本發(fā)明屬于一種提取方法，具體為一種采用雙水相萃取發(fā)酵液中酮戊二酸的方法。

背景技術(shù)：

α-酮戊二酸是一種重要的有機(jī)酸，在微生物細(xì)胞的代謝中起著重要的作用,也是合成多種氨基酸、蛋白質(zhì)的重要前體物質(zhì)，在食品、醫(yī)藥、化工和化妝品行業(yè)有廣泛的應(yīng)用。由于化學(xué)法合成α-酮戊二酸過程中存在嚴(yán)重的安全問題,無法直接用于食品和化妝品中。因此，基于發(fā)酵法生產(chǎn)α-酮戊二酸在食品和保健品行業(yè)具有廣闊的應(yīng)用前景。發(fā)酵法生產(chǎn)α-酮戊二酸的研究最早始于1946年,當(dāng)時(shí)lockwood和stodola對(duì)利用細(xì)菌生物合成α-酮戊二酸進(jìn)行了初步的研究，之后asai等人發(fā)現(xiàn)假單胞菌屬、產(chǎn)氣桿菌和粘質(zhì)沙雷氏菌可以過量合成α-酮戊二酸。

近年來，江南大學(xué)的陳堅(jiān)教授及其課題組成員對(duì)發(fā)酵法生產(chǎn)α-酮戊二酸技術(shù)進(jìn)行大量的深入研究，cn200710302441.7公開了一種α-酮戊二酸高產(chǎn)菌及其篩選方法和用該菌株發(fā)酵法生產(chǎn)α-酮戊二酸的技術(shù)，發(fā)酵6h時(shí)α-酮戊二酸產(chǎn)量可達(dá)39.3g/l。

雖然酮戊二酸的生產(chǎn)方法報(bào)道比較多，但酮戊二酸的提取方法目前報(bào)道很少，只有少量的文獻(xiàn)報(bào)道了，占宏德等人用離子交換法純化酮戊二酸，該方法可以純化酮戊二酸，工藝較復(fù)雜，這種方法收率不高，并存在一定的酮戊二酸損失，同時(shí)該方法主要依靠樹脂的吸附進(jìn)行分離因而生產(chǎn)能力有限，同時(shí)當(dāng)樹脂吸附使用一段時(shí)間后要用酸或者堿進(jìn)行脫吸，必然會(huì)產(chǎn)生廢酸或廢堿，給環(huán)境帶來影響。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明正是針對(duì)以上技術(shù)問題，提供一種采用雙水相萃取發(fā)酵液中酮戊二酸的方法。該方法可以解決工藝過程比較復(fù)雜，收率不高，酮戊二酸在提取純化過程中損失，對(duì)于大規(guī)模的生產(chǎn)而言解決生產(chǎn)能力有限的問題，還可以解決酮戊二酸在提取純化過程中廢液的處理問題。

為了解決以上技術(shù)問題，本發(fā)明的具體技術(shù)方案如下：

一種采用雙水相萃取發(fā)酵液中酮戊二酸的方法，該方法包括以下步驟：

1）將酮戊二酸發(fā)酵液過濾，得濾液ⅰ，取100ml濾液ⅰ加入到已配置好的20～40wt%的乙醇與5～20wt%的硫酸銨的雙水相溶液中，有固體沉淀產(chǎn)生，將固體沉淀過濾，得濾液ⅱ，備用；

2）將步驟1）中所得濾液ⅱ在常溫下靜置5分鐘分層，分液去除下層液體，只留取上層液體，將上層液體減壓蒸餾，蒸干所有的乙醇和水分，得琥珀色固體；

3）將琥珀色固體用乙醚進(jìn)行洗滌，洗滌液進(jìn)行蒸餾，將乙醚蒸干后所得液體為丙酮酸；

4）將步驟3）中用乙醚洗滌后的固體用無水乙醇進(jìn)行溶解，過濾，得濾液ⅲ，將濾液ⅲ進(jìn)行蒸餾，蒸干乙醇后，所得固體為酮戊二酸。

步驟1）中乙醇與硫酸銨的雙水相溶液可以為乙醇-磷酸氫二鉀與水組成的雙水相溶液，或異丙醇-硫酸銨與水組成的雙水相溶液，或異丙醇-磷酸氫二鉀與水組成的雙水相溶液，或丙酮-硫酸銨與水組成的雙水相溶液，或丙酮-磷酸氫二鉀與水組成的雙水相溶液，或聚乙二醇-硫酸銨與水組成的雙水相溶液，或聚乙二醇-磷酸氫二鉀與水組成的雙水相溶液。

本發(fā)明利用雙水相萃取技術(shù)對(duì)發(fā)酵液進(jìn)行提取，雙水相萃取技術(shù)是指當(dāng)能與水互溶的普通有機(jī)溶劑，如乙醇、異丙醇、丙酮和聚乙二醇，加入到某些電解質(zhì)水溶液中，利用鹽離子的水化作用，使鹽離子奪取原先與有機(jī)溶劑結(jié)合的水分子而釋放出有機(jī)溶劑分子，可以形成有機(jī)溶劑/無機(jī)鹽雙水相體系，利用酮戊二酸在兩相中不同分配實(shí)現(xiàn)分離。

本發(fā)明的積極效果體現(xiàn)在：

（一）、本申請(qǐng)采用雙水相進(jìn)行萃取發(fā)酵液中酮戊二酸，由于兩相間的界面張力小，因此兩相易分散,而且它比一般的有機(jī)萃取兩相體系界面張力低的多,這樣有利于強(qiáng)化相際間的物質(zhì)傳遞。

(二)、操作條件溫和,由于雙水相的界面張力大大低于有機(jī)溶劑與水相之間的界面張力,分相時(shí)間短,傳質(zhì)過程和平衡過程速度均很快,因此能耗較低,而且可以實(shí)現(xiàn)快速的分離，有較大的生產(chǎn)能力，而且整個(gè)操作過程可以在常溫常壓下進(jìn)行。

(三)、雙水相體系中的傳質(zhì)和平衡速度快,同屋二酸都能進(jìn)入有機(jī)相中，因此酮戊二酸損失少，收率高。

(四)、操作簡單，大量雜質(zhì)能夠與所有固體物質(zhì)一起去掉,簡化分離步驟使工藝過程簡化,使整個(gè)分離過程更經(jīng)濟(jì)。同時(shí)本方法還可以回收發(fā)酵液中的丙酮酸。

具體實(shí)施方式

為了使本發(fā)明的目的、技術(shù)方案及優(yōu)點(diǎn)更加清楚明白，下面結(jié)合具體實(shí)施方式對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步的詳細(xì)描述，但不應(yīng)將此理解為本發(fā)明上述主題的范圍僅限于下述實(shí)施例。

本申請(qǐng)中的%，如無特殊說明，均表示其質(zhì)量百分含量濃度。

實(shí)施例1：

1）將酮戊二酸發(fā)酵液過濾，得濾液ⅰ，取100ml濾液ⅰ加入到已配置好的質(zhì)量百分濃度為20%的乙醇與質(zhì)量百分濃度5%的硫酸銨的雙水相溶液中，有固體沉淀產(chǎn)生，將固體沉淀過濾，得濾液ⅱ，備用；

2）將第一步所得濾液ⅱ在室溫下靜置5分鐘分層，分液去除下層液體，只留取上層液體，將上層液體減壓蒸餾，蒸干所有的乙醇和水分，得琥珀色固體；

3）將琥珀色固體用乙醚進(jìn)行洗滌，洗滌液進(jìn)行蒸餾，將乙醚蒸干后所得液體為丙酮酸；

4）將步驟3）中乙醚洗滌后的固體用無水乙醇進(jìn)行溶解，過濾，得濾液ⅲ，將濾液ⅲ進(jìn)行蒸餾，蒸干乙醇后，所得固體為酮戊二酸。酮戊二酸收率為75.6%。

實(shí)施例2：

1）將酮戊二酸發(fā)酵液過濾，得濾液ⅰ，取100ml濾液ⅰ加入到已配置好的20%的乙醇與10%的硫酸銨的雙水相溶液中，有固體沉淀產(chǎn)生，將固體沉淀過濾，得濾液ⅱ，備用；

2）將第一步所得濾液ⅱ在室溫下靜置5分鐘分層，分液去除下層液體，只留取上層液體，將上層液體減壓蒸餾，蒸干所有的乙醇和水分，得琥珀色固體；

3）將琥珀色固體用乙醚進(jìn)行洗滌，洗滌液進(jìn)行蒸餾，將乙醚蒸干后所得液體為丙酮酸；

4）將步驟3）中乙醚洗滌后的固體用無水乙醇進(jìn)行溶解，過濾，得濾液ⅲ，將濾液ⅲ進(jìn)行蒸餾，蒸干乙醇后，所得固體為酮戊二酸。酮戊二酸收率為82.8%。

實(shí)施例3：

1）將酮戊二酸發(fā)酵液過濾，得濾液ⅰ，取100ml濾液ⅰ加入到已配置好的20%的乙醇與15%的硫酸銨的雙水相溶液中，有固體沉淀產(chǎn)生，將固體沉淀過濾，得濾液ⅱ，備用；

2）將第一步所得濾液ⅱ在室溫下靜置5分鐘分層，分液去除下層液體，只留取上層液體，將上層液體減壓蒸餾，蒸干所有的乙醇和水分，得琥珀色固體；

3）將琥珀色固體用乙醚進(jìn)行洗滌，洗滌液進(jìn)行蒸餾，將乙醚蒸干后所得液體為丙酮酸；

4）將步驟3）中乙醚洗滌后的固體用無水乙醇進(jìn)行溶解，過濾，得濾液ⅲ，將濾液ⅲ進(jìn)行蒸餾，蒸干乙醇后，所得固體為酮戊二酸。酮戊二酸收率為85.6%。

實(shí)施例4：

1）將酮戊二酸發(fā)酵液過濾，得濾液ⅰ，取100ml濾液ⅰ加入到已配置好的25%的丙酮與5%的硫酸銨的雙水相溶液中，有固體沉淀產(chǎn)生，將固體沉淀過濾，得濾液ⅱ，備用；

2）將第一步所得濾液ⅱ在常溫下靜置5分鐘分層，分液去除下層液體，只留取上層液體，將上層液體減壓蒸餾，蒸干所有的乙醇和水分，得琥珀色固體；

3）將琥珀色固體用乙醚進(jìn)行洗滌，洗滌液進(jìn)行蒸餾，將乙醚蒸干后所得液體為丙酮酸；

4）將步驟3）中乙醚洗滌后的固體用無水乙醇進(jìn)行溶解，過濾，得濾液ⅲ，將濾液ⅲ進(jìn)行蒸餾，蒸干乙醇后，所得固體為酮戊二酸。酮戊二酸收率為81.3%。

實(shí)施例5：

1）將酮戊二酸發(fā)酵液過濾，得濾液ⅰ，取100ml濾液ⅰ加入到已配置好的25%的丙酮與10%的硫酸銨的雙水相溶液中，有固體沉淀產(chǎn)生，將固體沉淀過濾，得濾液ⅱ，備用；

2）將第一步所得濾液ⅱ在常溫下靜置5分鐘分層，分液去除下層液體，只留取上層液體，將上層液體減壓蒸餾，蒸干所有的乙醇和水分，得琥珀色固體；

3）將琥珀色固體用乙醚進(jìn)行洗滌，洗滌液進(jìn)行蒸餾，將乙醚蒸干后所得液體為丙酮酸；

4）將步驟3）中乙醚洗滌后的固體用無水乙醇進(jìn)行溶解，過濾，得濾液ⅲ，將濾液ⅲ進(jìn)行蒸餾，蒸干乙醇后，所得固體為酮戊二酸。酮戊二酸收率為86.7%。

實(shí)施例6：

1）將酮戊二酸發(fā)酵液過濾，得濾液ⅰ，取100ml濾液ⅰ加入到已配置好的25%的丙酮與15%的硫酸銨的雙水相溶液中，有固體沉淀產(chǎn)生，將固體沉淀過濾，得濾液ⅱ，備用；

2）將第一步所得濾液ⅱ在常溫下靜置5分鐘分層，分液去除下層液體，只留取上層液體，將上層液體減壓蒸餾，蒸干所有的乙醇和水分，得琥珀色固體；

3）將琥珀色固體用乙醚進(jìn)行洗滌，洗滌液進(jìn)行蒸餾，將乙醚蒸干后所得液體為丙酮酸；

4）將步驟3）中乙醚洗滌后的固體用無水乙醇進(jìn)行溶解，過濾，得濾液ⅲ，將濾液ⅲ進(jìn)行蒸餾，蒸干乙醇后，所得固體為酮戊二酸。酮戊二酸收率為91.2%。

實(shí)施例7：

1）將酮戊二酸發(fā)酵液過濾，得濾液ⅰ，取100ml濾液ⅰ加入到已配置好的25%的丙酮與5%的磷酸二氫鈉的雙水相溶液中，有固體沉淀產(chǎn)生，將固體沉淀過濾，得濾液ⅱ，備用；

2）將第一步所得濾液ⅱ在常溫下靜置5分鐘分層，分液去除下層液體，只留取上層液體，將上層液體減壓蒸餾，蒸干所有的乙醇和水分，得琥珀色固體；

3）將琥珀色固體用乙醚進(jìn)行洗滌，洗滌液進(jìn)行蒸餾，將乙醚蒸干后所得液體為丙酮酸；

4）將步驟3）中乙醚洗滌后的固體用無水乙醇進(jìn)行溶解，過濾，得濾液ⅲ，將濾液ⅲ進(jìn)行蒸餾，蒸干乙醇后，所得固體為酮戊二酸。酮戊二酸收率為82.3%。

實(shí)施例8：

1）將酮戊二酸發(fā)酵液過濾，得濾液ⅰ，取100ml濾液ⅰ加入到已配置好的25%的丙酮與10%的磷酸二氫鈉的雙水相溶液中，有固體沉淀產(chǎn)生，將固體沉淀過濾，得濾液ⅱ，備用；

2）將第一步所得濾液ⅱ在常溫下靜置5分鐘分層，分液去除下層液體，只留取上層液體，將上層液體減壓蒸餾，蒸干所有的乙醇和水分，得琥珀色固體；

3）將琥珀色固體用乙醚進(jìn)行洗滌，洗滌液進(jìn)行蒸餾，將乙醚蒸干后所得液體為丙酮酸；

4）將步驟3）中乙醚洗滌后的固體用無水乙醇進(jìn)行溶解，過濾，得濾液ⅲ，將濾液ⅲ進(jìn)行蒸餾，蒸干乙醇后，所得固體為酮戊二酸。酮戊二酸收率為88.6%。

實(shí)施例9：

1）將酮戊二酸發(fā)酵液過濾，得濾液ⅰ，取100ml濾液ⅰ加入到已配置好的25%的丙酮與15%的磷酸二氫鈉的雙水相溶液中，有固體沉淀產(chǎn)生，將固體沉淀過濾，得濾液ⅱ，備用；

2）將第一步所得濾液ⅱ在常溫下靜置5分鐘分層，分液去除下層液體，只留取上層液體，將上層液體減壓蒸餾，蒸干所有的乙醇和水分，得琥珀色固體；

3）將琥珀色固體用乙醚進(jìn)行洗滌，洗滌液進(jìn)行蒸餾，將乙醚蒸干后所得液體為丙酮酸；

4）將步驟3）中乙醚洗滌后的固體用無水乙醇進(jìn)行溶解，過濾，得濾液ⅲ，將濾液ⅲ進(jìn)行蒸餾，蒸干乙醇后，所得固體為酮戊二酸。酮戊二酸收率為92.6%。

實(shí)施例10：

1）將酮戊二酸發(fā)酵液過濾，得濾液ⅰ，取100ml濾液ⅰ加入到已配置好的25%的丙酮與15%的磷酸二氫鈉的雙水相溶液中，有固體沉淀產(chǎn)生，將固體沉淀過濾，得濾液ⅱ，備用；

2）將第一步所得濾液ⅱ用恒溫水浴加熱到30℃，在恒溫30℃下靜置5分鐘分層，分液去除下層液體，只留取上層液體，將上層液體減壓蒸餾，蒸干所有的乙醇和水分，得琥珀色固體；

3）將琥珀色固體用乙醚進(jìn)行洗滌，洗滌液進(jìn)行蒸餾，將乙醚蒸干后所得液體為丙酮酸；

4）將步驟3）中乙醚洗滌后的固體用無水乙醇進(jìn)行溶解，過濾，得濾液ⅲ，將濾液ⅲ進(jìn)行蒸餾，蒸干乙醇后，所得固體為酮戊二酸。酮戊二酸收率為93.4%。

實(shí)施例11：

1）將酮戊二酸發(fā)酵液過濾，得濾液ⅰ，取100ml濾液ⅰ加入到已配置好的25%的丙酮與15%的磷酸二氫鈉的雙水相溶液中，有固體沉淀產(chǎn)生，將固體沉淀過濾，得濾液ⅱ，備用；

2）將第一步所得濾液ⅱ用恒溫水浴加熱到35℃，在恒溫35℃下靜置5分鐘分層，分液去除下層液體，只留取上層液體，將上層液體減壓蒸餾，蒸干所有的乙醇和水分，得琥珀色固體；

3）將琥珀色固體用乙醚進(jìn)行洗滌，洗滌液進(jìn)行蒸餾，將乙醚蒸干后所得液體為丙酮酸；

4）將步驟3）中乙醚洗滌后的固體用無水乙醇進(jìn)行溶解，過濾，得濾液ⅲ，將濾液ⅲ進(jìn)行蒸餾，蒸干乙醇后，所得固體為酮戊二酸。酮戊二酸收率為94.1%。

實(shí)施例12：

1）將酮戊二酸發(fā)酵液過濾，得濾液ⅰ，取100ml濾液ⅰ加入到已配置好的25%的丙酮與15%的磷酸二氫鈉的雙水相溶液中，有固體沉淀產(chǎn)生，將固體沉淀過濾，得濾液ⅱ，備用；

2）將第一步所得濾液ⅱ用恒溫水浴加熱到40℃，在恒溫40℃下靜置5分鐘分層，分液去除下層液體，只留取上層液體，將上層液體減壓蒸餾，蒸干所有的乙醇和水分，得琥珀色固體；

3）將琥珀色固體用乙醚進(jìn)行洗滌，洗滌液進(jìn)行蒸餾，將乙醚蒸干后所得液體為丙酮酸；

4）將步驟3）中乙醚洗滌后的固體用無水乙醇進(jìn)行溶解，過濾，得濾液ⅲ，將濾液ⅲ進(jìn)行蒸餾，蒸干乙醇后，所得固體為酮戊二酸。酮戊二酸收率為91.2%。

實(shí)施例13：

1）將酮戊二酸發(fā)酵液過濾，得濾液ⅰ，取100ml濾液ⅰ加入到已配置好的10%的丙酮與5%的磷酸二氫鈉的雙水相溶液中，有固體沉淀產(chǎn)生，將固體沉淀過濾，得濾液ⅱ，備用；

2）將第一步所得濾液ⅱ用恒溫水浴加熱到40℃，在恒溫40℃下靜置5分鐘分層，分液去除下層液體，只留取上層液體，將上層液體減壓蒸餾，蒸干所有的乙醇和水分，得琥珀色固體；

3）將琥珀色固體用乙醚進(jìn)行洗滌，洗滌液進(jìn)行蒸餾，將乙醚蒸干后所得液體為丙酮酸；

4）將步驟3）中乙醚洗滌后的固體用無水乙醇進(jìn)行溶解，過濾，得濾液ⅲ，將濾液ⅲ進(jìn)行蒸餾，蒸干乙醇后，所得固體為酮戊二酸。酮戊二酸收率為29.3%。

實(shí)施例14：

1）將酮戊二酸發(fā)酵液過濾，得濾液ⅰ，取100ml濾液ⅰ加入到已配置好的25%的丙酮與15%的磷酸二氫鈉的雙水相溶液中，有固體沉淀產(chǎn)生，將固體沉淀過濾，得濾液ⅱ，備用；

2）將第一步所得濾液ⅱ用恒溫水浴加熱到40℃，在恒溫40℃下靜置5分鐘分層，分液去除下層液體，只留取上層液體，將上層液體常壓蒸餾，蒸干所有的乙醇和水分，得琥珀色固體；

3）將琥珀色固體用乙醚進(jìn)行洗滌，洗滌液進(jìn)行蒸餾，將乙醚蒸干后所得液體為丙酮酸；

4）將步驟3）中乙醚洗滌后的固體用無水乙醇進(jìn)行溶解，過濾，得濾液ⅲ，將濾液ⅲ進(jìn)行蒸餾，蒸干乙醇后，所得固體為酮戊二酸。酮戊二酸收率為36.5%。

實(shí)施例15：

1）將酮戊二酸發(fā)酵液過濾，得濾液ⅰ，取100ml濾液ⅰ加入到已配置好的25%的丙酮與15%的磷酸二氫鈉的雙水相溶液中，有固體沉淀產(chǎn)生，將固體沉淀過濾，得濾液ⅱ，備用；

2）將第一步所得濾液ⅱ用恒溫水浴加熱到40℃，在恒溫40℃下靜置5分鐘分層，分液去除下層液體，只留取上層液體，將上層液體減壓蒸餾，蒸出所有的乙醇，得琥珀色液體；

3）將琥珀色液體用乙醚進(jìn)行萃取，取上層萃取液進(jìn)行蒸餾，將乙醚蒸干后所得液體為丙酮酸；

4）將步驟3）中乙醚萃取后的下層液體進(jìn)行常壓蒸餾，蒸干后用無水乙醇進(jìn)行溶解，過濾，得濾液ⅲ，將濾液ⅲ進(jìn)行蒸餾，蒸干乙醇后，所得固體為酮戊二酸。酮戊二酸收率為35.4%。

以上所述實(shí)例僅是本專利的優(yōu)選實(shí)施方式，但本專利的保護(hù)范圍并不局限于此。應(yīng)當(dāng)指出，對(duì)于本技術(shù)領(lǐng)域的普通技術(shù)人員來說，在不脫離本專利原理的前提下，根據(jù)本專利的技術(shù)方案及其專利構(gòu)思，還可以做出若干改進(jìn)和潤飾，這些改進(jìn)和潤飾也應(yīng)視為本專利的保護(hù)范圍。