本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域。更具體地，涉及一種用枯草芽孢桿菌工程菌降解1，2，3-三氯丙烷的方法。
背景技術(shù)：
1，2，3-三氯丙烷（tcp）是一種人工合成的氯代有機(jī)化合物，是制造油漆涂料和土壤殺蟲(chóng)劑的重要原料，被廣泛應(yīng)用于工業(yè)和農(nóng)業(yè)生產(chǎn)。但tcp具有高毒性和難降解的特點(diǎn)，廣泛使用造成了該物質(zhì)在土壤和地下水中的大量積累，對(duì)人類健康和生態(tài)環(huán)境造成了巨大的威脅。
目前降解tcp的方法有：物理、化學(xué)和生物方法。物理法包括真空抽濾和活性炭吸附。但tcp易揮發(fā)、難吸附，所以物理法不能有效解決tcp污染問(wèn)題?；瘜W(xué)法主要利用強(qiáng)氧化劑和強(qiáng)還原劑處理tcp，具有工藝簡(jiǎn)單的特點(diǎn)。但強(qiáng)氧化劑和強(qiáng)還原劑的使用會(huì)嚴(yán)重破壞生態(tài)環(huán)境。與物理和化學(xué)法相比，生物降解法具有成本低和能夠?qū)⒂泻ξ镔|(zhì)完全降解的優(yōu)點(diǎn)，已成為降解環(huán)境污染物的有效方法。目前，有研究利用固定化酶（鹵烷脫鹵酶、鹵醇脫鹵酶和環(huán)氧化物水解酶）構(gòu)建體外tcp降解途徑，使tcp轉(zhuǎn)化成甘油。但固定化酶存在制作過(guò)程復(fù)雜、生產(chǎn)成本高和難以重復(fù)利用的問(wèn)題，特別是在低濃度的tcp污染環(huán)境中，固定化酶具有明顯的局限性。另外，一些研究構(gòu)建了能降解tcp及其中間產(chǎn)物的工程菌。但構(gòu)建的菌株存在tcp耐受性差、遺傳不穩(wěn)定和降解效率低的問(wèn)題。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：
本發(fā)明的目的是克服上述現(xiàn)有tcp降解技術(shù)的缺陷和不足，提供一種用枯草芽孢桿菌工程菌降解1，2，3-三氯丙烷的方法。
本發(fā)明的另一目的是提供一種降解1，2，3-三氯丙烷的枯草芽孢桿菌工程菌。
本發(fā)明上述目的通過(guò)以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)：
一種鹵烷脫鹵酶基因（dhaa31），其核酸序列如seqidno.1所示。
一種鹵烷脫鹵酶（haloalkanedehalogenase,dhaa31），其氨基酸序列如seqidno.2所示。
一種鹵醇脫鹵酶基因（hhec），其核酸序列如seqidno.3所示。
一種鹵醇脫鹵酶（halohydrindehalogenase,hhec），其氨基酸序列如seqidno.4所示。
一種環(huán)氧化物水解酶基因（echa），其核酸序列如seqidno.5所示。
一種環(huán)氧化物水解酶（epoxidehydrolase,echa），其氨基酸序列如seqidno.6所示。
一種降解1，2，3-三氯丙烷的枯草芽孢桿菌工程菌，構(gòu)建方法為：首先合成能降解1，2，3-三氯丙烷（tcp）及其中間產(chǎn)物（2，3-二氯-1-丙醇和環(huán)氧氯丙烷）的鹵烷脫鹵酶（dhaa31）基因、鹵醇脫鹵酶（hhec）基因和環(huán)氧化物水解酶（echa）基因，序列分別如seqidno.1、seqidno.3、seqidno.5所示；然后構(gòu)建包含上述基因的枯草芽孢桿菌整合載體，載體轉(zhuǎn)化枯草芽孢桿菌，通過(guò)基因異位整合及抗性基因敲除的方法，將上述基因整合至枯草芽孢桿菌基因組中。所得枯草芽孢桿菌工程菌分泌表達(dá)上述基因編碼的鹵烷脫鹵酶、鹵醇脫鹵酶和環(huán)氧化物水解酶。
具體，優(yōu)選地，所述枯草芽孢桿菌工程菌的構(gòu)建方法包括如下步驟：
（1）基因合成：根據(jù)枯草芽孢桿菌的密碼子偏好性優(yōu)化鹵烷脫鹵酶（dhaa31）、鹵醇脫鹵酶（hhec）和環(huán)氧化物水解酶（echa）基因序列，并合成鹵烷脫鹵酶基因dhaa31、鹵醇脫鹵酶基因hhec和環(huán)氧化物水解酶基因echa；
（2）利用pgrac啟動(dòng)子和phod信號(hào)肽序列，分別構(gòu)建包含dhaa31基因、hhec基因和echa基因的枯草芽孢桿菌整合載體；
（3）將步驟（2）的整合載體轉(zhuǎn)化枯草芽孢桿菌，通過(guò)基因異位整合及抗性基因敲除的方法，將dhaa31基因、hhec基因和echa基因依次整合至枯草芽孢桿菌基因組，構(gòu)建得到可以分泌表達(dá)鹵烷脫鹵酶、鹵醇脫鹵酶和環(huán)氧化物水解酶的枯草芽孢桿菌工程菌。
更具體地，作為一種可選擇的優(yōu)選方案，所述枯草芽孢桿菌工程菌的構(gòu)建方法包括如下步驟：
s1.制備酶基因及構(gòu)建整合載體所需的相關(guān)原件
s11.合成鹵烷脫鹵酶（dhaa31）基因、鹵醇脫鹵酶（hhec）基因和環(huán)氧化物水解酶（echa）基因，序列分別如seqidno.1、seqidno.3、seqidno.5所示；
s12.將目的基因鹵烷脫鹵酶基因、鹵醇脫鹵酶基因和環(huán)氧化物水解酶基因分別插入到質(zhì)粒pmd18-t中，構(gòu)建得到重組質(zhì)粒pmd18t-dhaa31、pmd18t-hhec和pmd18t-echa；
s13.pcr擴(kuò)增得到構(gòu)建整合載體所需的啟動(dòng)子和信號(hào)肽序列
s131.擴(kuò)增啟動(dòng)子序列
以質(zhì)粒pht43為載體，利用引物pgrac-fw和pgrac-rv進(jìn)行pcr擴(kuò)增，得到啟動(dòng)子pgrac序列；
引物pgrac-fw的序列如seqidno.7所示，引物pgrac-rv的序列如seqidno.8所示；
s132.擴(kuò)增信號(hào)肽序列
利用引物phod-fw和phod-rv從枯草芽孢桿菌基因組dna上擴(kuò)增得到phod信號(hào)肽序列；
引物phod-fw的序列如seqidno.9所示，引物phod-rv的序列如seqidno.10所示；
s133.用t4dna連接酶將擴(kuò)增的啟動(dòng)子和信號(hào)肽序列連接，構(gòu)建得到包含啟動(dòng)子和信號(hào)肽的dna序列組件（pgrac-phodcassette），如seqidno.13所示；
s2.構(gòu)建枯草芽孢桿菌整合載體
s21.構(gòu)建重組質(zhì)粒pdgief-psphoddhaa31
從genbankdatabase數(shù)據(jù)庫(kù)中下載編碼質(zhì)粒pdgief的基因序列（序列號(hào)為dq358863.1），將質(zhì)粒pdgief在genaraycompany合成（shanghaigeneraybiotechco.,ltd），即為宿主廣泛性質(zhì)粒pdgief；
以重組質(zhì)粒pmd18t-dhaa31為模板，應(yīng)用引物dhaa31-fw/dhaa31-rv進(jìn)行pcr擴(kuò)增獲得外源基因dhaa31；擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)過(guò)雙酶切處理后，插入到質(zhì)粒pdgief的sali/noti位點(diǎn)，構(gòu)建得到重組質(zhì)粒pdgief-dhaa31；
將pgrac-sphodcassette雙酶切后插入到重組質(zhì)粒pdgief-dhaa31的nhei/sali位點(diǎn)，構(gòu)建得到重組質(zhì)粒pdgief-psphoddhaa31；
其中，引物dhaa31-fw的序列如seqidno.14所示，引物dhaa31-rv的序列如seqidno.15所示；
s22.構(gòu)建重組質(zhì)粒piefvpr-psphodhhec
以pmd18t-hhec為模板，使用引物hhec-fw/hhec-rv進(jìn)行pcr擴(kuò)增獲得外源基因hhec；擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)過(guò)雙酶切處理后，插入到vpr基因位點(diǎn)整合質(zhì)粒piefvpr的sali/noti位點(diǎn)，構(gòu)建得到重組質(zhì)粒piefvpr-hhec；
將pgrac-sphodcassette雙酶切處理后插入到質(zhì)粒piefvpr-hhec的nhei/sali位點(diǎn)，構(gòu)建得到重組質(zhì)粒piefvpr-psphodhhec；
其中，引物hhec-fw的序列如seqidno.24所示，引物hhec-rv的序列如seqidno.25所示；
s23.構(gòu)建重組質(zhì)粒piefepr-psphodecha
以pmd18t-echa為模板，使用引物echa-fw/echa-rv進(jìn)行pcr擴(kuò)增獲得外源基因echa；擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)過(guò)雙酶切處理后，插入到epr基因位點(diǎn)整合質(zhì)粒piefepr的sali/noti位點(diǎn)，構(gòu)建得到重組質(zhì)粒piefepr-echa；將pgrac-sphodcassette經(jīng)雙酶切處理后插入到質(zhì)粒piefepr-echa的nhei/sali位點(diǎn)，構(gòu)建得到重組質(zhì)粒piefepr-psphodecha；
其中，引物echa-fw的序列如seqidno.34所示，引物echa-rv的序列如seqidno.35所示；
利用引物擴(kuò)增外源基因的pcr程序如下：98℃，10min；98℃，10s；55℃，10s；72℃，15s，進(jìn)行30個(gè)循環(huán)；72℃，3min；
s3.構(gòu)建枯草芽孢桿菌工程菌
s31.重組質(zhì)粒pdgief-psphoddhaa31轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞，提取重組質(zhì)粒，線性化后重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化枯草芽孢桿菌感受態(tài)細(xì)胞，重組質(zhì)粒與宿主基因組發(fā)生雙交換同源重組，將目的基因整合至基因組amye位點(diǎn)；從含有壯觀霉素的lb平板上挑選陽(yáng)性克隆，將其接種到lb培養(yǎng)基中，37℃，200rpm培養(yǎng)24h，將培養(yǎng)物稀釋，涂布于含有0.1mmiptg的固體lb平板，篩選出iptgs和spcr的單菌落，即為含有外源基因dhaa31的工程菌，命名為b.subtilis168-1；
s32.采用同樣的方法，將鹵醇脫鹵酶基因（hhec）和環(huán)氧化物水解酶基因（echa）依次整合到工程菌b.subtilis168-1基因組的vpr和epr位點(diǎn)，最終構(gòu)建得到含有外源基因dhaa31、hhec和echa的枯草芽孢桿菌工程菌。
另外，本發(fā)明還提供了一種用枯草芽孢桿菌工程菌降解1，2，3-三氯丙烷的方法，是利用上述的枯草芽孢桿菌工程菌降解1，2，3-三氯丙烷。
本發(fā)明構(gòu)建的枯草芽孢桿菌工程菌能夠耐受8mm的1，2，3-三氯丙烷（tcp），且在30～37℃條件下，在基本鹽培養(yǎng)基（mmy）中培養(yǎng)20～30天，工程菌可將2mmtcp完全降解。
因此，枯草芽孢桿菌工程菌在降解1，2，3-三氯丙烷及其中間產(chǎn)物（2，3-二氯-1-丙醇和環(huán)氧氯丙烷）的應(yīng)用，以及在制備1，2，3-三氯丙烷、2，3-二氯-1-丙醇和/或環(huán)氧氯丙烷的降解制劑方面的應(yīng)用，也在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。
本發(fā)明通過(guò)分子生物學(xué)技術(shù)構(gòu)建含鹵烷脫鹵酶（dhaa31）基因、鹵醇脫鹵酶（hhec）基因和環(huán)氧化物水解酶（echa）基因的枯草芽孢桿菌整合載體；將上述載體轉(zhuǎn)化枯草芽孢桿菌；通過(guò)基因異位整合及抗性基因敲除的方法，將上述基因分別整合至枯草芽孢桿菌168基因組；通過(guò)枯草芽孢桿菌工程菌分泌的鹵烷脫鹵酶、鹵醇脫鹵酶和環(huán)氧化物水解酶，構(gòu)建1，2，3-三氯丙烷降解途徑，將tcp轉(zhuǎn)化成甘油，最終實(shí)現(xiàn)1，2，3-三氯丙烷的完全礦化。
本發(fā)明具有以下有益效果：
本發(fā)明構(gòu)建的枯草芽孢桿菌工程菌能夠分泌表達(dá)降解1,2,3-三氯丙烷（tcp）及其中間產(chǎn)物的鹵烷脫鹵酶、鹵醇脫鹵酶和環(huán)氧化物水解酶，對(duì)1，2，3-三氯丙烷（tcp）耐受性好，對(duì)tcp及其中間產(chǎn)物具有很好的降解效果和效率，可實(shí)現(xiàn)tcp的完全降解，具有降解效率高、tcp耐受性強(qiáng)且遺傳穩(wěn)定等特點(diǎn)，是目前降解tcp最有效的基因工程菌。
附圖說(shuō)明
圖1：枯草芽孢桿菌整合載體；p：pgrac啟動(dòng)子；s：phod信號(hào)肽；dhaa31：鹵烷脫鹵酶突變體基因；hhec：鹵醇脫鹵酶基因；echa：環(huán)氧化物水解酶基因。amye-front：amye基因上游同源臂；amye-back：amye基因下游同源臂；vpr-front：vpr基因上游同源臂；vpr-back：vpr基因下游同源臂；epr-front：epr基因上游同源臂；epr-back：epr基因下游同源臂。
圖2：鹵烷脫鹵酶基因（dhaa31）、鹵醇脫鹵酶基因（hhec）和環(huán)氧化物水解酶基因（echa）整合到枯草芽孢桿菌基因組amye、vpr和epr位點(diǎn)。
圖3：通過(guò)pcr擴(kuò)增和瓊脂糖凝膠電泳技術(shù)驗(yàn)證鹵烷脫鹵酶基因（dhaa31）、鹵醇脫鹵酶基因（hhec）和環(huán)氧化物水解酶基因（echa）整合到枯草芽孢桿菌基因組amye、vpr和epr位點(diǎn)；m：marker；line1：對(duì)照組amye位點(diǎn)基因片段；line2：枯草芽孢桿菌工程菌amye位點(diǎn)基因片段；line3：對(duì)照組vpr位點(diǎn)基因片段；line4.：枯草芽孢桿菌工程菌vpr位點(diǎn)基因片段；line5：對(duì)照組epr位點(diǎn)基因片段；line6：枯草芽孢桿菌工程菌epr位點(diǎn)基因片段。
圖4：鹵烷脫鹵酶（dhaa31）、鹵醇脫鹵酶（hhec）和環(huán)氧化物水解酶（echa）在枯草芽孢桿菌工程菌中的表達(dá)和分泌（枯草芽孢桿菌工程菌培養(yǎng)基上清中的外源蛋白）；m：marker；line1：鹵烷脫鹵酶；line2：鹵醇脫鹵酶；line3：環(huán)氧化物水解酶。
圖5：枯草芽孢桿菌工程菌b.subtilis168-3對(duì)1，2，3-三氯丙烷的耐受性。
圖6：枯草芽孢桿菌工程菌培養(yǎng)上清粗酶液對(duì)1，2，3-三氯丙烷的降解作用。
圖7：枯草芽孢桿菌工程局菌對(duì)1，2，3-三氯丙烷、2，3-二氯-1-丙醇和環(huán)氧氯丙烷的降解作用；a為工程菌對(duì)tcp的降解作用；b為工程菌對(duì)dcp的降解作用；c為工程菌對(duì)ech的降解作用。
具體實(shí)施方式
以下結(jié)合說(shuō)明書(shū)附圖和具體實(shí)施例來(lái)進(jìn)一步說(shuō)明本發(fā)明，但實(shí)施例并不對(duì)本發(fā)明做任何形式的限定。除非特別說(shuō)明，本發(fā)明采用的試劑、方法和設(shè)備為本技術(shù)領(lǐng)域常規(guī)試劑、方法和設(shè)備。
除非特別說(shuō)明，以下實(shí)施例所用試劑和材料均為市購(gòu)。
實(shí)施例1獲得酶基因及構(gòu)建整合載體所需的相關(guān)原件
1、根據(jù)枯草芽孢桿菌密碼子偏好性優(yōu)化，設(shè)計(jì)出了鹵烷脫鹵酶突變體基因（dhaa31，核酸序列如seqidno.1所示）、鹵醇脫鹵酶基因（hhec，核酸序列如seqidno.3所示）和環(huán)氧化物水解酶基因（echa，核酸序列如seqidno.5所示）。
對(duì)應(yīng)編碼得到鹵烷脫鹵酶（haloalkanedehalogenase,dhaa31）氨基酸序列如seqidno.2所示、鹵醇脫鹵酶（halohydrindehalogenase,hhec）氨基酸序列如seqidno.4所示、環(huán)氧化物水解酶（epoxidehydrolase,echa）氨基酸序列如seqidno.6所示。
2、將合成的上述目的基因插入到質(zhì)粒pmd18-t中，構(gòu)建重組質(zhì)粒pmd18t-dhaa31、pmd18t-hhec和pmd18t-echa。
3、pcr擴(kuò)增得到構(gòu)建整合載體所需的啟動(dòng)子和信號(hào)肽序列
（1）擴(kuò)增啟動(dòng)子序列
以質(zhì)粒pht43(vt2007,miaolingbio,guangzhou,china)為載體，利用引物pgrac-fw和pgrac-rv進(jìn)行pcr擴(kuò)增，得到pgrac啟動(dòng)子序列，如seqidno.11所示。
引物pgrac-fw（序列如seqidno.7所示）：
5’-acactagctagcagctattgtaacataatcggtacggg-3’（下劃線部分為nhei酶切位點(diǎn)，5’端6位是酶切保護(hù)堿基）；
引物pgrac-rv（序列如seqidno.8所示）：
5’-taacgcggatccttcctcctttaattggg-3’（下劃線部分為bamhi酶切位點(diǎn)，5’端6位是酶切保護(hù)堿基）。
（2）擴(kuò)增信號(hào)肽序列
利用引物phod-fw和phod-rv從枯草芽孢桿菌基因組dna上擴(kuò)增得到phod信號(hào)肽序列，如seqidno.12所示。
引物phod-fw（序列如seqidno.9所示）：
5’-taacgcggatccatggcatacgacagtc-3’（下劃線部分為bamhi酶切位點(diǎn)，5’端6位是酶切保護(hù)堿基）；
引物phod-rv（序列如seqidno.10所示）：
5’-gcgccggtcgacagcatttacttcaaaggc-3’（下劃線部分為sali酶切位點(diǎn)，5’端6位是酶切保護(hù)堿基）。
（3）用t4dna連接酶將擴(kuò)增的啟動(dòng)子和信號(hào)肽序列連接，構(gòu)建得到包含啟動(dòng)子和信號(hào)肽的dna序列組件（pgrac-phodcassette），如seqidno.13所示。
實(shí)施例2構(gòu)建枯草芽孢桿菌整合載體
1、構(gòu)建重組質(zhì)粒pdgief-psphoddhaa31
（1）從genbankdatabase數(shù)據(jù)庫(kù)中下載編碼質(zhì)粒pdgief的基因序列（序列號(hào)為dq358863.1），將質(zhì)粒pdgief在genaraycompany合成（shanghaigeneraybiotechco.,ltd），即為宿主廣泛性質(zhì)粒pdgief。
（2）以重組質(zhì)粒pmd18t-dhaa31為模板，應(yīng)用引物dhaa31-fw/dhaa31-rv進(jìn)行pcr擴(kuò)增獲得外源基因dhaa31；擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)過(guò)雙酶切處理后，插入到質(zhì)粒pdgief的sali/noti位點(diǎn)，構(gòu)建得到重組質(zhì)粒pdgief-dhaa31。
pcr程序如下：98℃，10min；98℃，10s；55℃，10s；72℃，15s，進(jìn)行30個(gè)循環(huán)；72℃，3min。
引物dhaa31-fw（序列如seqidno.14所示）：
5’-atccgcgtcgacatgtcagaaattggcacaggctttccgtttg-3’（下劃線部分是sali酶切位點(diǎn)）；
引物dhaa31-rv（序列如seqidno.15所示）：
5’-tattagcggccgcttaatgatggtgatgatgatgcagtgccggc-3’（下劃線部分為noti酶切位點(diǎn)）。
（3）應(yīng)用引物pgrac-fw/phod-rv從pgrac-sphoddna序列組件上pcr擴(kuò)增得到pgrac-sphodcassette，經(jīng)雙酶切處理后插入到重組質(zhì)粒pdgief-dhaa31的nhei/sali位點(diǎn)，構(gòu)建得到重組質(zhì)粒pdgief-psphoddhaa31（如圖1所示）。
2、構(gòu)建重組質(zhì)粒piefvpr-psphodhhec
（1）構(gòu)建重組質(zhì)粒piefvpr1（重組質(zhì)粒構(gòu)建方法詳見(jiàn)zhanetal,2006）：
1）以質(zhì)粒pdgief為載體，應(yīng)用引物maze-f和amp-rv擴(kuò)增質(zhì)粒載體上的maze-amp序列；
其中，引物maze-fw（序列如seqidno.16所示）：
5’-ttggcgcgcccgataaccagaagc-3’（下劃線部分為asci酶切位點(diǎn)）；
引物amp-rv1（序列如seqidno.17所示）：
5’-cgtggccaggcgcgccatgagtattcaac-3’（下劃線部分為agei酶切位點(diǎn)）。
2）應(yīng)用引物dr(up)-fw和dr(down)-rv擴(kuò)增質(zhì)粒載體上的dr-laci-mazf-spc-dr基因序列組件；
引物dr(up)-fw（序列如seqidno.18所示）：
5’-ggactagtaaaattgaaaaaatggtgg-3’（下劃線部分為spei酶切位點(diǎn)）；
引物dr(down)-rv（序列如seqidno.19所示）：
5’-cgacgcgtgatccccctatgcaagggtttattg-3’（下劃線部分為mlui酶切位點(diǎn)）。
3）應(yīng)用引物vpr(front)-fw和vpr(front)-rv從枯草芽孢桿菌基因組dna上擴(kuò)增vpr基因上游同源臂序列(vpr-front)；
引物vpr(front)-fw（序列如seqidno.20所示）：
5’-cgtggccaggatcattcgctttctgcttg-3’（下劃線部分為agei酶切位點(diǎn)）；
引物vpr(front)-rv（序列如seqidno.21所示）：
5’-ggactagtatccgactgtccagccgttcgg-3’（下劃線部分為spei酶切位點(diǎn)）。
4）應(yīng)用引物vpr(back)-fw和vpr(back)-rv從枯草芽孢桿菌基因組dna上擴(kuò)增vpr基因下游同源臂序列（vpr-back）；
引物vpr(back)-fw（序列如seqidno.22所示）：
5’-cgacgcgtcaataacaaagaagttgagc-3’（下劃線部分為mlui酶切位點(diǎn)）；
引物vpr(back)-rv（序列如seqidno.23所示）：
5’-ttggcgcgcccggtcaaaacctggcttgac-3’（下劃線部分為asci酶切位點(diǎn)）。
5）將上述擴(kuò)增的dna片段經(jīng)限制性內(nèi)切酶切處理后用t4dna連接酶進(jìn)行連接，得到重組質(zhì)粒piefvpr1。
（2）以pmd18t-hhec為模板，使用引物hhec-fw/hhec-rv進(jìn)行pcr擴(kuò)增，獲得外源基因hhec。pcr反應(yīng)程序同上。將擴(kuò)增片段進(jìn)行雙酶切處理后插入到piefvpr1（vpr基因位點(diǎn)整合質(zhì)粒）的sali/noti位點(diǎn)，構(gòu)建得到重組質(zhì)粒piefvpr-hhec。
引物hhec-fw（序列如seqidno.24所示）：
5’-atccgcgtcgacatgtctacagcaatcgttac-3’（下劃線部分為sali酶切位點(diǎn)）；
引物hhec-rv（序列如seqidno.25所示）：
5’-taatagcggccgcttaatgatgatgatgatgatgttcc-3’（下劃線部分為noti酶切位點(diǎn)）。
（3）應(yīng)用引物pgrac-fw/phod-rv從pgrac-sphoddna序列組件上pcr擴(kuò)增得到pgrac-sphodcassette，經(jīng)雙酶切處理后插入到質(zhì)粒piefvpr-hhec的nhei/sali位點(diǎn)，構(gòu)建得到重組質(zhì)粒piefvpr-psphodhhec（如圖1所示）。
3、構(gòu)建重組質(zhì)粒piefepr-psphodecha
（1）構(gòu)建重組質(zhì)粒piefepr2
1）以pdgief為載體，應(yīng)用引物maze-fw和amp-rv2擴(kuò)增質(zhì)粒載體上的maze-amp序列；
引物maze-fw（序列如seqidno.26所示）：
5’-ttggcgcgcccgataaccagaagc-3’（下劃線部分為asci酶切位點(diǎn)）；
引物amp-rv2（序列如seqidno.27所示）：
5’-cgacgcgtggcgcgccatgagtattcaac-3’（下劃線部分為mlui酶切位點(diǎn)）。
2）應(yīng)用引物dr(up)-fw2和dr(down)-rv2擴(kuò)增質(zhì)粒載體上的dr-laci-mazf-spc-dr基因序列組件；
引物dr(up)-fw2（序列如seqidno.28所示）：
5’-caggacgtccaaaattgaaaaaatggtgg-3’（下劃線部分為sbfi酶切位點(diǎn)）；
引物dr(down)-rv2（序列如seqidno.29所示）：
5’-cgaggcctgatccccctatgcaagggtttattg-3’（下劃線部分為bspei酶切位點(diǎn)）。
3）應(yīng)用引物epr(front)-fw和epr(front)-rv從枯草芽孢桿菌基因組dna上擴(kuò)增epr基因上游同源臂序列(epr-front)；
引物epr(front)-fw（序列如seqidno.30所示）：
5’-cgacgcgttgtatcagtcactctg-3’（下劃線部分為mlui酶切位點(diǎn)）；
引物epr(front)-rv（序列如seqidno.31所示）：
5’-caggacgtcctggctccgataatccctgcgac-3’（下劃線部分為sbfi酶切位點(diǎn)）。
4）應(yīng)用引物epr(back)-fw和epr(back)-rv從枯草芽孢桿菌基因組dna上擴(kuò)增vpr基因下游同源臂序列（epr-back）；
引物epr(back)-fw（序列如seqidno.32所示）：
5’-cgaggcctttcaaagtcttctccaagg-3’（下劃線部分為bspei酶切位點(diǎn)）；
引物epr(back)-rv（序列如seqidno.33所示）：
5’-ttggcgcgcccgtcttcaaattggtgctcttcac-3’（下劃線部分為asci酶切位點(diǎn)）。
5）將上述擴(kuò)增的dna片段經(jīng)酶切處理后用t4dna連接酶進(jìn)行連接，得到重組質(zhì)粒piefepr2。
（2）以pmd18t-echa為模板，應(yīng)用引物echa-fw/echa-rv對(duì)外源基因echa進(jìn)行pcr擴(kuò)增。pcr擴(kuò)增程序同上。將擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行雙酶切處理，插入到piefepr2（epr基因位點(diǎn)整合質(zhì)粒）的sali/noti位點(diǎn)，構(gòu)建得到重組質(zhì)粒piefepr-echa。
引物echa-fw（序列如seqidno.34所示）：
5’-atccgcgtcgacatgacgattcgccgccctgaagattttaaac-3’（下劃線部分為sali酶切位點(diǎn)）；
引物echa-rv（序列如seqidno.35所示）：
5’-ttatagcggccgcttaatgatgatgatgatgatgtctgaatgc-3’（下劃線部分為noti酶切位點(diǎn)）。
（3）應(yīng)用引物pgrac-fw/phod-rv從pgrac-sphoddna序列組件上pcr擴(kuò)增得到pgrac-sphodcassette，經(jīng)雙酶切處理后插入到質(zhì)粒piefepr-echa的nhei/sali位點(diǎn)，構(gòu)建得到重組質(zhì)粒piefepr-psphodecha（如圖1所示）。
實(shí)施例3構(gòu)建枯草芽孢桿菌工程菌
1、將上述構(gòu)建的枯草芽孢桿菌整合載體轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞，提取重組質(zhì)粒（如圖2和3所示）：
（1）重組質(zhì)粒pdgief-psphoddhaa31轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞，提取重組質(zhì)粒，通過(guò)化學(xué)轉(zhuǎn)化法將重組質(zhì)粒pdgief-psphoddhaa31線性化后，轉(zhuǎn)化枯草芽孢桿菌感受態(tài)細(xì)胞，重組質(zhì)粒與宿主基因組發(fā)生雙交換同源重組，將目的基因整合至基因組amye位點(diǎn)。從含有壯觀霉素的lb平板上挑選陽(yáng)性克隆，將其接種到10mllb培養(yǎng)基中，37℃，200rpm培養(yǎng)24h，將培養(yǎng)物稀釋，涂布于含有0.1mmiptg的固體lb平板，篩選出iptgs和spcr的單菌落，即為含有外源基因dhaa31的工程菌，命名為b.subtilis168-1。
（2）采用同樣的方法，將鹵醇脫鹵酶基因（hhec）和環(huán)氧化物水解酶基因（echa）依次整合到工程菌b.subtilis168-1基因組的vpr和epr位點(diǎn)，構(gòu)建得到工程菌b.subtilis168-2，工程菌b.subtilis168-3。
2、將上述工程菌在lb培養(yǎng)基中培養(yǎng)24h，收集上清液，用超濾管進(jìn)行濃縮。
westernblot分析，結(jié)果表明上清中含有目的蛋白，其分子量與預(yù)測(cè)的蛋白分子量大小一致（如圖4所示）。該結(jié)果證明，以上所述的3種基因在枯草芽孢桿菌中表達(dá)并分泌到胞外。
實(shí)施例4應(yīng)用枯草芽孢桿菌工程菌降解1，2，3-三氯丙烷
1、工程菌b.subtilis168-3在lb液體培養(yǎng)基中過(guò)夜培養(yǎng)，然后經(jīng)過(guò)5000g，10min離心處理，收集菌體，用mmy培養(yǎng)基洗2次，重懸菌體，將重懸后的菌液接種到含有10mm葡萄糖的50mlmmy培養(yǎng)基中，初始o(jì)d600=0.05，分別加入1，2，3-三氯丙烷（tcp）、2，3-二氯-1-丙醇（dcp）和環(huán)氧氯丙烷（ech）至終濃度為2mm。37℃，220rpm條件下培養(yǎng)。在固定的時(shí)間間隔內(nèi)提取1ml反應(yīng)液，加入含有0.05mm正己醇的丙酮溶液（1：1），通過(guò)gc-ms色譜分析儀檢測(cè)樣品中的化合物成分及濃度。
2、化合物的濃度通過(guò)gc-ms色譜分析儀進(jìn)行檢測(cè)分析。樣品從反應(yīng)液中提取后加入含有0.05mm正己醇的丙酮溶液（1：1），取1ul樣品進(jìn)行g(shù)c分析。所用載氣是氦氣，升溫程序如下：45℃，2min；然后以5℃/min的速度升到100℃，保持1min；再以20℃/min升到220℃，保持2min。用cd-acidwax（30m×0.25mm×0.25um）毛細(xì)管柱對(duì)化合物進(jìn)行分離，并通過(guò)agilenttechnologies7890a（gcsystem）氣象色譜分析儀所配的5975msd質(zhì)譜檢測(cè)器進(jìn)行檢測(cè)。
3、結(jié)果
枯草芽孢桿菌工程菌b.subtilis168-3對(duì)1，2，3-三氯丙烷的耐受性如圖5所示。枯草芽孢桿菌工程菌培養(yǎng)上清粗酶液對(duì)1，2，3-三氯丙烷的降解結(jié)果如圖6所示。枯草芽孢桿菌工程局菌對(duì)1，2，3-三氯丙烷、2，3-二氯-1-丙醇和環(huán)氧氯丙烷的降解作用如圖7所示。
結(jié)果顯示，在培養(yǎng)25天后，工程菌可以完全降解培養(yǎng)基中的1，2，3-三氯丙烷、2，3-二氯-1-丙醇和環(huán)氧氯丙烷（2mm）。說(shuō)明構(gòu)建的枯草芽孢桿菌工程菌可以降解1，2，3-三氯丙烷及其中間產(chǎn)物，實(shí)現(xiàn)1，2，3-三氯丙烷的完全礦化。
sequencelisting
<110>中山大學(xué)
<120>一種用枯草芽孢桿菌工程菌降解1，2，3-三氯丙烷的方法
<130>
<160>35
<170>patentinversion3.3
<210>1
<211>882
<212>dna
<213>合成的鹵烷脫鹵酶基因（dhaa31）
<400>1
atgtcagaaattggcacaggctttccgtttgatccgcattatgttgaagttctgggcgaa60
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tgcattgcaccggatctgattggcatgggcaaatcagataaaccggatctggattacttc240
tttgatgatcatgttcgatacctggatgctttcattgaagcactgggcctggaagaagtt300
gttctggttattcatgattggggctcagcactgggctttcattgggcaaaaagaaatccg360
gaaagagttaaaggcattgcttgtatggagtttattagaccgtttccgacatgggatgaa420
tggccggaatttgcaagagaaacatttcaagcgtttagaacagcagatgttggcagagaa480
ctgattattgatcaaaatgcttttattgaaggcgcactgccgaaatatgttgttagaccg540
ctgacagaagttgagatggatcattatagagaaccgtttctgaaaccggttgatagagaa600
ccgctgtggagatttccgaacgagctgccgattgcaggcgaaccggcaaatattgttgca660
ctggttgaagcatatatgaattggctgcatcaatcaccggttccgaaactgctgttttgg720
ggcacaccgggctttattattccgccggcagaagcagcaagactggcagaatcactgccg780
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ctgattggctcagaaattgcaagatggctgccggcactgtaa882
<210>2
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<212>prt
<213>鹵烷脫鹵酶（haloalkanedehalogenase,dhaa31）
<400>2
metsergluileglythrglyphepropheaspprohistyrval
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gluvalleuglygluargmethistyrvalaspvalglyproarg
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aspglythrprovalleupheleuhisglyasnprothrserser
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cysilealaproaspleuileglymetglylysserasplyspro
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asptrpglyseralaleuglyphehistrpalalysargasnpro
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gluargvallysglyilealacysmetglupheileargprophe
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prothrtrpaspglutrpprogluphealaarggluthrphegln
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alapheargthralaaspvalglyarggluleuileileaspgln
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asnalapheilegluglyalaleuprolystyrvalvalargpro
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leuthrgluvalglumetasphistyrargglupropheleulys
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provalasparggluproleutrpargpheproasngluleupro
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ilealaglygluproalaasnilevalalaleuvalglualatyr
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metasntrpleuhisglnserprovalprolysleuleuphetrp
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glythrproglypheileileproproalaglualaalaargleu
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alagluserleuproasncyslysthrvalaspileglyprogly
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leuhispheleuglngluaspasnproaspleuileglyserglu
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ilealaargtrpleuproalaleu
290
<210>3
<211>765
<212>dna
<213>合成的鹵醇脫鹵酶基因（hhec）
<400>3
atgtctacagcaatcgttacaaatgttaaacattttggcggcatgggctcagcacttcgc60
cttagcgaagcaggacatacggttgcttgtcatgatgagtcttttaaacaaaaagatgaa120
cttgaagcatttgcagaaacgtatcctcaacttaaacctatgtcagaacaagaaccggca180
gaactgatcgaagcagttacgtcagcctacggacaagttgatgttctggtttctaatgac240
atctttgcacctgaatttcaaccgatcgataaatatgcagttgaagattatcgtggagca300
gttgaagcacttcaaattcgcccgtttgcactggttaatgcagttgcatctcagatgaaa360
aaacgcaaatcaggccatattatctttatcacgagcgcaacaccgtttggaccgtggaaa420
gaactgtccacttatacgagcgcacgcgcaggcgcatctacgctggcaaatgcactgtct480
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gaagatagcccttatttttatccgacggaaccgtggaaaacgaatcctgaacatgttgca600
catgttaaaaaagttacagcacttcaacgcttaggcacacaaaaagaattgggcgaactt660
gttgcatttctggcaagcggctcttgcgattatctgacgggccaagtattttggctggct720
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<210>4
<211>254
<212>prt
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metserthralailevalthrasnvallyshispheglyglymet
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glyseralaleuargleuserglualaglyhisthrvalalacys
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leuvalserasnaspilephealaproglupheglnproileasp
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lystyralavalgluasptyrargglyalavalglualaleugln
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ileargprophealaleuvalasnalavalalaserglnmetlys
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pheglyprotrplysgluleuserthrtyrthrseralaargala
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glyalaserthrleualaasnalaleuserlysgluleuglyglu
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tyrasnileprovalphealaileglyproasntyrleuhisser
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progluhisvalalahisvallyslysvalthralaleuglnarg
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leuglythrglnlysgluleuglygluleuvalalapheleuala
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<213>合成的環(huán)氧化物水解酶（echa）基因
<400>5
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<212>prt
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metthrileargargprogluaspphelyshistyrgluvalgln
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thrleuleuleuleuhisglytrpproglyphetrptrpglutrp
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<213>包含啟動(dòng)子和信號(hào)肽的dna序列組件pgrac-phodcassette
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agctattgtaacataatcggtacgggggtgaaaaagctaacggaaaagggagcggaaaag60
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attataagaatagcggaattgtgagcggataacaattcccaattaaaggaggaaggatcc180
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<400>26
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<211>29
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<211>29
<212>dna
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caggacgtccaaaattgaaaaaatggtgg29
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<211>33
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cgaggcctgatccccctatgcaagggtttattg33
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<400>30
cgacgcgttgtatcagtcactctg24
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caggacgtcctggctccgataatccctgcgac32
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cgaggcctttcaaagtcttctccaagg27
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