，提高圓環(huán)滅活疫苗的品質(zhì)；2、本發(fā)明豬圓環(huán)病毒繁殖培養(yǎng)基的應(yīng)用中提供了豬圓環(huán)病毒的培養(yǎng)方法，針對(duì)培養(yǎng)基的特性，以超濾的方式結(jié)合分子篩層析方法，可以去除病毒液中70％以上的蛋白質(zhì)。附圖說明圖1為實(shí)施例2的層析圖譜。具體實(shí)施方式下面，結(jié)合具體實(shí)施方式，對(duì)本發(fā)明做進(jìn)一步描述：一種豬圓環(huán)病毒繁殖培養(yǎng)基，包括按體積百分比計(jì)的以下成分：其中非必須要氨基酸采用gibco公司的產(chǎn)品，貨號(hào)為：11140050；脂肪酸采用gibco公司的產(chǎn)品，貨號(hào)為：11905031；維生素溶液采用gibco公司的產(chǎn)品，貨號(hào)為：11120052；其中，肽類物質(zhì)溶液為明膠酶解物溶液，肽類物質(zhì)的分子量為30-100k，肽在溶液中的濃度為20-30mg/ml；明膠酶解物溶液通過以下方法制備獲得：使用0.25％edta-胰酶溶液在溫度為37℃的條件下酶解明膠，明膠與edta-胰酶溶液的質(zhì)量體積比為1:10；酶解時(shí)間為24～95h；然后用超濾膜進(jìn)行過濾，得到明膠酶解物溶液。將培養(yǎng)基應(yīng)用于豬圓環(huán)病毒的培養(yǎng)中，包括以下步驟：1)將pk-15細(xì)胞經(jīng)傳代和培養(yǎng)，pk-15細(xì)胞達(dá)到病毒接種的細(xì)胞密度時(shí)，將病毒接種至pk-15細(xì)胞中，并用豬圓環(huán)病毒繁殖培養(yǎng)基替換傳代和培養(yǎng)pk-15細(xì)胞的培養(yǎng)基；其中培養(yǎng)pk-15細(xì)胞的培養(yǎng)基為含10％胎牛血清的dmem培養(yǎng)基；2)病毒繁殖結(jié)束后，離心去除細(xì)胞碎片，離心的速度為3000-8000rmp/min，離心時(shí)間為10-50min；3)采用超濾的方式去除小分子蛋白質(zhì)，超濾膜的孔徑為10-500k，收集被截流的濃縮液；4)使用分子篩層析方法分離豬圓環(huán)病毒，層析過程中，采用ge公司的g200層析填料，使用超純水洗脫，收集第一個(gè)蛋白質(zhì)峰，得到豬圓環(huán)病毒。檢測方法：通過tcid50法測定豬圓環(huán)病毒的滴度。實(shí)施例1：豬圓環(huán)病毒繁殖培養(yǎng)基的制備，并將其用于病毒培養(yǎng)：一、制備明膠酶解物溶液：使用0.25％edta-胰酶溶液在溫度為37℃的條件下酶解明膠，明膠與edta-胰酶溶液的質(zhì)量體積比為1:10；酶解時(shí)間為48h；然后用100k超濾膜進(jìn)行過濾，得到平均分子直徑為0.01μm的明膠酶解物溶液，肽在溶液中的濃度為12mg/ml，其中肽在溶液中的濃度用常規(guī)方法測定，包括考馬斯亮藍(lán)或微量法。二、將明膠酶解物溶液用于制備培養(yǎng)基：豬圓環(huán)病毒繁殖培養(yǎng)基，包括按體積百分比計(jì)的以下成分：以上物質(zhì)的來源如具體實(shí)施方式所述。三、采用豬圓環(huán)病毒繁殖培養(yǎng)基培養(yǎng)豬圓環(huán)病毒：包括以下步驟：1)將pk-15細(xì)胞經(jīng)傳代和培養(yǎng)，pk-15細(xì)胞達(dá)到病毒接種的細(xì)胞密度時(shí)，將病毒接種至pk-15細(xì)胞中，并用豬圓環(huán)病毒繁殖培養(yǎng)基替換傳代和培養(yǎng)pk-15細(xì)胞的培養(yǎng)基；其中培養(yǎng)pk-15細(xì)胞的培養(yǎng)基為含10％胎牛血清的dmem培養(yǎng)基；2)病毒繁殖結(jié)束后，離心去除細(xì)胞碎片，離心的速度為5000rmp/min，離心時(shí)間為30min；3)采用超濾的方式去除小分子蛋白質(zhì)，超濾膜的孔徑為100k，收集被截流的濃縮液；4)用傳統(tǒng)tcid50法測定圓環(huán)病毒的滴度，考馬斯亮藍(lán)或者微量法檢測接種前后的總蛋白量，結(jié)果如表格1所示：表格1實(shí)施例1豬圓環(huán)病毒的滴度及處理前后的總蛋白量實(shí)施例2：實(shí)施例2的特點(diǎn)在于：步驟三的4)：使用分子篩層析方法分離豬圓環(huán)病毒，層析過程中，采用ge公司的g200層析填料，使用超純水洗脫，層析圖譜如圖1所示，出現(xiàn)兩個(gè)峰值的線表示蛋白質(zhì)的變化情況，出現(xiàn)一個(gè)峰值的線表示溶液中電導(dǎo)(各種離子濃度)變化情況，收集第一個(gè)蛋白質(zhì)峰(如圖中箭頭所指)，得到豬圓環(huán)病毒。表格2實(shí)施例2豬圓環(huán)病毒的滴度及處理前后的總蛋白量從實(shí)施例1和2的數(shù)據(jù)可得，實(shí)施例2中采用分子篩層析方法分離豬圓環(huán)病毒，能夠更好地去除蛋白質(zhì)。實(shí)施例3-4：實(shí)施例3-4提供了豬圓環(huán)病毒繁殖培養(yǎng)基的制備，并將其用于病毒培養(yǎng)，其中明膠酶解物溶液、豬圓環(huán)病毒的培養(yǎng)方法與實(shí)施例2相同，實(shí)施例2-4的培養(yǎng)基參數(shù)如表格3所示：表格3實(shí)施例2-4的培養(yǎng)基成分參數(shù)成分實(shí)施例2實(shí)施例3實(shí)施例4dmem培養(yǎng)基(％)92.69694.1非必須要氨基酸(％)10.50.5脂肪酸(％)0.40.20.4維生素溶液(％)10.81.5明膠酶解物溶液(％)52.53.5對(duì)比例1-3對(duì)比例1-3分別采用含體積百分?jǐn)?shù)10％、5％和3％胎牛血清的dmem培養(yǎng)基作為病毒繁殖培養(yǎng)基，培養(yǎng)豬圓環(huán)病毒的方法和實(shí)施例2相同。使用tcid50法測定測定病毒滴度，如表格3所示：表格3病毒滴度結(jié)果對(duì)比例1對(duì)比例2對(duì)比例3實(shí)施例2實(shí)施例3實(shí)施例4tcid50/ml7.57.87.57.17.17.3結(jié)果表明：圓環(huán)病毒繁殖專用培養(yǎng)基比含有胎牛血清的培養(yǎng)基繁殖圓環(huán)病毒的滴度略低，而不同豬圓環(huán)病毒繁殖培養(yǎng)基繁殖圓環(huán)病毒的滴度相似，表現(xiàn)出培養(yǎng)基的穩(wěn)定性。對(duì)于本領(lǐng)域的技術(shù)人員來說，可根據(jù)以上描述的技術(shù)方案以及構(gòu)思，做出其它各種相應(yīng)的改變以及變形，而所有的這些改變以及變形都應(yīng)該屬于本發(fā)明權(quán)利要求的保護(hù)范圍之內(nèi)。當(dāng)前第1頁12