本發(fā)明涉及一種腫瘤免疫方法，特別涉及一種聯(lián)合靶向pd-1及egfr的嵌合性抗原t細(xì)胞腫瘤免疫方法。

背景技術(shù)：

當(dāng)前以手術(shù)、放療、化療為主的三大法寶長(zhǎng)期占據(jù)肺癌、肝癌、胃癌等常見(jiàn)實(shí)體腫瘤的主要臨床治療模式。該模式缺點(diǎn)顯而易見(jiàn)：治療粗放、往往殺敵一百自損三千，且遠(yuǎn)期療效提升已長(zhǎng)期陷入瓶頸。傳統(tǒng)免疫學(xué)療法，包括抗體、細(xì)胞免疫療法(lak、dc-cik、til)等，具有“治療精準(zhǔn)、副作用小”的先天優(yōu)勢(shì)，但存在普適性差、療效微弱且不持久等缺點(diǎn)。

21世紀(jì)以來(lái)，隨著分子免疫學(xué)、合成生物學(xué)的飛速發(fā)展，以提高特異性和持久性為目的對(duì)免疫殺傷細(xì)胞開(kāi)展編輯、改造成為可能。嵌合抗原受體t細(xì)胞療法(car-t)是一個(gè)近幾年得到極大發(fā)展的新型先進(jìn)的精準(zhǔn)免疫療法。嵌合抗原受體(car)是car-t的核心部件，car的基礎(chǔ)設(shè)計(jì)中包括一個(gè)腫瘤相關(guān)抗原結(jié)合區(qū)(通常來(lái)源于單克隆抗體的scfv段)，以及胞外鉸鏈區(qū)、跨膜區(qū)和胞內(nèi)信號(hào)區(qū)(cd28、cd3ζ)。該方法創(chuàng)造性的將腫瘤特異性抗體與cd8+殺傷性t細(xì)胞有效整合，賦予t細(xì)胞以不依賴(lài)于組織相容性抗原(mhc)的方式識(shí)別腫瘤抗原，與天然t細(xì)胞受體(tcr)相比可識(shí)別更廣泛的靶標(biāo)，為工業(yè)合成和廣泛應(yīng)用提供極大便利。car-t是當(dāng)前最領(lǐng)先的細(xì)胞治療技術(shù)，也是最有效的精準(zhǔn)抗腫瘤的細(xì)胞治療方法，被稱(chēng)為活的藥物。

car-t療法首先在血液系統(tǒng)惡性腫瘤臨床治療中取得突破性進(jìn)展：2013年一名急性b淋巴細(xì)胞性白血病(all)患兒被carljune小組使用靶向cd19的car-t細(xì)胞治愈，被《science》雜志評(píng)為當(dāng)年十大科學(xué)突破之首。此后，car-t細(xì)胞免疫療法進(jìn)入了飛速發(fā)展階段。2014年carljune等報(bào)道car-t對(duì)30例復(fù)發(fā)性/難治性b細(xì)胞all患者(25例為兒童)有顯著療效，其中90％獲得完全緩解(cr)。此外，在多發(fā)性骨髓瘤方面，靶向b細(xì)胞成熟抗原(bcma)的car-t臨床初顯成效，2015年9月nejm雜志報(bào)道一例car-t細(xì)胞治療多發(fā)性骨髓瘤獲得完全緩解。

然而相對(duì)于血液惡性腫瘤，在實(shí)體腫瘤領(lǐng)域car-t治療的嘗試卻顯得步履維艱。截止2017年初，全球已有多達(dá)51個(gè)針對(duì)肺癌、胃癌、腸癌、腦膠質(zhì)瘤等實(shí)體腫瘤的car-t細(xì)胞臨床試驗(yàn)注冊(cè)開(kāi)展，靶向基因包括cea、cd171、cd70、egfr、her2、gpc3、epcam、mesothelin及muc1等等，然而到目前為止實(shí)體腫瘤car-t療效差強(qiáng)人意。當(dāng)前實(shí)體腫瘤car-t治療面臨的挑戰(zhàn)主要包括五大方面：①t細(xì)胞轉(zhuǎn)運(yùn)困難(trafficking)：由于組織纖維化等物理屏障，實(shí)體腫瘤中t細(xì)胞浸潤(rùn)明顯偏少且浸入困難；②識(shí)別腫瘤細(xì)胞不易：理想car靶標(biāo)應(yīng)當(dāng)除腫瘤之外所有正常組織均不表達(dá)，但實(shí)體腫瘤異質(zhì)性很強(qiáng)，尋找仍十分困難；③car-t的增殖及維持：足夠且持久的car-t細(xì)胞是抑制腫瘤的重要前提條件；④免疫微環(huán)境抑制：實(shí)體腫瘤微環(huán)境中普遍存在大量免疫抑制因素，不利于car-t細(xì)胞的存活；⑤car-t細(xì)胞的控制:有效控制car-t的行為對(duì)控制治療風(fēng)險(xiǎn)十分重要。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于提供一種聯(lián)合靶向pd-1及egfr的嵌合性抗原t細(xì)胞腫瘤免疫的質(zhì)粒載體及免疫方法。

一種聯(lián)合靶向pd-1及egfr的嵌合性抗原t細(xì)胞腫瘤免疫質(zhì)粒載體，其所述質(zhì)粒載體包括anti-egfrscfv序列，其氨基酸序列如序列表seqidno1所示；anti-pd1序列其氨基酸序列如序列表seqidno2所示；il21序列，其氨基酸序列如序列表seqidno3所示；ccr4序列，其氨基酸序列如序列表seqidno4所示；bcl2序列，其氨基酸序列如序列表seqidno4所示。

包括所述anti-egfrscfv序列，anti-pd1序列，il21序列，ccr4序列，bcl2序列中氨基酸經(jīng)過(guò)1到幾個(gè)突變，增加，缺失，仍然能保持原來(lái)蛋白活性的氨基酸序列。

包含所述聯(lián)合靶向pd-1及egfr的嵌合性抗原t細(xì)胞腫瘤免疫質(zhì)粒載體的細(xì)胞系。

一種聯(lián)合靶向pd-1及egfr的嵌合性抗原t細(xì)胞腫瘤免疫的方法，按照如下步驟進(jìn)行：

(1)從哺乳動(dòng)物外周血通過(guò)密度梯度離心制備單個(gè)核細(xì)胞，隨后從單個(gè)核細(xì)胞中分離出t細(xì)胞，采用自體血清活化t細(xì)胞；

(2)采用權(quán)利要求1所述的質(zhì)粒載體轉(zhuǎn)導(dǎo)預(yù)激活的t細(xì)胞，并進(jìn)行體外擴(kuò)增；

(3)注射體外擴(kuò)增的t細(xì)胞。

所述哺乳動(dòng)物為猴，人，羊，豬，鼠或牛。

與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有如下有益效果：本發(fā)明針對(duì)前述實(shí)體腫瘤面臨的五大挑戰(zhàn)，開(kāi)發(fā)了聯(lián)合靶向pd-1及egfr的第四代car-t細(xì)胞(ep-cart)，以慢病毒載體pllv-hef1α-cd8αsp-cd8αhinge&tm-cd137-cd3ζ為car-t載體基本結(jié)構(gòu)，選擇截?cái)嘈蚭gfr抗體為car核心發(fā)揮腫瘤靶向富集作用，整合過(guò)表達(dá)免疫檢查點(diǎn)抑制劑pd-1單克隆抗體發(fā)揮腫瘤殺傷作用，同時(shí)通過(guò)構(gòu)建共表達(dá)il21/ccr4/bcl2等多種調(diào)節(jié)因子第四代car-t載體，以提高car-t細(xì)胞的殺傷、歸巢及持久增殖能力。ep-cart是通過(guò)體外轉(zhuǎn)導(dǎo)病人自體t淋巴細(xì)胞并適當(dāng)擴(kuò)增后通過(guò)自體回輸回病人體內(nèi)實(shí)現(xiàn)治療，目前尚未見(jiàn)類(lèi)似設(shè)計(jì)car-t細(xì)胞報(bào)道。

附圖說(shuō)明

圖1是本發(fā)明質(zhì)粒載體pllv-gsi060結(jié)構(gòu)示意圖。

圖2是本發(fā)明各型car-t細(xì)胞對(duì)肺癌細(xì)胞株a549的殺傷作用(共培養(yǎng)d1、d3、d5、d7)。

圖3是本發(fā)明各型car-t細(xì)胞與肺癌細(xì)胞株a549共培養(yǎng)后分泌ifn-γ的能力(共培養(yǎng)d1、d3、d5、d7)。

圖4是本發(fā)明各型car-t細(xì)胞體外增殖及維持能力(培養(yǎng)d0-d14天)。

圖5是本發(fā)明各型car-t細(xì)胞表面car表達(dá)(proteinl)比例(培養(yǎng)第14天)。

圖6是本發(fā)明各型ep-cart細(xì)胞pd-1抗體表達(dá)能力測(cè)定(48h、72h、96h)。

圖7是本發(fā)明各型ep-cart細(xì)胞表達(dá)il-21水平(gsi058、gsi059、gsi060)。

圖8是本發(fā)明流式細(xì)胞檢測(cè)各型ep-cart細(xì)胞表達(dá)ccr4能力。

圖9是本發(fā)明基于人源化nsg小鼠的ep-cart細(xì)胞在體腫瘤殺傷能力評(píng)估圖。

圖10是本發(fā)明ep-cart細(xì)胞在非人靈長(zhǎng)類(lèi)(食蟹猴)中的安全性評(píng)估圖。

具體實(shí)施方式

下面結(jié)合附圖，對(duì)本發(fā)明的具體實(shí)施方式進(jìn)行詳細(xì)描述，但應(yīng)當(dāng)理解本發(fā)明的保護(hù)范圍并不受具體實(shí)施方式的限制。

設(shè)計(jì)思路：

選擇截?cái)嘈?truncated)egfr抗體作為car核心：由于實(shí)體腫瘤顯著的異質(zhì)性，理想的腫瘤特異性靶點(diǎn)往往覆蓋率較低、且難以篩選。egfr是表皮生長(zhǎng)因子受體(her)家族成員之一，是重要的實(shí)體腫瘤驅(qū)動(dòng)基因之一，在肺癌、食管癌、腸癌等多種實(shí)體腫瘤均顯著高表達(dá)，陽(yáng)性率高達(dá)40-80％。然而由于egfr亦廣泛分布于人類(lèi)上皮細(xì)胞、成纖維細(xì)胞等正常組織細(xì)胞表面，因此既往臨床研究均導(dǎo)致了嚴(yán)重的正常組織副反應(yīng)。因此發(fā)明人創(chuàng)造性地選擇截?cái)嘈蚭gfr抗體作為car核心，同時(shí)進(jìn)行親和力優(yōu)化，僅選擇中-低親和力的egfr單抗，從而保留了其egfr識(shí)別功能、削弱其作為car-t細(xì)胞的殺傷作用，實(shí)現(xiàn)ep-cart在腫瘤細(xì)胞的最大富集以及正常組織的最小富集。

構(gòu)建過(guò)表達(dá)pd-1抗體的car-t細(xì)胞可發(fā)揮協(xié)同抗腫瘤效應(yīng)：程序性死亡受體-1(pd-1)是最主要的一種細(xì)胞毒性t細(xì)胞增殖的負(fù)調(diào)節(jié)分子，其配體pd-l1在大多數(shù)實(shí)體腫瘤中均呈現(xiàn)高表達(dá)，臨床上pd-1單抗在實(shí)體腫瘤中可顯著激活抗腫瘤免疫殺傷作用。將pd-1單抗聯(lián)合car-t細(xì)胞可顯著增強(qiáng)t細(xì)胞的殺傷效應(yīng)，因此創(chuàng)新性構(gòu)建同時(shí)過(guò)表達(dá)pd-1單抗且靶向egfr的car-t細(xì)胞可能發(fā)揮協(xié)同抗腫瘤效應(yīng)。

共表達(dá)il21/ccr4/bcl2等多種調(diào)節(jié)因子的第四代car-t設(shè)計(jì)：穩(wěn)定的殺傷效能、歸巢能力及持久增殖能力是第四代car-t細(xì)胞典型特征。選擇過(guò)表達(dá)ccr2b/ccr4等趨化因子增加car-t細(xì)胞向腫瘤內(nèi)部的轉(zhuǎn)運(yùn)遷移，過(guò)表達(dá)白介素il-21促進(jìn)car-t細(xì)胞成熟并增強(qiáng)其殺傷能力，過(guò)表達(dá)抗凋亡蛋白bcl-2促進(jìn)t細(xì)胞的增殖及維持。

實(shí)驗(yàn)步驟：

1.ep-cart細(xì)胞構(gòu)建方法

在獲取擬治療患者的edta抗凝外周血約50ml。離心去除血漿，獲取血細(xì)胞，進(jìn)一步通過(guò)percoll^tm密度梯度離心法獲取白膜層外周血單核細(xì)胞(pbmc)。采用miltenyi公司pant細(xì)胞分離試劑盒(cat#130-096-535)，磁珠陽(yáng)性篩選的方法，將pbmc懸浮在緩沖液中與pant細(xì)胞分離預(yù)混微磁珠共孵育10分鐘后，置于macsseparator機(jī)器上過(guò)柱分選出t細(xì)胞，置于含10％胎牛血清(fbs)及100iu/mlil-2的rpmi培養(yǎng)基中備用。

基于慢病毒載體pllv-gs1052為基本框架構(gòu)建ep-cart載體，采用人延伸因子1α(hef1α)啟動(dòng)子，主要包括一個(gè)全長(zhǎng)人源化egfr單抗(mab425)的car結(jié)構(gòu)，從n端到c端分別為cd8信號(hào)肽、mab425的scfv段(425vl(g3s)4-vh)、cd8鉸鏈及跨膜區(qū)、cd137及cd3ζ的胞內(nèi)信號(hào)區(qū)。mab425來(lái)源于高表達(dá)egfr人a431細(xì)胞株致敏的balb/c小鼠，并進(jìn)一步被人源化為馬妥珠單抗。

為提高cart細(xì)胞的安全性，對(duì)上述抗egfr-car的cd3ζ區(qū)進(jìn)行了截短改造(truncated)，稱(chēng)為δcd3ζ(pllv-gsi053)。截短的egfr-car不但可實(shí)現(xiàn)cart細(xì)胞在腫瘤中的靶向富集，而且可避免對(duì)其他egfr陽(yáng)性的正常組織細(xì)胞造成殺傷。

隨后，將一段表達(dá)pd-1單抗的序列(ktd(hc).6xhis)克隆進(jìn)入cd137序列下游，形成pllv-gsi054，過(guò)表達(dá)pd-1單抗的car-t細(xì)胞可有效激活抗腫瘤免疫，從而在局部形成腫瘤殺傷環(huán)境。最后，為進(jìn)一步增強(qiáng)car-t細(xì)胞在體的持久性及腫瘤趨化作用，基于pllv-gsi054載體經(jīng)過(guò)一系列構(gòu)建(gsi054-gsi060)，在pd-1單抗序列下游構(gòu)入多種免疫調(diào)節(jié)基因，包括il21、ccr4、bcl2等(圖1)。過(guò)表達(dá)il21可以介導(dǎo)幼稚及記憶cd8+t細(xì)胞的穩(wěn)定及維持，過(guò)表達(dá)趨化因子受體ccr4可促進(jìn)t細(xì)胞在實(shí)體腫瘤中的趨化及定向富集，過(guò)表達(dá)抗凋亡蛋白bcl2可使t細(xì)胞有效抵御活化誘導(dǎo)的細(xì)胞死亡(aicd)。采用自剪切多基因載體構(gòu)建策略，每個(gè)序列之間采用自剪切f2a及t2a肽間隔，可獲得較好的多基因表達(dá)剪切效率。

2.car-t細(xì)胞體外效能評(píng)估

分別用上述各階段pllv-gsi052至gsi060慢病毒載體，與包裝質(zhì)粒pspax2(addgene#12260)及pmd2.g(addgene#12259)共同包裝慢病毒，分別感染第一部分pant細(xì)胞分離試劑盒制備的人cd3+t細(xì)胞，體外擴(kuò)增7-10天后備用。

①評(píng)價(jià)car-t細(xì)胞對(duì)腫瘤細(xì)胞株的體外殺傷作用

以表達(dá)生物熒光素酶(luciferase)的egfr+肺癌細(xì)胞株a549-luc為研究對(duì)象，評(píng)價(jià)各種car-t細(xì)胞對(duì)a549細(xì)胞的細(xì)胞毒性(cytotoxicity)。將car-t細(xì)胞和a549細(xì)胞按照5:1的比例共培養(yǎng)，分別1、3、5、7天四個(gè)時(shí)間點(diǎn)，采用one-glotm體外熒光素酶分析試劑盒分析細(xì)胞活性，共培養(yǎng)后剩余的生物發(fā)光活性(相對(duì)光子數(shù)，rlu)直接與活細(xì)胞數(shù)量相關(guān)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)：全長(zhǎng)(full-length)egfr-cart(gsi052)細(xì)胞在d1就表現(xiàn)出很強(qiáng)的細(xì)胞毒性，直至d7抑制率達(dá)91％；而僅表達(dá)截短型(truncated)egfr-cart(gsi053、gsi054)細(xì)胞毒性明顯減輕。但與未處理組(unt)相比，7天培養(yǎng)后，共表達(dá)pd-1抗體+截短型egfr-car的三種ep-cart細(xì)胞(gsi058、gsi059、gsi060)對(duì)a549均表現(xiàn)出一定程度(18-37％)的增殖抑制作用，這些結(jié)果說(shuō)明ep-cart細(xì)胞(共表達(dá)pd-1抗體+截短型egfr-car)抗egfr+細(xì)胞能力顯著削弱，具有一定的增殖抑制作用，提示具有較好的安全性及對(duì)egfr+腫瘤細(xì)胞靶向富集能力(圖2)。

②評(píng)價(jià)各型car-t細(xì)胞分泌ifn-γ能力

在與a549細(xì)胞共培養(yǎng)(e:t＝5:1)的情況下，采用ifn-γhtrp試劑盒(cisbio#62hifngpeg)，分別于d1、d3、d5、d7檢測(cè)各組car-t細(xì)胞上清ifn-γ表達(dá)水平，結(jié)果發(fā)現(xiàn)：在四個(gè)時(shí)間點(diǎn)，僅全長(zhǎng)(full-length)egfr-cart(gsi052)加入a549共培養(yǎng)后ifn-γ分泌顯著上調(diào)，其余截短型(truncated)egfr-cart(gsi054-60)組ifn-γ分泌顯著降低，僅略高于未處理對(duì)照組(unt)(圖3)，說(shuō)明ep-cart細(xì)胞(共表達(dá)pd-1抗體+截短型egfr-car)并不通過(guò)ifn-γ介導(dǎo)的殺傷性t細(xì)胞作用發(fā)揮抗腫瘤效應(yīng)。

③評(píng)價(jià)各型car-t細(xì)胞體外增殖及維持能力

分別與a549細(xì)胞共培養(yǎng)(e:t＝5:1)及不與a549共培養(yǎng)(w/o)的情況下，觀察兩周時(shí)間內(nèi)(d0-d14)各型cart細(xì)胞在體外的自我增殖及維持能力，結(jié)果發(fā)現(xiàn)：①在有a549共培養(yǎng)的情況下，除了全長(zhǎng)egfr-cart(gsi052)細(xì)胞因?yàn)閍549的殺傷作用，呈現(xiàn)快速增殖外，過(guò)表達(dá)il21/ccr4/bcl2的ep-cart(gsi060)細(xì)胞增殖及維持能力最強(qiáng)；②在沒(méi)有a549共培養(yǎng)的情況下，仍然是gsi060ep-cart細(xì)胞表現(xiàn)出了最強(qiáng)的增殖及維持能力(圖4)。進(jìn)一步選擇沒(méi)有a549共培養(yǎng)的d14天各組car-t細(xì)胞，流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞表面car表達(dá)情況，結(jié)果發(fā)現(xiàn)：過(guò)表達(dá)il21/ccr4/bcl2的ep-cart(gsi060)細(xì)胞car表達(dá)比例最高(19.5％)(圖5)。上述結(jié)果說(shuō)明過(guò)表達(dá)il21/ccr4/bcl2等促增殖、抗凋亡蛋白的ep-cart(gsi060)具有最好的增殖及維持能力。

④評(píng)價(jià)各型ep-cart細(xì)胞表達(dá)pd-1抗體能力

針對(duì)gsi054、gsi059、gsi060三種已同時(shí)構(gòu)入truncatedegfr-car及pd-1單抗的ep-cart細(xì)胞，收集細(xì)胞培養(yǎng)液上清，采用lanpowertm人fc段檢測(cè)試劑盒(genscript)檢測(cè)pd-1單抗水平(由于pd-1抗體自帶融合型6xhis標(biāo)簽蛋白，故亦可采用抗6xhis均相時(shí)間分辨熒光htrp試劑盒(cisbio#64hispeb)檢測(cè)pd-1抗體表達(dá))，結(jié)果發(fā)現(xiàn)：gsi054、gsi059、gsi060各組car-t細(xì)胞表達(dá)pd-1抗體表達(dá)水平均顯著高于普通t細(xì)胞(unt)；與a549細(xì)胞共培養(yǎng)(t:a＝5:1)后，gsi054、gsi057、gsi060各組car-t細(xì)胞表達(dá)pd-1抗體水平較沒(méi)有a549(w/oa549)存在的情況下顯著上升，達(dá)到2-2.5μg/ml(圖6)。結(jié)果表明：各型ep-cart細(xì)胞表現(xiàn)出了穩(wěn)定的pd-1抗體表達(dá)能力，尤其是在與a549共培養(yǎng)的情況下，過(guò)表達(dá)il21/ccr4/bcl2的ep-cart(gsi060)細(xì)胞表達(dá)pd-1抗體能力最強(qiáng)。

⑤評(píng)價(jià)各型ep-cart細(xì)胞表達(dá)il21，ccr4及bcl2的水平

采用人il-21elisamax^tmdeluxe試劑盒(biolegend#433804)檢測(cè)細(xì)胞培養(yǎng)液上清中的il21濃度。采用pe標(biāo)記的抗人ccr4一抗(biolegend##359411)流式細(xì)胞儀(facscalibur，bdbiosciences)檢測(cè)car-t細(xì)胞表面ccr4表達(dá)水平。采用alexa488標(biāo)記的抗人bcl2一抗(biolegend#658703)細(xì)胞內(nèi)染色法(intracelluarstaining)流式細(xì)胞儀檢測(cè)bcl2蛋白水平。結(jié)果發(fā)現(xiàn)：如圖7所示，與未處理組(unt)相比，gsi058、gsi059、gsi060三種ep-cart細(xì)胞均可穩(wěn)定表達(dá)il21；如圖8所示，gsi059、gsi060組ep-cart細(xì)胞較gsi058表達(dá)ccr4顯著上調(diào)(38％、35.6％vs.12.2％)，gsi060組ep-cart細(xì)胞gsi058、gsi059組bcl-2表達(dá)顯著上調(diào)(29.7％vs.6.71％、10.6％)。上述結(jié)果提示各型ep-cart細(xì)胞可穩(wěn)定表達(dá)構(gòu)入的各種細(xì)胞因子及受體。

car-t細(xì)胞體內(nèi)效能評(píng)估

以免疫缺陷nsg小鼠為研究對(duì)象，首先亞致死劑量照射nsg小鼠后腹腔注射人外周血單核細(xì)胞(pbmc)50×10⁶個(gè)，進(jìn)行人源化免疫系統(tǒng)重建，約四周后流式細(xì)胞儀確認(rèn)nsg小鼠人源化免疫系統(tǒng)重建成功，隨后尾靜脈注射5×10⁶個(gè)攜帶生物熒光素酶的人肺癌細(xì)胞株a549-luc，建立肺癌被動(dòng)轉(zhuǎn)移模型，造模成功后分別與第14天、28天，以未處理的t細(xì)胞(unt)為對(duì)照組，兩次給予10×10⁶個(gè)過(guò)表達(dá)il21/ccr4/bcl2的ep-cart細(xì)胞(gsi060)尾靜脈注射，定期進(jìn)行體內(nèi)生物發(fā)光成像(bli)觀察腫瘤轉(zhuǎn)移數(shù)量。同時(shí)定期采血，觀察ep-cart細(xì)胞在體內(nèi)維持情況。如圖9所示，ep-cart細(xì)胞可有效清除nsg小鼠中移植的a549-luc細(xì)胞并拯救小鼠，而未處理組中的多數(shù)小鼠在第42天開(kāi)始出現(xiàn)死亡。上述結(jié)果提示：過(guò)表達(dá)il21/ccr4/bcl2的ep-cart細(xì)胞(gsi060)可在構(gòu)造人源化免疫系統(tǒng)的nsg小鼠體內(nèi)發(fā)揮良好的抗腫瘤作用。

ep-cart細(xì)胞治療臨床前安全性研究

首先對(duì)ep-cart細(xì)胞在非人靈長(zhǎng)類(lèi)動(dòng)物模型(食蟹猴)中進(jìn)行了臨床前安全性研究。以兩只食蟹猴(nhp#120117和nhp#120545，兩種雄性，約4kg)為研究對(duì)象，首先從食蟹猴外周血通過(guò)密度梯度離心制備單個(gè)核細(xì)胞(pbmc)，隨后使用非人靈長(zhǎng)類(lèi)動(dòng)物pant細(xì)胞分離試劑盒(miltenyi#130-091-993)從pbmc中分離食蟹猴t細(xì)胞。進(jìn)一步用非人靈長(zhǎng)類(lèi)t細(xì)胞活化/擴(kuò)增試劑盒(miltenyi#130-092-919)和人il-2用自體猴血清預(yù)先活化制備的猴t細(xì)胞，最后用ep-cart慢病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)預(yù)激活的t細(xì)胞，并進(jìn)行體外擴(kuò)增。

在輸注自體car-t細(xì)胞前3天，通過(guò)靜脈注射用環(huán)磷酰胺以22mg/kg體重的劑量預(yù)處理食蟹猴。在自體輸注的當(dāng)天，通過(guò)溫和旋轉(zhuǎn)將細(xì)胞在37℃水浴中解凍，并在5分鐘內(nèi)通過(guò)靜脈輸注立即輸注給動(dòng)物。nhp#120117猴用5×106/kgep-cart細(xì)胞輸注，nhp#120545猴用4×107/kgep-cart細(xì)胞輸注。

在ep-cart細(xì)胞給藥后監(jiān)測(cè)猴子的發(fā)燒，呼吸窘迫，食欲，腹瀉和體重減輕。獲得給藥前和給藥后的血液樣品，并檢查cbc，血清化學(xué)和細(xì)胞因子水平。

如圖10所示，在自體輸注ep-cart細(xì)胞之前和之后，體重、體溫、完全血細(xì)胞計(jì)數(shù)或血生化檢測(cè)各因子均沒(méi)有顯著變化，表明ep-cart細(xì)胞在食蟹猴中具有良好的耐受性和安全性。

以上公開(kāi)的僅為本發(fā)明的具體實(shí)施例，但是，本發(fā)明并非局限于此，任何本領(lǐng)域的技術(shù)人員能思之的變化都應(yīng)落入本發(fā)明的保護(hù)范圍。

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<110>尹榮

<120>聯(lián)合靶向pd-1及egfr的嵌合性抗原t細(xì)胞腫瘤免疫方法

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