技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及植物有效成分的提取分離方法，特別是指一種利用超臨界二氧化碳萃取技術(shù)萃取葉子花中有效成分的方法。
背景技術(shù)：
：：葉子花(bougainvilleaspectabiliswilld.)為紫茉莉科葉子花屬植物，又名寶巾、簕杜鵑、三角梅、三角花、九重葛、毛寶巾。1799年法國植物學(xué)家柯馬森在巴西發(fā)現(xiàn)，19世紀(jì)從南美引種到歐洲，并從歐洲引至亞洲、非洲、澳大利亞、新西蘭和其他國家，1872年英國人馬偕博士將其引入中國臺(tái)灣，隨后逐漸引入大陸各省。由于葉子花苞片有千變?nèi)f化的顏色且花期長，具有極高的觀賞園藝價(jià)值，現(xiàn)成為深圳、廈門、惠州、珠海等市的市花。據(jù)《中華草本》、《昆明民間常用草藥》記載，葉子花的花可入藥，具有解毒清熱、調(diào)和氣血的功效，對治療婦女月經(jīng)不調(diào)，疽毒有一定的效果。西印度人和墨西哥人喜歡用葉子花茶治療咳嗽和糖尿病。目前，國內(nèi)對葉子花的研究主要集中在品種培育領(lǐng)域，而對其活性成分的研究相對較少。c.r.narayanan[1]從葉子花中分離出松醇，并證明其具有降低血糖的作用；專利cn104910240a[2]經(jīng)過復(fù)雜的分離純化工藝，從葉子花中分離三種三萜皂苷類化合物，并將該成分用于降血糖藥物的開發(fā)。徐夙俠[3]采用毛細(xì)電泳法檢測三角梅中類黃酮種類和含。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，三角梅中主要類黃酮苷元為槲皮素。據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，葉子花含有皂苷、植醇、黃酮苷、花色苷等活性成分。這些成分具有抗氧化、抗炎、美白等功效，可開發(fā)為化妝品的功效成分。對于葉子花功效成分提取分離技術(shù)的研究，國內(nèi)研究大多采用傳統(tǒng)的提取分離方法。徐鳳來[4]采用水汽蒸餾法提取四個(gè)品種三角梅花的揮發(fā)組分，并用gc-ms檢測出植醇、亞麻酸、亞油酸、角鯊烯等活性物質(zhì)。水汽蒸餾法設(shè)備簡易，但得率往往較低，且高溫易破壞活性成分。劉艷清[5]用40％乙醇提取葉子花中的總黃酮，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)顯示，長時(shí)間高溫提取對葉子花中的色素破壞較大。超臨界二氧化碳萃取法是一種綠色環(huán)保、高效、安全的提取分離方法。其可在近室溫條件下進(jìn)行萃取，且萃取過程與氧氣隔絕，故可有效保護(hù)熱敏性的活性成分；提取過程使用二氧化碳作為提取介質(zhì)，可不使用有機(jī)溶劑，故提取物可以做到無有機(jī)溶劑殘留；超臨界流體的溶解能力與其密度的關(guān)系密切，快速壓力可以快速改變其密度，進(jìn)而改變各種組分在超臨界流體的溶解度，可快速完成提取、分離，故生產(chǎn)效率很高。經(jīng)檢索，國內(nèi)外并無采用超臨界二氧化碳萃取法萃取葉子花功效成分的文獻(xiàn)或?qū)＠麍?bào)道。如發(fā)明人在研發(fā)本案時(shí)參考了如下文獻(xiàn)資料：[1]narayanancr,joshidd,mujumdaram,etal.pinitol-anewantidiabeticcompoundfromtheleavesofbougainvillea-spectabilis[j].currentscience,1987,56(3):139-141.[2]張玉梅,宋啟示,范青飛.光葉子花中三萜皂苷以其為活性成分的降血糖藥物及其制備方法和應(yīng)用:中國,cn104910240a[p].2015.7.[3]徐夙俠,林春松,黃青云,等.3個(gè)三角梅品種中類黃酮的毛細(xì)管電泳分析比較研究(英文)[j].植物研究,2010,30(6):718-724.[4]徐夙俠,黃青云,劉鴻洲,等.三角梅屬四個(gè)品種花揮發(fā)性組分的gc-ms分析[j].亞熱帶植物科學(xué),2010,39(1):1-4.[5]劉艷清,魯湘鄂,張廣.葉子花中總黃酮提取方法研究[j].中藥材,2007,30(3):353-355.上述文獻(xiàn)資料中均未有明確闡述采用超臨界二氧化碳萃取法萃取葉子花功效成分的內(nèi)容。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：：本發(fā)明的目的在于開發(fā)一種高效率、高選擇性的超臨界二氧化碳連續(xù)萃取葉子花活性成分的方法，其主要內(nèi)容如下：步驟1：將采集的葉子花的花陰干或50℃溫度烘干；將干燥的花粉碎，粒度大小控制在10～100目；將原料用少量濕潤劑濕潤，然后裝填至超臨界二氧化碳萃取設(shè)備的萃取釜中。步驟2：進(jìn)行靜態(tài)萃取，設(shè)定靜態(tài)萃取條件：萃取釜壓力8～60mpa，萃取溫度32℃～90℃，靜態(tài)萃取時(shí)間0～3hr。步驟3：進(jìn)行動(dòng)態(tài)萃取，設(shè)定動(dòng)態(tài)萃取條件：萃取釜壓力8～60mpa，萃取溫度32℃～90℃，分離釜ⅰ壓力為4～12mpa，溫度為32℃～90℃，分離釜ii壓力為2～12mpa，溫度為20℃～60℃，動(dòng)態(tài)萃取時(shí)間為1-3hr；從分離釜底部收集萃取物i。步驟4：進(jìn)行夾帶萃取，設(shè)定夾帶動(dòng)態(tài)萃取條件：萃取釜壓力15～50mpa，萃取溫度40℃～80℃；夾帶劑為50％-100％乙醇，夾帶劑使用量為原料質(zhì)量的10％-200％；分離釜ⅰ壓力為4～12mpa，溫度為32℃～90℃，分離釜ii壓力為2～12mpa，溫度為20℃～60℃；夾帶萃取時(shí)間為1-3hr；從分離釜底部收集萃取物ii。步驟5：從步驟3的分離釜收集的萃取物ⅰ，經(jīng)冷凍脫蠟后，可得到葉子花精油。步驟6：將步驟4的分離釜中收集得萃取物ii，經(jīng)減壓濃縮后，可得到葉子花提取物。進(jìn)一步，所述步驟1中，所用濕潤劑為無水乙醇、乙酸乙酯、正己烷、石油醚的一種或幾種組合，優(yōu)選無水乙醇，使用量優(yōu)選原料質(zhì)量的2％-5％。進(jìn)一步，所述步驟2中，靜態(tài)萃取的條件優(yōu)選為壓力20-40mpa，溫度45-60℃；也可不進(jìn)行靜態(tài)萃取。進(jìn)一步，所述步驟3中，萃取釜的壓力優(yōu)選20～30mpa，溫度優(yōu)選45～60℃；分離釜ⅰ壓力優(yōu)選為5～8mpa，溫度優(yōu)選50℃～60℃。所述步驟4中，萃取釜的壓力優(yōu)選15～25mpa，溫度優(yōu)選50～65℃；分離釜ⅰ壓力優(yōu)選為4～6mpa，溫度優(yōu)選40℃～50℃。進(jìn)一步，所述步驟4中，夾帶劑為乙醇溶液，優(yōu)選70％-95％乙醇；夾帶劑用量優(yōu)選為原料質(zhì)量的30％-60％。本發(fā)明采用超臨界二氧化碳連續(xù)萃取葉子花的活性成分，可同時(shí)提取分離葉子花的精油和黃酮苷提取物。所得精油氣味清新，可應(yīng)用開發(fā)護(hù)膚精油、抗過敏精油。所得提取物的黃酮含量很高，具有很強(qiáng)的抗氧化效果，可用于開發(fā)美白祛斑護(hù)膚品。整個(gè)生產(chǎn)工藝具有以下特點(diǎn)，二氧化碳可重復(fù)利用，萃取效率高、操作簡單等，可實(shí)現(xiàn)工業(yè)化生產(chǎn)。附圖說明：圖1為超臨界二氧化碳萃取設(shè)備示意圖；圖2為實(shí)施例四中提取物對dpph自由基抑制率表。圖1中：1-co2鋼瓶；2-凈化器；3-制冷機(jī)；4-co2高壓泵；5-加熱器；7-萃取釜??；10-萃取釜ii；13-分離釜??；16-分離釜ii；18-夾帶劑釜；19-夾帶劑泵；12-壓力調(diào)節(jié)閥；6、8、9、11、14、15、17、20-截止閥。具體實(shí)施方式：本發(fā)明揭示的一種超臨界二氧化碳萃取葉子花有效成分的方法，其實(shí)施需配合超臨界二氧化碳萃取設(shè)備方可實(shí)現(xiàn)。配合圖1所示，該方法的具體工藝為：先將采集的葉子花陰干或50℃以下溫度烘干；將干燥的葉子花粉碎，大小控制在10～100目；將粉碎的葉子花用0％-5％原料質(zhì)量的無水乙醇濕潤，裝填至萃取釜ⅰ7和萃取釜ii10中；在夾帶劑釜18中補(bǔ)充濃度為50％～100％的乙醇；打開co2鋼瓶1的閥門，使二氧化碳從co2鋼瓶1中出來，經(jīng)過凈化器2過濾除去二氧化碳中的雜質(zhì)，經(jīng)過制冷機(jī)3，將溫度下降到0℃以下確保二氧化碳為液態(tài)；先對萃取釜ⅰ7進(jìn)行萃取，開啟閥門6關(guān)閉閥門8、9、11，co2高壓泵4將液體二氧化碳泵入萃取釜ⅰ7，此時(shí)經(jīng)過加熱器5，使二氧化碳流體的溫度達(dá)到設(shè)定溫度(32～80℃)，待二氧化碳流體的壓力達(dá)到設(shè)定壓力(15～60mpa)時(shí)，關(guān)閉閥門6，靜態(tài)萃取0～3hr；靜態(tài)萃取結(jié)束后，進(jìn)行動(dòng)態(tài)萃取，開啟閥門8，調(diào)節(jié)閥門12，確保萃取釜ⅰ7的壓力為設(shè)定壓力(15～60mpa)，調(diào)節(jié)閥門15，設(shè)定分離釜ⅰ13的壓力為5～12mpa，溫度為32～90℃，分離釜ii16壓力為5～6mpa，分離釜ii16溫度為20～70℃，調(diào)整co2高壓泵4的頻率，控制總流量在10l/min左右；動(dòng)態(tài)萃取完成后，緩慢打開閥門14和17，收集葉子花精油粗品。進(jìn)行夾帶萃取，開啟閥門20，將夾帶劑釜18中的夾帶劑經(jīng)夾帶劑泵19泵入萃取釜ⅰ7，在co2的萃取分離作用下，葉子花中的有效成分隨二氧化碳流體一起進(jìn)入分離釜ⅰ13和分離釜ii15中，并將溶解其中的成分解析出來，通過閥門14和17進(jìn)行收集，而二氧化碳則進(jìn)入凈化器2、冷卻機(jī)3，被重新液化回收利用。待萃取釜ⅰ7萃取完成后，將萃取釜ⅰ7中的二氧化碳導(dǎo)入到萃取釜ii10中，對萃取釜ii10進(jìn)行萃取，而萃取釜ⅰ7則可以進(jìn)行原料更換，待萃取釜ii10萃取完成后，將萃取釜ii10中的二氧化碳再導(dǎo)入到萃取釜ⅰ7中，這樣可實(shí)現(xiàn)連續(xù)萃取，縮短生產(chǎn)周期，節(jié)約二氧化碳，提高生產(chǎn)效率。下面的實(shí)施例對本發(fā)明的方法作詳細(xì)描述，但不意味著限制本發(fā)明的范圍。實(shí)施案例1：將干燥、粉碎至10目左右的葉子花粉末2kg，用50ml乙酸乙酯濕潤，放入萃取釜ⅰ7、萃取釜ii10中。設(shè)定萃取壓力為30mpa，萃取溫度為50℃，分離釜ⅰ13溫度為45℃、壓力為8mpa，分離釜ii16壓力為5mpa。先靜態(tài)萃取1小時(shí)，再動(dòng)態(tài)萃取1小時(shí)，收集葉子花精油粗品；以濃度為85％乙醇為夾帶劑，進(jìn)行夾帶萃取，動(dòng)態(tài)萃取時(shí)間為2h，80％乙醇用量為1000ml，收集提取液。經(jīng)濃縮、精制后，分別得到葉子花精油33g、葉子花提取物350g。實(shí)施案例2：將干燥、粉碎至10目左右的葉子花粉末1kg，用30ml無水乙醇濕潤，放入萃取釜ⅰ7、萃取釜ii10中。設(shè)定萃取壓力為35mpa，萃取溫度為45℃，分離釜ⅰ13溫度為50℃、壓力為8mpa，分離釜ii16壓力為5mpa。直接進(jìn)行動(dòng)態(tài)萃取，萃取時(shí)間為1小時(shí)，收集葉子花精油；以濃度為75％乙醇為夾帶劑，進(jìn)行夾帶萃取，萃取時(shí)間為2h，75％乙醇用量為600ml，收集提取液。經(jīng)精制、濃縮后，分別得到葉子花精油17g、葉子花提取物190g。實(shí)施案例3：通過設(shè)計(jì)對比實(shí)驗(yàn)，比較水汽蒸餾法、醇提法和本發(fā)明提取法的提取效率。(1)水汽蒸餾法[4](參考文獻(xiàn)中的方法)取200g葉子花，加入800ml純水，組織搗碎5min，并轉(zhuǎn)移至2000ml的燒瓶內(nèi)，加熱蒸餾1hr，收集到500ml冷凝液。冷凝液經(jīng)50ml乙醚萃取、無水硫酸鈉干燥、40℃水浴濃縮，最后得到0.60g葉子花精油粗品(減重法測定)。對采用水汽蒸餾法和本發(fā)明的提取方法所得的精油品質(zhì)作簡單的感官測評，其結(jié)果如表1所示。采用本發(fā)明的提取方法，葉子花精油得油率為1.7％，顯著高于水汽蒸餾法的0.3％。表1不同提取方法所得葉子花精油的得率和品質(zhì)提取方法得油率品質(zhì)(感官評價(jià))本發(fā)明的提取方法1.7％淡黃綠色，有特異香味水汽蒸餾0.3％淡黃色，有特異香味，但夾雜酸味。(2)醇提法[5](參考文獻(xiàn)的提取方法)提取條件為提取溶劑為40％乙醇，料液比為60:1，提取時(shí)間為3hr，提取溫度為90℃；提取完成后，過濾得到提取液，將提取液經(jīng)60℃水浴條件下真空濃縮。100.00g葉子花經(jīng)提取濃縮后得提取物19.11g，即得率為19.1％，這與實(shí)施案例1、2采用本發(fā)明的提取方法的提取率17.5％、19.0％差別不大。但傳統(tǒng)醇提法需使用大量的乙醇，每處理1kg葉子花，需使用60kg40％乙醇作溶劑，乙醇消耗量為2.4kg(乙醇回收率按90％計(jì)算)，且操作過程發(fā)現(xiàn)其過濾困難。而采用本發(fā)明的提取方法每處理1kg葉子花只消耗0.05kg乙醇。表2不同提取方法的提取率及優(yōu)缺點(diǎn)實(shí)施案例4：對醇提法和本發(fā)明的提取方法所得提取物進(jìn)行總黃酮含量測定和抗氧化活性測定?？傸S酮含測定參照《ny/t1295-2007蕎麥及其制品中總黃酮含量的測定》；抗氧化活性分別采用dpph自由基清除法和鄰苯三酚自氧化法測定。表3不同提取方法所得葉子花提取物抗氧化活性差別表3為兩種提取方法所得提取物的總黃酮含量測定結(jié)果及抗氧化活性。采用本發(fā)明的提取方法所得提取物中總黃酮含量高達(dá)59.3％，為醇提法的2.3倍。這說明本發(fā)明的提取方法對葉子花的黃酮類化合物的提取具有很高的選擇性。圖2為兩種提取方法所得提取物的抑制dpph自由基的活性。本發(fā)明及傳統(tǒng)醇提法所得提取物對自由基半抑制率(ic50)濃度分別為0.031mg/ml和0.066mg/ml，即本發(fā)明所得的葉子花提取物對dpph自由基的抑制能力比傳統(tǒng)醇提法所得提取物高1倍。表4為兩種提取方法所得提取物的清除超氧陰離子能力，本發(fā)明和傳統(tǒng)醇提法所得葉子花提取物對超氧陰離子半抑制率濃度(ic50)分別為0.18mg/ml和0.91mg/ml，即本發(fā)明所得提取物對超氧陰離子的抑制率比傳統(tǒng)醇提法的高5倍。這說明本發(fā)明的提取方法能有效的保持葉子花活性成分。表4提取物對超氧陰離子的抑制率從以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果得出，與傳統(tǒng)醇提法相比，超臨界二氧化碳萃取法對葉子花有效成分的選擇性萃取和對葉子花活性成分的保持具有明顯的優(yōu)勢。上述說明示出并描述了本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施例，如前所述，應(yīng)當(dāng)理解本發(fā)明并非局限于本文所披露的形式，不應(yīng)看作是對其他實(shí)施例的排除，而可用于各種其他組合、修改和環(huán)境，并能夠在本文所述發(fā)明構(gòu)想范圍內(nèi)，通過上述教導(dǎo)或相關(guān)領(lǐng)域的技術(shù)或知識(shí)進(jìn)行改動(dòng)。而本領(lǐng)域人員所進(jìn)行的改動(dòng)和變化不脫離本發(fā)明的精神和范圍，則都應(yīng)在本發(fā)明所附權(quán)利要求的保護(hù)范圍內(nèi)。當(dāng)前第1頁12