本發(fā)明屬于真菌培養(yǎng)
技術領域：
，具體涉及一種促進冬蟲夏草芽孢發(fā)育成菌絲的方法。
背景技術：
：冬蟲夏草Ophiocordycepssinensis是我國一種傳統(tǒng)的名貴中藥材，是一種昆蟲與真菌的結(jié)合體。蟲是蟲草蝙蝠蛾的幼蟲，菌是冬蟲夏草真菌。冬蟲夏草的形成是由夏天冬蟲夏草真菌感染蝠蛾幼蟲，菌絲吸取幼蟲體內(nèi)的營養(yǎng)并逐漸充滿蟲體，直至第二年春夏從蟲體頭部長出形成子實體。由于近年人工采挖活動的增多，野生冬蟲夏草數(shù)量驟減，產(chǎn)地植被遭受到了巨大的破壞?，F(xiàn)今人工冬蟲夏草已經(jīng)可以成功培育，但產(chǎn)量不高。其中一個制約因素是：在蝠蛾幼蟲感染冬蟲夏草真菌后，真菌在蝠蛾幼蟲體內(nèi)以芽生孢子(芽孢)形式存在，并以芽孢萌發(fā)產(chǎn)生新的芽孢的方式進行繁殖。所謂的芽孢，是指冬蟲夏草在侵染寄主幼蟲后，在幼蟲體內(nèi)形成大量類似孢子的長梭形細胞。自然情況下，芽孢萌發(fā)成菌絲的過程會歷經(jīng)很長時間，一般需要10天左右。而幼蟲體內(nèi)芽孢發(fā)育成菌絲是幼蟲產(chǎn)生子實體原基(產(chǎn)生并分化為子實體的菌絲結(jié)構)的必經(jīng)環(huán)節(jié)，因此，縮短這一環(huán)節(jié)的時間至關重要。技術實現(xiàn)要素：本發(fā)明要解決的技術問題為：現(xiàn)有冬蟲夏草芽孢萌發(fā)成菌絲的時間長，人工培育冬蟲夏草周期長,效率低的問題。本發(fā)明解決上述技術問題的技術方案為：提供一種促進冬蟲夏草芽孢發(fā)育成菌絲的方法。該方法包括以下步驟：a、芽孢的培養(yǎng)與純化取含有冬蟲夏草芽孢的菌液，接種于液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)3～5天，濾網(wǎng)過濾，得到芽孢培養(yǎng)液；所述菌液與液體培養(yǎng)的體積比為0.1～1﹕5～20；b、芽孢的誘導將步驟a所得的芽孢培養(yǎng)液接種于液體培養(yǎng)基中，加入植物激素后培養(yǎng)1～2天，得到萌發(fā)的菌絲；所述芽孢培養(yǎng)液與液體培養(yǎng)基的體積比為0.3～1﹕10～30。其中，上述促進冬蟲夏草芽孢發(fā)育成菌絲的方法中，步驟a中所述的菌液中冬蟲夏草真菌含量不小于103個/ml。其中，上述促進冬蟲夏草芽孢發(fā)育成菌絲的方法中，步驟a中所述濾網(wǎng)為100～1000目的濾網(wǎng)。其中，上述促進冬蟲夏草芽孢發(fā)育成菌絲的方法中，步驟a、b中所述的液體培養(yǎng)基組成為：每升液體培養(yǎng)基中含葡萄糖5～30g,酵母粉5～20g,蛋白胨4～20g,磷酸二氫鉀0.25～5g,硫酸鎂0.25～5g,余量為水。優(yōu)選的，上述促進冬蟲夏草芽孢發(fā)育成菌絲的方法中，步驟a、b中所述的液體培養(yǎng)基組成為：每升液體培養(yǎng)基中含葡萄糖30g,酵母粉10g,蛋白胨5g,磷酸二氫鉀1g,硫酸鎂0.5g,余量為水。其中，上述促進冬蟲夏草芽孢發(fā)育成菌絲的方法中，步驟a、b中所述的培養(yǎng)溫度為10～25℃，培養(yǎng)時置于50～200rpm轉(zhuǎn)速的搖床中。其中，上述促進冬蟲夏草芽孢發(fā)育成菌絲的方法中，步驟b中所述的植物激素為環(huán)腺苷酸或吲哚乙酸。優(yōu)選的，上述促進冬蟲夏草芽孢發(fā)育成菌絲的方法中，步驟b中所述環(huán)腺苷酸加入后的終濃度為5～40ppm，所述吲哚乙酸加入后的終濃度為5～20ppm。本發(fā)明的有益效果為：本發(fā)明提供了一種冬蟲夏草芽孢的體外誘導萌發(fā)方法，該方法通過選擇適宜的培養(yǎng)基，添加環(huán)腺苷酸或吲哚乙酸對冬蟲夏草芽孢進行誘導，能使芽孢48h內(nèi)即可萌發(fā)成菌絲，縮短了芽孢萌發(fā)時間，從而為縮短人工培育冬蟲夏草時間提供了相應的技術指導，具有重要的經(jīng)濟效益。附圖說明圖1所示為用10ppm吲哚乙酸處理冬蟲夏草芽孢，48h后得到的電鏡圖；圖2所示為用10ppm環(huán)腺苷酸處理冬蟲夏草芽孢，48h后得到的電鏡圖；圖3所示為用10ppm無菌水處理冬蟲夏草芽孢，48h后得到的電鏡圖；圖4所示為冬蟲夏草芽孢在蝠蛾體內(nèi)10天后，得到的電鏡圖。具體實施方式本發(fā)明提供一種促進冬蟲夏草芽孢發(fā)育成菌絲的方法，包括以下步驟：a、芽孢的培養(yǎng)與純化取含有冬蟲夏草芽孢的菌液，接種于液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)3～5天，濾網(wǎng)過濾，得到芽孢培養(yǎng)液；所述菌液與液體培養(yǎng)的體積比為0.1～1﹕5～20；b、芽孢的誘導將步驟a所得的芽孢培養(yǎng)液接種于液體培養(yǎng)基中，加入植物激素后培養(yǎng)1～2天，得到萌發(fā)的菌絲；所述芽孢培養(yǎng)液與液體培養(yǎng)基的體積比為0.3～1﹕10～30。其中，上述促進冬蟲夏草芽孢發(fā)育成菌絲的方法中，步驟a中所述的菌液中冬蟲夏草真菌含量不小于103個/ml。其中，上述促進冬蟲夏草芽孢發(fā)育成菌絲的方法中，步驟a、b中所述的液體培養(yǎng)基組成為：每升液體培養(yǎng)基中含葡萄糖5～30g,酵母粉5～20g,蛋白胨4～20g,磷酸二氫鉀0.25～5g,硫酸鎂0.25～5g,余量為水。優(yōu)選的，上述促進冬蟲夏草芽孢發(fā)育成菌絲的方法中，步驟a、b中所述的液體培養(yǎng)基組成為：每升液體培養(yǎng)基中含葡萄糖30g,酵母粉10g,蛋白胨5g,磷酸二氫鉀1g,硫酸鎂0.5g,余量為水。其中，上述促進冬蟲夏草芽孢發(fā)育成菌絲的方法中，步驟a中所述濾網(wǎng)為100～1000目的濾網(wǎng)。其中，上述促進冬蟲夏草芽孢發(fā)育成菌絲的方法中，步驟a、b中所述的培養(yǎng)溫度為10～25℃，培養(yǎng)時置于50～200rpm轉(zhuǎn)速的搖床中。其中，上述促進冬蟲夏草芽孢發(fā)育成菌絲的方法中，步驟b中所述的植物激素為環(huán)腺苷酸或吲哚乙酸。優(yōu)選的，上述促進冬蟲夏草芽孢發(fā)育成菌絲的方法中，步驟b中所述環(huán)腺苷酸加入后的終濃度為5～40ppm，所述吲哚乙酸加入后的終濃度為5～20ppm。本發(fā)明主要采用吲哚乙酸或環(huán)腺苷酸促進冬蟲夏草芽孢發(fā)育成菌絲，吲哚乙酸是一種植物體內(nèi)普遍存在的內(nèi)源生長素，具有促進植物莖葉生長、生根及細胞分化等作用；環(huán)腺苷酸是一種具有細胞內(nèi)信息傳遞作用的小分子，又被稱為細胞內(nèi)信使和第二信使，具有調(diào)節(jié)細胞代謝的作用。但現(xiàn)有技術中未見有將吲哚乙酸和環(huán)腺苷酸用在冬蟲夏草芽孢發(fā)育上的報道。本發(fā)明發(fā)明人在長期實踐中，篩選出玉米素，環(huán)腺苷酸，吲哚乙酸，激動素四種植物激素，分別用于誘導冬蟲夏草芽孢。所述玉米素為一種白色粉末，是一種天然的植物分裂素；激動素又稱6-糖基氨基嘌呤，是一種人工合成的植物激素，呈白色結(jié)晶型粉末，不溶于水。發(fā)明人試驗時，將激動素和玉米素溶于乙酸、環(huán)腺苷酸溶于水、吲哚乙酸溶于乙醇，分別配制成1g/L的植物激素母液。具體的實驗操作過程如下：a、芽孢的培養(yǎng)與純化取含有冬蟲夏草芽孢的菌液1ml，接種于液體培養(yǎng)基20ml中，于15℃，100rpm轉(zhuǎn)速下培養(yǎng)5天，用500目濾網(wǎng)過濾菌液，收集純化芽孢培養(yǎng)液；b、芽孢的誘導取步驟a所得的純化芽孢培養(yǎng)液，接種于20ml液體培養(yǎng)基中，加入植物激素母液，于15℃，100rpm轉(zhuǎn)速下培養(yǎng)2天后觀察菌絲；所述的液體培養(yǎng)基的組成為：葡萄糖30g/L、酵母粉10g/L、蛋白胨5g/L、磷酸二氫鉀1g/L、硫酸鎂0.5g/L。篩選實驗結(jié)果見下表1。表1用不同的植物激素處理冬蟲夏草芽孢的結(jié)果5ppm10ppm20ppm40ppm玉米素----環(huán)腺苷酸++++++++吲哚乙酸++++++-激動素----表1中：“-”表示在放大10×10倍的顯微鏡視野下沒有萌發(fā)的菌絲；“+”表示在放大10×10倍的顯微鏡視野下有1～5根萌發(fā)的菌絲；“++”表示在放大10×10倍的顯微鏡視野下有5～10根萌發(fā)的菌絲，部分菌絲有分叉結(jié)構出現(xiàn)；“+++”表示在放大10×10倍的顯微鏡視野下有10根以上萌發(fā)的菌絲，并有菌絲團出現(xiàn)。下面通過實施例對本發(fā)明的具體實施方式做進一步的解釋說明，但不表示將本發(fā)明的保護范圍限制在實施例所述范圍內(nèi)。實施例1用本發(fā)明方法促進冬蟲夏草芽孢發(fā)育成菌絲具體操作過程如下：a、芽孢的培養(yǎng)與純化取含有冬蟲夏草真菌含量不小于103個/ml的菌液0.5ml，接種于15ml液體培養(yǎng)基中，于15℃，100rpm轉(zhuǎn)速下培養(yǎng)3天，用100目的濾網(wǎng)過濾，得到芽孢培養(yǎng)液；每升液體培養(yǎng)基中含葡萄糖30g,酵母粉20g,蛋白胨20g,磷酸二氫鉀5g,硫酸鎂5g,余量為水；b、芽孢的誘導將步驟a所得的芽孢培養(yǎng)液接種于液體培養(yǎng)基中，加入吲哚乙酸，使吲哚乙酸的終濃度為10ppm，于15℃，100rpm轉(zhuǎn)速下培養(yǎng)48h后，置于電鏡中觀察，得到電鏡圖1。實施例2用本發(fā)明方法促進冬蟲夏草芽孢發(fā)育成菌絲具體操作過程如下：a、芽孢的培養(yǎng)與純化取含有冬蟲夏草真菌含量不小于103個/ml的菌液0.5ml，接種于15ml液體培養(yǎng)基中，于25℃，200rpm轉(zhuǎn)速下培養(yǎng)5天，用1000目的濾網(wǎng)過濾，得到芽孢培養(yǎng)液；每升液體培養(yǎng)基中含葡萄糖30g,酵母粉10g,蛋白胨5g,磷酸二氫鉀1g,硫酸鎂0.5g,余量為水；b、芽孢的誘導將步驟a所得的芽孢培養(yǎng)液接種于液體培養(yǎng)基中，加入環(huán)腺苷酸，使環(huán)腺苷酸的終濃度為10ppm，于25℃，200rpm轉(zhuǎn)速下培養(yǎng)48h后，置于電鏡中觀察，得到電鏡圖2。對比例1用無菌水處理冬蟲夏草芽孢具體操作過程如下：a、芽孢的培養(yǎng)與純化取含有冬蟲夏草真菌含量不小于103個/ml的菌液0.5ml，接種于15ml液體培養(yǎng)基中，于25℃，200rpm轉(zhuǎn)速下培養(yǎng)5天，用1000目的濾網(wǎng)過濾，得到芽孢培養(yǎng)液；每升液體培養(yǎng)基中含葡萄糖30g,酵母粉10g,蛋白胨5g,磷酸二氫鉀1g,硫酸鎂0.5g,余量為水；b、芽孢的誘導將步驟a所得的芽孢培養(yǎng)液接種于液體培養(yǎng)基中，加入無菌水，無菌水加入量同實施例2，于25℃，50～200rpm轉(zhuǎn)速下培養(yǎng)48h后，置于電鏡中觀察，得到電鏡圖3。對比例2自然狀態(tài)下冬蟲夏草芽孢發(fā)育成菌絲另一部分未從蝠蛾體內(nèi)取出的冬蟲夏草芽孢，繼續(xù)在蝠蛾體內(nèi)培育10天后，開始出現(xiàn)萌發(fā)，得到電鏡圖4。由實施例和對比例可知，體外液體培養(yǎng)冬蟲夏草芽孢，可促進芽孢萌發(fā)，減少萌發(fā)時間，尤其是采用吲哚乙酸或環(huán)腺苷酸誘導后，冬蟲夏草芽孢的萌發(fā)時間可縮短至48h以內(nèi)，有效的減少了冬蟲夏草芽孢萌發(fā)成菌絲的時間，為縮短人工培育冬蟲夏草的時間提供了技術支持。當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