本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域，具體說是一種用于臨床醫(yī)療類制備car-nk(或其它免疫細(xì)胞)等，用于腫瘤的細(xì)胞免疫治療。

背景技術(shù)：

細(xì)胞生物治療是運(yùn)用自身免疫系統(tǒng)的新型癌癥治療方法,是一種具有顯著療效的治療模式。它運(yùn)用分子生物學(xué)技術(shù)和細(xì)胞工程學(xué)技術(shù)，用生物制劑對從病人體內(nèi)采集的免疫細(xì)胞在體外進(jìn)行培養(yǎng)和擴(kuò)增，再回輸?shù)讲∪梭w內(nèi)，從而激發(fā)、增強(qiáng)機(jī)體自身的免疫功能，達(dá)到監(jiān)視并殺滅病變細(xì)胞或修復(fù)受損細(xì)胞的目的。

自然殺傷細(xì)胞(naturalkillercell,nk)屬于粒狀淋巴細(xì)胞，是機(jī)體重要的免疫細(xì)胞。一般認(rèn)為nk細(xì)胞來源于骨髓淋巴樣干細(xì)胞，其分化、發(fā)育依賴于骨髓或胸腺微環(huán)境，主要分布于外周血和脾臟，在淋巴結(jié)和其他組織中也有少量存在。nk細(xì)胞不表達(dá)特異性抗原識別受體，是不同于t、b淋巴細(xì)胞的第三類淋巴細(xì)胞。與其他淋巴細(xì)胞相比，nk細(xì)胞的殺傷活性無mhc限制，無需抗原預(yù)先致敏，因此稱為自然殺傷活性。nk細(xì)胞胞漿豐富，含有較大的嗜天青顆粒，而嗜天青顆粒的含量與nk細(xì)胞的殺傷活性呈正相關(guān)，故nk細(xì)胞作用于靶細(xì)胞后殺傷作用出現(xiàn)早，在體外1小時(shí)、體內(nèi)4小時(shí)即可見到殺傷效應(yīng)。nk細(xì)胞的靶細(xì)胞主要有某些腫瘤細(xì)胞(包括部分細(xì)胞系)、病毒感染細(xì)胞等，因此nk細(xì)胞可直接殺傷某些腫瘤細(xì)胞和病毒感染細(xì)胞。這意味著nk細(xì)胞在機(jī)體抗腫瘤、抗病毒感染和免疫調(diào)節(jié)中會(huì)起到重要的作用。

cd244是由cd244基因編碼的人蛋白質(zhì)，又稱為nk細(xì)胞受體2b4，是一個(gè)nk細(xì)胞重要的表面受體。nk細(xì)胞通過cd244受體激活細(xì)胞毒性功能。

car意為嵌合抗原受體(chimericantigenreceptor)，當(dāng)car結(jié)構(gòu)與腫瘤相關(guān)抗原抗體融合表達(dá)在nk細(xì)胞的細(xì)胞膜表面時(shí)，能夠賦予nk細(xì)胞特異性識別對應(yīng)腫瘤細(xì)胞的能力，此時(shí)的nk細(xì)胞即為car-nk細(xì)胞。一個(gè)完整的car結(jié)構(gòu)通常包括上膜信號區(qū)、抗體區(qū)(通常來源于對應(yīng)單克隆抗體的scfv段)、胞外鉸鏈區(qū)、跨膜區(qū)、胞內(nèi)信號區(qū)。通過基因修飾過的nk細(xì)胞(car-nk)能夠?qū)в衅溽槍Φ目乖募?xì)胞產(chǎn)生特異性更強(qiáng)的細(xì)胞殺傷作用，從而能夠達(dá)到對腫瘤等治療的效果。

慢病毒載體是指以人類免疫缺陷病毒-1(hiv-1)來源的一種病毒載體，可以將外源基因有效地整合到宿主染色體上，從而達(dá)到持久性表達(dá)目的序列的效果，是外源基因常用載體形式之一。其基本過程就是攜帶有外源基因的慢病毒載體在慢病毒包裝質(zhì)粒、細(xì)胞系的輔助下，經(jīng)過病毒包裝成為有感染力的病毒顆粒，通過感染細(xì)胞或活體組織，實(shí)現(xiàn)外源基因在細(xì)胞或活體組織中表達(dá)。慢病毒載體在感染能力方面可有效地感染神經(jīng)元細(xì)胞、腫瘤細(xì)胞、干細(xì)胞、心肌細(xì)胞等多種類型的細(xì)胞。使用慢病毒載體能夠比較方便快捷地實(shí)現(xiàn)目的基因的長期、穩(wěn)定表達(dá)。

目前，尚未建立一種有效的car-nk細(xì)胞制備的方法及其在腫瘤免疫治療方面的應(yīng)用先例。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

針對現(xiàn)有技術(shù)中存在的缺陷，本發(fā)明的目的在于提供一種car-nk細(xì)胞及其制備方法與應(yīng)用。

本發(fā)明的目的和要解決的技術(shù)問題在于：改造人源cd244序列，使之能夠在nk等細(xì)胞表面表達(dá)特異性蛋白，該特異性蛋白能夠識別特定腫瘤細(xì)胞，同時(shí)能夠激活nk細(xì)胞，使之具有對特定腫瘤細(xì)胞的殺傷功能。包含有改造的cd244序列的慢病毒載體能夠包被慢病毒，慢病毒感染nk細(xì)胞后能夠使nk細(xì)胞表達(dá)改造的cd244蛋白序列。

為達(dá)到以上目的，本發(fā)明采取的技術(shù)方案是：

本發(fā)明提供一種car-nk細(xì)胞的制備方法，包括如下步驟：

s1、將特異性抗體(如腫瘤細(xì)胞目標(biāo)抗原的特異性抗體cd19抗體或psma抗體)編碼基因(包含特異性抗體的輕鏈部分、重鏈與輕鏈的連接部分以及重鏈部分)連接到經(jīng)改造的car骨架的克隆位點(diǎn)區(qū)中獲得car基因，

所述經(jīng)改造的car骨架包括依次連接的cd244上膜信號區(qū)、克隆位點(diǎn)區(qū)、cd244胞外鉸鏈區(qū)、cd244跨膜部分區(qū)與cd244胞內(nèi)部分區(qū)，

s2、將所述car基因通過慢病毒感染nk細(xì)胞，得到表達(dá)所述car蛋白(即所述car基因的表達(dá)蛋白，如實(shí)施例4中的car-cd244-anticd19蛋白結(jié)構(gòu)和car-cd244-antipsma蛋白結(jié)構(gòu))的nk細(xì)胞(如nk92mi細(xì)胞)，即所述car-nk細(xì)胞。

在上述car-nk細(xì)胞的制備方法中，所述cd244上膜信號區(qū)的dna序列如序列表序列1中的第1位至第63位所示；

和/或，所述克隆位點(diǎn)區(qū)的dna序列如序列表序列1中的第64位至第95位所示；

和/或，所述cd244胞外鉸鏈區(qū)、cd244跨膜部分區(qū)與cd244胞內(nèi)部分區(qū)的dna序列如序列表序列1中的第96位至第560位所示。

在上述car-nk細(xì)胞的制備方法中，所述經(jīng)改造的car骨架的dna序列如序列表序列1所示。

在上述car-nk細(xì)胞的制備方法中，所述步驟s2按照包括如下步驟的方法進(jìn)行：

s21、將所述car基因連入慢病毒載體的克隆位點(diǎn)上獲得重組慢病毒載體a，將重組慢病毒載體a轉(zhuǎn)染目的細(xì)胞(如293t細(xì)胞)進(jìn)行培養(yǎng)，獲得慢病毒；

s22、將慢病毒感染nk細(xì)胞，獲得所述car-nk細(xì)胞。

在上述car-nk細(xì)胞的制備方法中，步驟s21中，所述慢病毒載體為plenti慢病毒載體；

所述轉(zhuǎn)染使用慢病毒包裝質(zhì)粒進(jìn)行；

所述慢病毒包裝質(zhì)粒具體為pspax2和pmd2.g，轉(zhuǎn)染時(shí)，按照將所述慢病毒載體、pspax2和pmd2.g以質(zhì)量比比例為5ug:3.2ug:1.8ug—7.5ug:4.8ug:2.7ug轉(zhuǎn)染3x10⁶個(gè)目的細(xì)胞；

步驟s22中，所述將慢病毒感染nk細(xì)胞包括將濃縮的慢病毒加入到完全培養(yǎng)基中，與nk細(xì)胞混勻的步驟。

在上述car-nk細(xì)胞的制備方法中，步驟s22中，所述將慢病毒感染nk細(xì)胞還包括加入聚凝胺的步驟；所述聚凝胺的加入終濃度為4ug/ml；

濃縮的慢病毒是將重組慢病毒載體a轉(zhuǎn)染目的細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)后，將培養(yǎng)的上清液在20000g條件下離心1小時(shí)后，取慢病毒用dpbs緩沖液懸浮獲得。

本發(fā)明還提供了一種dna分子，是如下(1)或(2)中的任一種：

(1)包括依次連接的cd244上膜信號區(qū)、克隆位點(diǎn)區(qū)、cd244胞外鉸鏈區(qū)、cd244跨膜部分區(qū)與cd244胞內(nèi)部分區(qū)；

(2)是在(1)所述dna分子的克隆位點(diǎn)區(qū)插入特異性抗體(如腫瘤細(xì)胞目標(biāo)抗原的特異性抗體)編碼基因后形成的dna分子。

在上述dna分子中，所述cd244上膜信號區(qū)的dna序列如序列表序列1中的第1位至第63位所示；

和/或，所述克隆位點(diǎn)區(qū)的dna序列如序列表序列1中的第64位至第95位所示；

和/或，所述cd244胞外鉸鏈區(qū)、cd244跨膜部分區(qū)與cd244胞內(nèi)部分區(qū)的dna序列如序列表序列1中的第96位至第560位所示；

所述(1)的dna分子的序列具體可為序列表序列1所示序列。

本發(fā)明保護(hù)含有所述dna分子的重組載體(如重組表達(dá)載體、重組慢病毒載體)、重組細(xì)胞(如免疫細(xì)胞nk細(xì)胞或t細(xì)胞，或293t細(xì)胞)或重組細(xì)胞系。

本發(fā)明保護(hù)所述dna分子、所述重組載體、重組細(xì)胞或重組細(xì)胞系、任一上述方法制備得到car-nk細(xì)胞在制備腫瘤治療(如抑制腫瘤生長或殺傷腫瘤細(xì)胞)藥物(如腫瘤免疫治療細(xì)胞)、試劑或試劑盒中的應(yīng)用。

所述制備腫瘤治療藥物、試劑或試劑盒中含有如下液體：含濃度為5x10⁶個(gè)所述car-nk細(xì)胞/100ul生理鹽水。

本發(fā)明具有如下有益效果：

本發(fā)明用于構(gòu)建新型腫瘤免疫治療細(xì)胞的細(xì)胞材料是自然殺傷細(xì)胞(nk細(xì)胞)，nk細(xì)胞免疫原性低，可以進(jìn)行異體回輸，相較于t細(xì)胞解決了細(xì)胞來源問題；

本發(fā)明所制備的腫瘤疫苗能夠誘導(dǎo)有抗原特異性的靶細(xì)胞裂解；

本發(fā)明所述經(jīng)改造的car骨架同樣適用于其他免疫細(xì)胞；經(jīng)本發(fā)明的制備方法所修飾的nk細(xì)胞能夠?qū)в衅溽槍Φ目乖募?xì)胞如腫瘤細(xì)胞產(chǎn)生特異性更強(qiáng)的細(xì)胞殺傷作用，從而能夠達(dá)到腫瘤等治療的效果。

本發(fā)明所制備的腫瘤免疫治療細(xì)胞除可應(yīng)用于癌癥患者本人外，也可以應(yīng)用于異體回輸。因此，本發(fā)明所制備的腫瘤免疫治療細(xì)胞與現(xiàn)有的car-t相比，使用范圍更廣，制備成本更低。

附圖說明

本發(fā)明有如下附圖：

圖1為連接了特異性抗體編碼基因的經(jīng)改造的cd244骨架示意圖。

圖2為重組慢病毒載體plenti-car-cd244-anticd19示意圖。

圖3為cd244-anticd19和cd244-antipsma在nk92mi細(xì)胞中的表達(dá)圖。

圖4為流式細(xì)胞術(shù)檢測nk細(xì)胞中car結(jié)構(gòu)表達(dá)結(jié)果，其中，縱坐標(biāo)為計(jì)數(shù)，橫坐標(biāo)為cd19-fitc(grn-hlog)的綠色熒光強(qiáng)度(對數(shù)值)。

圖5為nk92mi-cd244-anticd19對daudi腫瘤細(xì)胞的殺傷實(shí)驗(yàn)。

圖6為nk92mi-cd244-antipsma對pc3腫瘤細(xì)胞的殺傷實(shí)驗(yàn)。

圖7為nk92mi-cd244-anticd19孵育daudi腫瘤細(xì)胞20h后，ifnγ干擾素水平檢測。

圖8為nk92mi-cd244-antipsma孵育pc3腫瘤細(xì)胞20h后，ifnγ干擾素水平檢測。

圖9為對小鼠進(jìn)行活體熒光成像后的腫瘤生長情況結(jié)果。

具體實(shí)施方式

以下結(jié)合附圖對本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)說明。

實(shí)施例1、重組載體car-cd244-anticd19和重組載體car-cd244-antipsma制備

1.將特異性抗體編碼基因使用末端帶有bfuai限制性內(nèi)切酶識別位點(diǎn)的引物進(jìn)行pcr擴(kuò)增；

本實(shí)施例中使用的所述特異性抗體編碼基因序列分別為cd19抗體(anticd19)的部分序列(序列表序列2)和psma抗體(antipsma)的部分序列(序列表序列3)；

2.將步驟1的pcr產(chǎn)物分別進(jìn)行純化；

3.將步驟2純化的pcr產(chǎn)物進(jìn)行單酶切(bfuai)，并同時(shí)將含有改造的cd244骨架的克隆載體進(jìn)行單酶切(bfuai)；

4.將酶切后產(chǎn)物進(jìn)行純化；

5.將純化后的產(chǎn)物按抗體片段與含有改造的cd244骨架的克隆載體摩爾比為3:1配比后，使用t4連接酶進(jìn)行連接、轉(zhuǎn)化、涂板、挑取單克隆提取質(zhì)粒測序；將連接正確的質(zhì)粒(即在所述改造的cd244骨架的克隆位點(diǎn)區(qū)連入了anticd19或antipsma)分別命名為：重組載體car-cd244-anticd19和重組載體car-cd244-antipsma。

所述改造的cd244骨架序列如序列表序列1所示，其中，序列表序列1中的第1位至第63位所示序列為cd244上膜信號區(qū)的dna序列；序列表序列1中的第64位至第95位所示序列為克隆位點(diǎn)區(qū)的dna序列；序列表序列1中的第96位至第560位所示序列為cd244胞外鉸鏈區(qū)、cd244跨膜部分區(qū)與cd244胞內(nèi)部分區(qū)的dna序列(胞外鉸鏈區(qū)包含在跨膜部分區(qū)與胞內(nèi)部分區(qū))中；序列表序列1中的第561位至第575位所示序列為ddddk-tag標(biāo)記；序列表序列1中的第576位至第578位所示序列為終止密碼子。

連接特異性抗體編碼基因的改造的cd244骨架示意圖如圖1所示：圖1中，cd244leader代表cd244上膜信號區(qū)，vl代表特異性抗體的輕鏈部分，gslinker代表特異性抗體重鏈與輕鏈的連接部分，vh代表特異性抗體的重鏈部分，cd244代表cd244的胞外鉸鏈區(qū)、跨膜部分區(qū)與胞內(nèi)部分區(qū)，ddddk代表ddddk-tag標(biāo)記。

實(shí)施例2、重組慢病毒載體的制備

1.分別用實(shí)施例1制備好的重組載體car-cd244-anticd19和重組載體car-cd244-antipsma作為模板，使用帶有bamhi與xbai限制性內(nèi)切酶酶切位點(diǎn)序列的引物pcr擴(kuò)增；

2.對pcr產(chǎn)物分別進(jìn)行純化、酶切(bamhi與xbai)、純化；

3.使用t4連接酶分別將步驟2的產(chǎn)物分別連入plenti慢病毒載體(名稱為plenticmv/toegfppuro(w159-1)，購自addgene，網(wǎng)址：http://www.addgene.org/17481/)的bamhi與xbai位點(diǎn)間；

4.轉(zhuǎn)化、涂板、挑取單克隆提取質(zhì)粒測序，將測序正確的重組慢病毒載體分別命名為重組慢病毒載體plenti-car-cd244-anticd19和plenti-car-cd244-antipsma。

重組慢病毒載體plenti-car-cd244-anticd19的示意圖如圖2所示，其中，cmv-promoter代表cmv啟動(dòng)子，cd244peptide為cd244上膜信號區(qū)，anticd19為cd19抗體，cd244為cd244胞外鉸鏈區(qū)、跨膜部分區(qū)與胞內(nèi)部分區(qū)，ddddk為ddddk-tag標(biāo)記，wpre為功能類似于polya的3’utr的區(qū)域。

實(shí)施例3、慢病毒的制備和濃縮

1、慢病毒的制備

使用實(shí)施例2制備好的重組慢病毒載體plenti-car-cd244-anticd19與pspax2(購自addgene,網(wǎng)址為https://www.addgene.org/12260/)、pmd2.g(購自addgene,網(wǎng)址為https://www.addgene.org/12259/)載體按質(zhì)量比為5ug:3.2ug:1.8ug轉(zhuǎn)染293t細(xì)胞(約3x10⁶個(gè)293t細(xì)胞鋪于10cm皿)，8h后更換為新鮮培養(yǎng)基(dmem培養(yǎng)基,添加10％胎牛血清)，之后每隔24h收集一次上清并加入新鮮培養(yǎng)基(dmem培養(yǎng)基,添加10％胎牛血清)，共收集3次，獲得慢病毒上清a。

使用實(shí)施例2制備好的將重組慢病毒載體plenti-car-cd244-antipsma與pspax2、pmd2.g載體按質(zhì)量比為5ug:3.2ug:1.8ug轉(zhuǎn)染293t細(xì)胞(約3x10⁶個(gè)293t細(xì)胞鋪于10cm皿)，8h后更換為新鮮培養(yǎng)基(dmem培養(yǎng)基,添加10％胎牛血清)，之后每隔24h收集一次上清并加入新鮮培養(yǎng)基(dmem培養(yǎng)基,添加10％胎牛血清)，共收集3次，獲得慢病毒上清b。

2、慢病毒的濃縮

分別將步驟1獲得的慢病毒上清a和b按30ml/管裝入高速離心管，使用高速離心機(jī)離心，20000g離心1小時(shí)，收集管壁上慢病毒，使用100uldpbs緩沖液懸浮，分別獲得濃縮的慢病毒a和b，-80℃保存。

實(shí)施例4、濃縮的慢病毒感染nk細(xì)胞制備car-nk細(xì)胞及檢測

1、濃縮的慢病毒感染nk細(xì)胞

分別將實(shí)施例3制備的濃縮的慢病毒a和b，加入1ml完全培養(yǎng)基，與10⁵個(gè)nk92mi細(xì)胞(購自atcc,網(wǎng)址：https://www.atcc.org/)混勻(加入終濃度4ug/ml的聚凝胺polybrene)，得到重組細(xì)胞nk92mi-cd244-anticd19和重組細(xì)胞nk92mi-cd244-antipsma(此處得到的重組細(xì)胞為混合細(xì)胞，其中car-nk細(xì)胞指nk92mi的重組細(xì)胞nk92mi-cd244-anticd19和nk92mi-cd244-antipsma)。

2、car結(jié)構(gòu)在nk細(xì)胞中的表達(dá)檢測

將步驟1得到重組細(xì)胞nk92mi-cd244-anticd19和實(shí)施例3得到的293t轉(zhuǎn)染載體plenti-car-cd244-anticd19的細(xì)胞進(jìn)行westernblot檢測表面抗體表達(dá)情況:以nk92mi轉(zhuǎn)染plenti空載體后的細(xì)胞為對照，使用cd19-fitc抗原分別于nk92mi轉(zhuǎn)染plenti空載體后的細(xì)胞、重組細(xì)胞nk92mi-cd244-anticd19進(jìn)行孵育后，進(jìn)行westernblot檢測，結(jié)果如圖3所示。

圖3的結(jié)果表明，nk92mi-cd244-anticd19和293t轉(zhuǎn)染載體plenti-car-cd244-anticd19的細(xì)胞能夠特異表達(dá)car-cd244-anticd19蛋白結(jié)構(gòu)。

重組細(xì)胞nk92mi-cd244-antipsma和實(shí)施例3得到的293t轉(zhuǎn)染載體plenti-car-cd244-antipsma的細(xì)胞的表達(dá)檢測按照上述方法進(jìn)行，結(jié)果，nk92mi-cd244-antipsma和293t轉(zhuǎn)染載體plenti-car-cd244-antipsma的細(xì)胞能夠特異性表達(dá)car-cd244-antipsma蛋白結(jié)構(gòu)。

3、流式細(xì)胞術(shù)檢測car-nk細(xì)胞中car蛋白結(jié)構(gòu)的表達(dá)

具體操作按流式抗原標(biāo)記物使用說明進(jìn)行，具體如下：

將待檢測細(xì)胞(步驟2中的重組細(xì)胞nk92mi-cd244-anticd19)取約10⁵個(gè)細(xì)胞離心后去上清；

使用200uldpbs懸浮待檢測細(xì)胞，加入流式抗原標(biāo)記物，輕輕混勻，于37℃搖床(100轉(zhuǎn))孵育30分鐘，離心去上清；

使用500ul完全培養(yǎng)基懸浮細(xì)胞，37℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)5分鐘，離心棄上清；

使用200uldpbs重懸細(xì)胞后，上機(jī)檢測。

結(jié)果：如圖4所示，流式細(xì)胞術(shù)檢測重組細(xì)胞nk92mi-cd244-anticd19細(xì)胞表面car蛋白結(jié)構(gòu)的表達(dá)，較深色無邊緣實(shí)線灰色部分為無任何修飾nk92mi細(xì)胞對照，較淺的有實(shí)線邊緣灰色部分為重組細(xì)胞nk92mi-cd244-anticd19孵育cd19-fitc抗原，位移說明重組細(xì)胞nk92mi-cd244-anticd19細(xì)胞膜表面有cd19抗體表達(dá)；邊界線為對應(yīng)橫坐標(biāo)熒光信號位置對應(yīng)的細(xì)胞計(jì)數(shù)。

實(shí)施例5、car-nk細(xì)胞對腫瘤細(xì)胞的殺傷實(shí)驗(yàn)

取10⁴個(gè)nk92mi-cd244-anticd19細(xì)胞與10⁴個(gè)b淋巴細(xì)胞瘤(daudi)細(xì)胞孵育，以nk92mi為對照，記為1:1；

5,000個(gè)nk92mi-cd244-anticd1細(xì)胞與10⁴個(gè)daudi孵育，以nk92mi為對照，記為0.5:1；

2,500個(gè)nk92mi-cd244-anticd19細(xì)胞與10⁴個(gè)daudi孵育，以nk92mi為對照，記為0.25:1；

1,250個(gè)nk92mi-cd244-anticd19細(xì)胞與10⁴個(gè)daudi孵育，以nk92mi為對照，記為0.125:1；

將nk92mi-cd244-antipsma與前列腺癌(pc3)細(xì)胞孵育，以nk92mi為對照，比例按上述方法進(jìn)行。

設(shè)三組平行對照，孵育20小時(shí)后使用celltox-green(promegag8471)試劑盒檢測細(xì)胞活率(通用方法)，制圖。

結(jié)果如圖5和圖6所示，其中，菱形點(diǎn)為未修飾nk92mi細(xì)胞條件下的腫瘤細(xì)胞溶解程度；正方形點(diǎn)為經(jīng)實(shí)施例4方法修飾的nk92mi細(xì)胞(nk92mi-anticd19代表nk92mi-cd244-anticd19，nk92mi-antipsma代表nk92mi-cd244-antipsma)條件下的腫瘤溶解程度。結(jié)果證明重組cd244修飾過的nk細(xì)胞，即car-nk重組細(xì)胞相比于未修飾過的nk細(xì)胞對腫瘤細(xì)胞的殺傷效果更好。

實(shí)施例6、car-nk細(xì)胞孵育daudi、pc3細(xì)胞20h后的ifnγ干擾素水平檢測

取10⁵個(gè)nk92mi-cd244-anticd19與10⁵個(gè)daudi細(xì)胞于500ul培養(yǎng)基中孵育20h(記為nk92mi-anticd19+daudi)；以未修飾的nk92mi細(xì)胞為對照(記為nk92mi+daudi)；

取10⁵個(gè)nk92mi-cd244-antipsma細(xì)胞與10⁵個(gè)pc3細(xì)胞于500ul培養(yǎng)基中孵育20h(記為nk92mi-antipsma+pc3)；以未修飾的nk92mi細(xì)胞為對照(記為nk92mi+pc3)；

將孵育后的細(xì)胞離心取上清進(jìn)行ifnγ干擾素水平檢測，具體方法按試劑盒使用說明進(jìn)行(不同試劑盒方法略有不同)。

結(jié)果如圖7和圖8所示，其中，nk92mi為未修飾的nk92mi細(xì)胞單獨(dú)進(jìn)行孵育的結(jié)果，nk92mi-anticd19為nk92mi-cd244-anticd19單獨(dú)進(jìn)行孵育的結(jié)果，nk92mi-antipsma為nk92mi-cd244-antipsma單獨(dú)進(jìn)行孵育的結(jié)果。

結(jié)果表明：重組cd244修飾過的nk細(xì)胞即car-nk細(xì)胞nk92mi-cd244-anticd19和nk92mi-cd244-antipsma孵育相應(yīng)的腫瘤細(xì)胞后能夠釋放更多的ifnγ，說明car-nk活性比未修飾的普通nk細(xì)胞活性更強(qiáng)，對腫瘤細(xì)胞殺傷效果更高。

實(shí)施例7、實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的腫瘤模型體內(nèi)實(shí)驗(yàn)

將健康的裸鼠(nudemouse)共9只隨機(jī)分為3組，每組3只，3組分別為空白對照組，nk細(xì)胞對照組，car-nk細(xì)胞組。在所有小鼠前胸腋下附近注射5x10⁶個(gè)有g(shù)fp熒光蛋白標(biāo)記的pc3腫瘤細(xì)胞/只，并正常喂養(yǎng)14天。14天后，對所有組別的小鼠進(jìn)行活體熒光成像，記錄小鼠體內(nèi)腫瘤的成長情況。熒光成像之后，分別對各組小鼠pc3腫瘤細(xì)胞注射點(diǎn)附近分別進(jìn)行如下給藥：

給空白對照組小鼠注射生理鹽水100ul；

給nk細(xì)胞對照組小鼠注射普通nk92mi細(xì)胞懸浮液100ul，總數(shù)為5x10⁶個(gè)nk細(xì)胞/100ul生理鹽水；

給car-nk細(xì)胞組小鼠注射針對于pc3腫瘤細(xì)胞的實(shí)施例4制成的car-nk(nk92mi-cd244-antipsma)細(xì)胞懸浮液(濃度為5x10⁶個(gè)car-nk(nk92mi-cd244-antipsma)細(xì)胞/100ul生理鹽水)。

注射完畢后和正常喂養(yǎng)7天之后分別對所有組別的小鼠進(jìn)行活體熒光成像，記錄小鼠體內(nèi)腫瘤情況。

結(jié)果如圖9所示，圖9中左中右三列分別為：空白對照組、nk細(xì)胞對照組、car-nk細(xì)胞組，第一行為注射完畢后的結(jié)果，第二行為正常喂養(yǎng)7天后的結(jié)果，圖9結(jié)果顯示，相比于空白對照組和nk細(xì)胞對照組，car-nk細(xì)胞組小鼠體內(nèi)的平均腫瘤體積明顯較小，腫瘤生長明顯受到了抑制。

本說明書中未作詳細(xì)描述的內(nèi)容屬于本領(lǐng)域?qū)I(yè)技術(shù)人員公知的現(xiàn)有技術(shù)。

<110>北京呈諾醫(yī)學(xué)科技有限公司

<120>一種car-nk細(xì)胞及其制備方法與應(yīng)用

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