本發(fā)明涉及微生物領域，提供一種內生真菌，確切的說，是一種麝香霉菌株，該菌株具有良好的抑菌活性，尤其是抑制植物病原真菌生長的活性。

背景技術：

麝香霉(muscodorsp.)，之前有命名為產氣霉，是一類屬于炭角菌科的內生真菌，最早由worapong等(2001)從肉桂樹分離所得，人們利用其特有的形態(tài)學、生理學、生物化學方面的特征及核糖體rna的序列來尋找和鑒定新的麝香霉屬內生真菌，其顯著特征是能產生揮發(fā)性有機化合物(volatileorganiccompounds，簡稱vocs)，這些vocs具有廣泛的生物活性，能抑制或殺死許多病原真菌、病原細菌和一些昆蟲，然而不同的菌株，其活性效果不同。由于麝香霉能產生有廣泛抑菌活性的vocs，科學家們利用gc-ms等化學分析手段分離鑒定了麝香霉產生的vocs成分，發(fā)現不同菌株產生的vocs成分不盡相同，其活性效果與其vocs成分相關。

技術實現要素：

本發(fā)明要解決的技術問題是提供一種麝香霉菌株及其用途。

為了解決上述技術問題，本發(fā)明提供一種麝香霉菌muscodorsp.w-s-41，為muscodorsp.w-s-41，其保藏號為：cctccno：m2016759。

本發(fā)明還同時提供了上述麝香霉菌muscodorsp.w-s-41的用途：抑制植物病原真菌。

作為本發(fā)明的麝香霉菌muscodorsp.w-s-41的用途的改進：所述麝香霉菌muscodorsp.w-s-41用于抑制病原菌---灰葡萄孢霉zau10(botrytiscinerea)，抑菌率為100％；用于抑制病原菌---擬盤多毛孢zau21(pestalotiopsissp.)，抑制率為44.44％；用于抑制病原菌---鐮刀菌zau28(fusariumsp.)，抑制率為76.77％；用于抑制病原菌---青霉菌株kh08(penicilliumdigitatum)，抑制率為100％；用于抑制病原菌---終極腐霉zau22(pythiumultimum)，抑制率為100％。

作為本發(fā)明的麝香霉菌muscodorsp.w-s-41的用途的改進：制備成能抑制植物病原真菌的菌劑。該菌劑由活性載體制劑和穩(wěn)定劑組成；所述活性載體制劑包含固體載體、培養(yǎng)基和活菌，所述活菌為麝香霉菌muscodorsp.w-s-41。

本發(fā)明的麝香霉菌muscodorsp.w-s-41，保藏名稱為：muscodorsp.w-s-41，保藏單位：中國典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏地址：中國武漢武漢大學；保藏日期：2016年12月16日，保藏號：cctccno：m2016759。

本發(fā)明的麝香霉菌株，相比已有報到的麝香霉菌株，具有更強烈的抑菌活性，其產生的vocs對多數真菌具有抑制效果，其作為生物防治制劑具有很大的應用潛力。

本發(fā)明的另一優(yōu)點是：利用真菌產生的vocs來控制農作物生產過程中的病原微生物，具有對非靶標生物無毒害，不污染環(huán)境，不破環(huán)生態(tài)平衡，不會誘導有害微生物、病毒及昆蟲等產生抗藥性。

附圖說明

下面結合附圖對本發(fā)明的具體實施方式作進一步詳細說明。

圖1為麝香霉菌muscodorsp.w-s-41菌落圖。

具體實施方式

下面結合具體實施例對本發(fā)明進行進一步描述，但本發(fā)明的保護范圍并不僅限于此。

材料：

病原指示菌包括：灰葡萄孢霉zau10(botrytiscinerea)、鐮刀菌zau28(fusariumsp.)、擬盤多毛孢zau21(pestalotiopsissp.)、青霉菌株kh08(penicilliumdigitatum)、終極腐霉zau22(pythiumultimum)。

上述病原指示菌在如下文章中有告知：yuanzl,linfc,zhangcl*,kubicekcp.anewspeciesofharpophora(magnaporthaceae)recoveredfromhealthywildrice(oryzagranulata)roots,representinganovelmemberofbeneficialdarkseptateendophyte.femsmicrobiologyletters,2010,307(1):94-101.

本發(fā)明所涉及的儀器包括超凈工作臺、恒溫培養(yǎng)箱、電子天平、ph計、烘箱、電磁爐、微波爐、冰箱、真空干燥箱、、mls3750型高壓滅菌鍋、bs233s型分析天平等。

本發(fā)明涉及四種培養(yǎng)基，分別為pda培養(yǎng)基、pdb培養(yǎng)基、2％麥芽汁瓊脂培養(yǎng)基和冷凍保存培養(yǎng)基，其配制方法分別如下：

pda培養(yǎng)基(馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基)：土豆200g，葡萄糖20g，瓊脂1.5％，自來水1000ml。取定量土豆切成均勻小塊，加水煮沸20分鐘至土豆易成土豆泥，8層紗布過濾，加入20g葡萄糖，冷卻，加自來水定容至1000ml，三角瓶裝1.5％的瓊脂，加入液體，封裝，121℃、15min高壓滅菌待用。

pdb培養(yǎng)基(馬鈴薯葡萄糖培養(yǎng)基)：土豆200g，葡萄糖20g，自來水1000ml。取定量土豆切成均勻小塊，加水煮沸20分鐘至土豆易成土豆泥，8層紗布過濾，加入20g葡萄糖，冷卻，加自來水定容至1000ml，封裝，121℃、15min高壓滅菌待用。

2％麥芽汁瓊脂培養(yǎng)基(maltextractagar,mea)：在麥芽浸出粉20g、瓊脂20g中加蒸餾水定容至1000ml；然后進行常規(guī)的高溫滅菌(1.1個大氣壓，121℃下滅菌20min)。

冷凍保存培養(yǎng)基(液體)：葡萄糖10g，酵母提取物1g，酶解酪蛋白0.5g，酸水解酪蛋白0.5g，丙三醇(甘油)180ml。用蒸餾水將葡萄糖、酵母提取物、酶解酪蛋白和酸水解酪蛋白溶解后，再加入甘油、最后用蒸餾水定容至1000ml，121℃、滅菌20min。

實施例1、

1、muscodorsp.w-s-41菌株的分離獲得

從我國云南納板河采集野生狀態(tài)下的藎草，將采集的藎草用自來水漂洗干凈，藎草葉鞘在75％(v/v)酒精溶液中消毒30秒，然后在1％(v/v)次氯酸鈉溶液中消毒10分種，無菌水漂洗3次。用無菌刀片將根切成約0.6cm長的片段，置于含50μg·ml^-1氨芐青霉素和50μg·ml^-1鏈霉素的2％麥芽汁瓊脂培養(yǎng)基(mea)平皿上，25℃暗培養(yǎng)，待菌絲長出后，將菌絲頂端移接到pda培養(yǎng)基；分離得到菌落白色，呈輻射狀蔓延，25℃暗培養(yǎng)，在pda培養(yǎng)基上連續(xù)三次接種，確認為單菌落，沒有其他真菌或者細菌共同生長，認為是獲得純培養(yǎng)，命名為muscodorsp.w-s-41。

該菌株在培養(yǎng)皿上致密呈白色，呈輻射狀蔓延，如圖1所示，圖1為麝香霉菌株muscodorsp.w-s-41在pda生長7天的菌落正面照片，菌絲白色，呈輻射狀生長。生長數月后出現炭角菌科菌株的典型特征：從菌落中心處開始出現黑色炭化菌絲的菌株。

1.2、菌株的鑒定

1.2.1基因組dna提取

將菌株muscodorsp.w-s-41接種在pda平板上25℃黑暗培養(yǎng)一周。用接種針挑取少量菌絲塊于1.5ml無菌離心管中，放入直徑1mm和5mm的鋼珠各5粒，在液氮中浸泡1分鐘，隨后在jxfstprp冷凍研磨機(上海凈信科技有限公司)上充分研磨樣品。使用真菌基因組dna快速提取試劑盒(axygen)進行提取muscodorsp.w-s-41基因組dna。加入400μlap1和4μlrnasea(10mg/ml)，漩渦振蕩。隨后在65℃水浴孵育20分鐘，充分裂解樣本。加入130μlap2，充分混勻，在冰浴上放置5分鐘。14,000rpm離心8分鐘，小心吸取上清液到一個新的1.5ml無菌離心管中，加入1.5倍體積的ap3/e，用槍頭進行吹打混勻得到混合液，先加650μl混合液加入一個吸附柱ac中(吸附柱放在收集管中)，13,000rpm離心40秒，倒掉收集管中的廢液，重復上述步驟直至加完所有混合液。在吸附柱中加入600μl漂洗液wb，12,000rpm離心30秒，棄廢液。將吸附柱ac重新放回收集管中，13,000rpm離心2分鐘，盡量出去殘留的漂洗液。取出吸附柱ac放入新的1.5ml無菌離心管中，在吸附膜的中間部位加入100μl洗脫緩沖液eb，室溫放置5分鐘，12,000rpm離心1分鐘，即獲得dna樣品，在-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2pcr擴增

對菌株muscodorsp.w-s-41的核糖體轉錄間隔區(qū)(its)基因序列進行測定。菌株muscodorsp.w-s-41的its基因的pcr正向擴增引物its1-f：tccgtaggtgaacctgcgg，反向擴增引物its4：tcctccgcttattgatatgc，its基因的pcr擴增反應條件為：94℃預變性2分鐘；94℃變性30秒，55℃退火40秒，72℃延伸50秒，35次循環(huán)；最后72℃延伸10分鐘。

表1、50μlpcr反應體系

2xestaqmastermix購自vazyme公司，含有estaqdnapolymerase，2xestaqpcrbuffer，3mmmgcl2和400μmdntpmix。

1.2.3pcr產物的純化(用axyprepdnagelextractionkit試劑盒進行純化)

1)在紫燈下切下含有目的dna的瓊脂糖凝膠，用紙巾吸盡凝膠表面液體并切碎。計算凝膠重量(提前記錄1.5ml離心管重量)，該重量作為一個凝膠體積(如100mg＝100ul體積)。

2)加入3個(本發(fā)明中使用300μl)凝膠體積的bufferde-a，混合均勻后于75℃加熱，間斷混合(每2-3min)，直至凝膠塊完全熔化(約6分鐘)。注：bufferde-a為紅色液體。在熔化凝膠過程中，可以幫助觀察凝膠是否完全熔化。

3)加0.5個bufferde-a體積的bufferde-b(即，加入150μl的bufferde-b)，混合均勻。當分離的dna片段小于400bp時，需再加入1個凝膠體積的異丙醇。注：加bufferde-b后混合物顏色變?yōu)辄S色，充分混勻以保證形成均一的黃色溶液。備注說明：根據引物設計位點，nsa3-nlc2擴增產物片段大小為950bp，nsi1-nlb4的擴增產物片段約800bp，其他的引物的擴增產物大小為200-250bp。

4)吸取步驟3)中的混合液，轉移到dna制備管(原始狀態(tài)時，該dna制備管被置于2ml(試劑盒內提供)離心管)中，12000g離心1min。棄濾液。

5)將制備管置回2ml離心管，加500μl的bufferw1，12000g離心30s，棄濾液。

6)將制備管置回2ml離心管，加700μl的bufferw2，12000g離心30s，棄濾液。以同樣的方法再加700μl的bufferw2洗滌一次，12000g離心1min。注：(a)確認在bufferw2concentrate中已按試劑瓶上的指定體積加入無水乙醇。(b)兩次使用bufferw2沖洗能確保鹽分被完全清除，消除對后續(xù)實驗的影響。

7)將制備管置回2ml離心管中，12000g離心1min。

8)將dna制備管置于潔凈的1.5ml離心管(試劑盒內提供)中，在dna制備管的過濾膜中央加25-30ul的eluent或去離子水，室溫靜置1min。12000g離心1min(收集過濾液，濾液中含的就是pcr的擴增產物)。洗脫dna。

將純化好的pcr產物送至生工生物工程(上海)有限公司進行測序，得到序列如seqidno:1所示。測序結果在genbank數據庫中進行同源序列搜索以進一步確定其分類地位。將以上序列上傳到ncbi中進行比對，得出菌株muscodorsp.w-s-41的分類地位，該菌株為麝香霉菌(muscodorsp.)，屬于真菌界fungi，子囊菌門ascomycota，糞殼菌綱sordariomycetes，炭角菌目xylariales，炭角菌科xylariaceae。

1.3muscodorsp.w-s-41菌株的保藏和保存

將上述所得的菌株進行了如下保藏：保藏名稱為：muscodorsp.w-s-41，保藏單位：中國典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏地址：中國武漢武漢大學；保藏日期：2016年12月16日，保藏號：cctccno：m2016759。

1.3.1muscodorsp.w-s-41菌株的常溫或低溫保存

在超凈工作臺，于2ml無菌冷凍保存管加入不超過1.5ml融化的pda培養(yǎng)基，蓋上冷凍保存管蓋子，傾斜放置。待凝固后，將要保存的muscodorsp.w-s-41菌株接種到斜面培養(yǎng)基，數天后，muscodorsp.w-s-41菌絲成功定殖于斜面，可見新鮮的菌絲長出，加入經3次高壓滅菌的石蠟將菌絲淹沒，蓋上冷凍保存管蓋子，于常溫下或10℃冰箱保存。使用時，用無菌接種針挑取菌組織，接種于平板pda培養(yǎng)基上與25℃培養(yǎng)箱內進行活化。

1.3.2muscodorsp.w-s-41菌株的冷凍保存

當muscodorsp.w-s-41在pda平板上生長旺盛期，置于超凈工作臺上，將pda上的菌落挖取4-5塊菌塊，置于2ml無菌冷凍保存管，加入高壓滅菌的冷凍保存液，將muscodorsp.w-s-41菌塊淹沒。蓋上冷凍保存管蓋子，將冷凍保存管依次于4℃和-20℃下放置1h后，轉移至-80℃超低溫冰箱中進行長期保存；或者使用程序降溫儀，使其不至于細胞內結冰，將組織溫度降到適于-80℃超低溫冰箱保存。使用時，于室溫中自然解凍，挑取其中的菌塊接種于平板pda培養(yǎng)基上進行活化。

實驗1、麝香霉菌株muscodorsp.w-s-41對灰葡萄孢霉的抑菌作用

muscodorsp.w-s-41菌株產生揮發(fā)性氣體的抑菌活性測定

采用二分隔平皿對峙培養(yǎng)法測定麝香霉菌muscodorsp.w-s-41、muscodorsp.zjlq023(保藏編號cgmcc2862)、muscodorsp.zjlq024(保藏編號cgmcc2863)和muscodorsp.zjlq070(保藏編號cgmcc2864)產生的揮發(fā)氣體對以上病原菌灰葡萄孢霉zau10(botrytiscinerea)的抑制作用。

用外徑0.5cm的打孔器在菌落邊緣打孔，用牙簽挑取4株麝香霉菌塊分別接種在二分隔培養(yǎng)皿的一側，用兩層parafilm封口膜封口，并置于25℃下黑暗培養(yǎng)4天。4天后，將病原菌灰葡萄孢霉zau10(botrytiscinerea)菌塊接種于二分隔培養(yǎng)皿的另一側，同樣用兩層parafilm封口膜封口，置于25℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，根據病原菌灰葡萄孢霉zau10(botrytiscinerea)生長速度控制培養(yǎng)時間，正常速度生長的病原菌7天左右。測量對照和實驗組中病原菌灰葡萄孢霉zau10(botrytiscinerea)的菌落直徑，然后計算出抑菌率。將與麝香霉菌株muscodorsp.w-s-41、muscodorsp.zjlq023、muscodorsp.zjlq024和muscodorsp.zjlq070對峙培養(yǎng)后的病原菌復接到普通pda平板上，觀察灰葡萄孢霉zau10的生長情況，以確定是否真正被麝香霉徹底殺死，也可以判斷對病原的抑菌活性。

表2：麝香霉菌株muscodorsp.w-s-41、muscodorsp.zjlq023、muscodorsp.zjlq024和muscodorsp.zjlq070與灰葡萄孢霉zau10(botrytiscinerea)的二分隔平皿對峙培養(yǎng)結果

備注說明：是否復活是對峙培養(yǎng)后的病原菌重新接到pda培養(yǎng)基上，以觀察病原菌是否徹底被殺死，zjlq024、zjlq070上的灰葡萄孢霉在復接后，在新的培養(yǎng)基上可以重新生長，證明其在和zjlq024、zjlq070的對峙中只是被zjlq024、zjlq070抑制，而沒有被殺死，所以復接后存活，因此判斷zjlq024、zjlq070的抑菌效果沒有w-s-41好，因為w-s-41不僅僅抑制病原菌，還殺死了病原菌。

灰葡萄孢霉可以引起多種植物的灰霉病，是植物常見的病原菌，在黃瓜、番茄、茄、辣椒、萵筍、菠菜等農產品上特別容易造成病害，病害常見有苗期、成株期和果期灰霉病，會造成農作物減產，影響食用價值和經濟價格，嚴重的甚至會造成農作物死亡?；移咸焰呙箊au10在不含麝香霉菌的pda平皿正常生長，而在含麝香霉菌株muscodorsp.w-s-41、muscodorsp.zjlq024、muscodorsp.zjlq070的pda平皿不生長、muscodorsp.zjlq023的pda平皿生長減緩，從表2中對病原菌灰葡萄孢霉zau10的抑制率和復活情況來看，抑菌率順序為muscodorsp.w-s-41>muscodorsp.zjlq024、muscodorsp.zjlq070>muscodorsp.zjlq023。

本實驗以上結果表明，麝香霉菌株muscodorsp.w-s-41，在抑制灰霉病的病原菌灰葡萄孢霉上有強烈抑制作用，抑制率達100％，可徹底殺死病原菌，用制成的菌劑的麝香霉菌株muscodorsp.w-s-41，尤其是活性載體制劑，完全可以作為防治黃瓜、番茄、茄、辣椒、萵筍、菠菜等農產品的灰霉病。

實驗二、麝香霉菌muscodorsp.w-s-41對擬盤多毛孢zau21(pestalotiopsissp.)的抑菌作用

本實驗選用擬盤多毛孢zau21(pestalotiopsissp.)作為病原菌，同樣采用二分隔平皿對峙培養(yǎng)法測定麝香霉菌株muscodorsp.w-s-41揮發(fā)性氣體對擬盤多毛孢zau21(pestalotiopsissp.)的抑制作用，同樣選用麝香霉菌株muscodorsp.w-s-41、muscodorsp.zjlq023、muscodorsp.zjlq024和muscodorsp.zjlq070一起進行試驗，其余等同于實驗一；得到如下表3結果：

表3：麝香霉菌株muscodorsp.w-s-41、muscodorsp.zjlq023、muscodorsp.zjlq024和muscodorsp.zjlq070與擬盤多毛孢zau21(pestalotiopsissp.)的二分隔平皿對峙培養(yǎng)結果

擬盤多毛孢屬是半知菌類的一個無性型內生真菌屬，可以侵染部分園林植物和經濟作物，如金合歡、槭樹、芍藥、羅漢松、橡膠、蘋果、芒果等植物，引起植物小葉從葉尖向內褪為白色，病健交界處或葉尖現褐紅色寬帶，寬約2～3mm有的在小葉中央生灰白色病斑，長1～2cm，葉面散生稀疏的瘡痂狀小黑點，形成典型葉斑病。擬盤多毛孢病菌以菌絲體或分生孢子在病葉上越冬。每年4～9月發(fā)病，多從傷口侵入。夏季高溫造成灼傷，有利于該病害的侵染。春季發(fā)生不重，夏季則發(fā)生較重，生長衰弱的植株易發(fā)病。

擬盤多毛孢zau21pestalotiopsissp.在不含麝香霉菌的pda平皿正常生長，而在含麝香霉菌株muscodorsp.w-s-41、muscodorsp.zjlq024、muscodorsp.zjlq070、muscodorsp.zjlq023的pda平皿生長減緩，從表2中對病原菌擬盤多毛孢zau21pestalotiopsissp.的抑制率和復活情況來看，抑菌率順序為muscodorsp.w-s-41>muscodorsp.zjlq023>muscodorsp.zjlq024>muscodorsp.zjlq070。

本實驗以上結果表明，麝香霉菌株muscodorsp.w-s-41，在抑制葉斑病的病原菌擬盤多毛孢zau21pestalotiopsissp.上有較好抑制作用，抑制率達44.44％，用麝香霉菌株muscodorsp.w-s-41制成的菌劑，尤其是活性載體制劑，可以作為防治金合歡、槭樹、芍藥、羅漢松、橡膠、蘋果、芒果等園林植物和經濟作物上由擬盤多毛孢引起的葉斑病。

實驗三、麝香霉菌株muscodorsp.w-s-41對鐮刀菌zau28(fusariumsp.)的抑菌作用

本實驗選用鐮刀菌zau28(fusariumsp.)作為病原菌，同樣采用二分隔平皿對峙培養(yǎng)法測定麝香霉菌株muscodorsp.w-s-41揮發(fā)性氣體對鐮刀菌zau28(fusariumsp.)的抑制作用，同樣選用麝香霉菌株muscodorsp.w-s-41、muscodorsp.zjlq023、muscodorsp.zjlq024和muscodorsp.zjlq070一起進行試驗，其余等同于實驗一；得到如下表4結果：

表4：麝香霉菌株muscodorsp.w-s-41、muscodorsp.zjlq023、muscodorsp.zjlq024和muscodorsp.zjlq070與鐮刀菌zau28(fusariumsp.)的二分隔平皿對峙培養(yǎng)結果

鐮刀菌無性時期原屬于半知菌亞門，有性時期為子囊菌亞門，它不僅可以在土壤中越冬越夏，還可侵染多種植物(糧食作物、經濟作物、藥用植物及觀賞植物)，引起植物的枯萎、根腐、莖腐、莖基腐、花腐和穗腐等多種病害，寄主植物達100余種，侵染寄主植物維管束系統(tǒng)，破壞植物的輸導組織維管束，并在生長發(fā)育代謝過程中產生毒素危害作物，造成作物萎蔫死亡，影響產量和品質，是生產上防治最艱難的重要病害之一。

鐮刀菌zau28fusariumsp.在不含麝香霉菌的pda平皿正常生長，而在含麝香霉菌株muscodorsp.w-s-41、muscodorsp.zjlq024、muscodorsp.zjlq070、muscodorsp.zjlq023的pda平皿生長減緩，從表4中對病原菌鐮刀菌zau28fusariumsp.的抑制率和復活情況來看，抑菌率順序為muscodorsp.w-s-41>muscodorsp.zjlq024>muscodorsp.zjlq023>muscodorsp.zjlq070，muscodorsp.w-s-41較其他報道的已知菌對鐮刀菌zau28fusariumsp.的抑菌效果好。

本實驗以上結果表明，麝香霉菌株muscodorsp.w-s-41，在抑制枯萎病和根腐病的病原菌鐮刀菌zau28fusariumsp.上有較好抑制作用，抑制率達76.77％，用麝香霉菌株muscodorsp.w-s-41制成的菌劑，尤其是活性載體制劑，可以作為防治由鐮刀菌zau28fusariumsp.引起的枯萎病和根腐病等。

實驗四、麝香霉菌株muscodorsp.w-s-41對青霉菌株kh08(penicilliumdigitatum)的抑菌作用

本發(fā)明選用青霉菌株kh08(penicilliumdigitatum)作為病原菌，同樣采用二分隔平皿對峙培養(yǎng)法測定麝香霉菌株muscodorsp.w-s-41揮發(fā)性氣體對青霉菌株kh08(penicilliumdigitatum)的抑制作用，同樣選用麝香霉菌株muscodorsp.w-s-41、muscodorsp.zjlq023、muscodorsp.zjlq024和muscodorsp.zjlq070一起進行試驗，其余等同于實驗一；得到如下表5結果：

表5：麝香霉菌株muscodorsp.w-s-41、muscodorsp.zjlq023、muscodorsp.zjlq024和muscodorsp.zjlq070與青霉菌株kh08(penicilliumdigitatum)的二分隔平皿對峙培養(yǎng)結果

青霉菌屬于叢梗孢科。菌絲體由多數具有橫隔的菌絲所組成，通常以產生分生孢子進行繁殖，產生孢子時，菌絲體頂端產生多細胞的分生孢子梗，梗的頂端分枝2—3次，每枝的末端細胞分裂成串的分生孢子，形成掃帚狀。分生孢子一般呈藍綠色，成熟后隨風飛散，遇適宜環(huán)境，萌發(fā)成菌絲。青霉菌的種類很多，通常生于柑桔類水果上。蔬菜、糧食、肉類、皮革和食物上也常有分布。

青霉菌株kh08penicilliumdigitatum在不含麝香霉菌的pda平皿正常生長，而在含麝香霉菌株muscodorsp.w-s-41、muscodorsp.zjlq024、muscodorsp.zjlq070、muscodorsp.zjlq023的pda平皿生長減緩，從表5中對病原菌青霉菌kh08penicilliumdigitatum的抑制率和復活情況來看，抑菌率順序為muscodorsp.w-s-41>muscodorsp.zjlq024>muscodorsp.zjlq070>muscodorsp.zjlq023，muscodorsp.w-s-41較其他報道的已知菌對青霉菌kh08penicilliumdigitatum的抑菌效果為最好之一。

本實驗以上結果表明，麝香霉菌株muscodorsp.w-s-41，在抑制青霉病的病原菌青霉菌kh08penicilliumdigitatum上有很好的抑制作用，抑制率達100％，且復接的病原菌不能復活。用麝香霉菌株muscodorsp.w-s-41制成的菌劑，尤其是活性載體制劑，可以作為防治由青霉菌kh08penicilliumdigitatum引起的青霉病等。

實施例五、麝香霉菌株muscodorsp.w-s-41對終極腐霉zau22(pythiumultimum)的抑菌作用

本實驗中選用終極腐霉zau22(pythiumultimum)作為病原菌，同樣采用二分隔平皿對峙培養(yǎng)法測定麝香霉菌株muscodorsp.w-s-41揮發(fā)性氣體對終極腐霉zau22(pythiumultimum)的抑制作用，同樣選用麝香霉菌株muscodorsp.w-s-41、muscodorsp.zjlq023、muscodorsp.zjlq024和muscodorsp.zjlq070一起進行試驗，其余等同于實驗一；得到如下表6結果：

表6：麝香霉菌株muscodorsp.w-s-41、muscodorsp.zjlq023、muscodorsp.zjlq024和muscodorsp.zjlq070與終極腐霉zau22(pythiumultimum)的二分隔平皿對峙培養(yǎng)結果

終極腐霉最初從英國腐敗的水芹幼苗上分離出，目前報道分布甚廣，它不僅棲息在土壤中，還廣泛侵染大豆、菜豆、豌豆、甘薯、松苗、咖啡、蘋果、柑橘、桃、棉花、菊花、大麗花、南瓜、西瓜、甘蔗、苜蓿、番茄等150余種經濟植物，引起苗枯，猝倒、根腐、腳腐、枯萎等多種病害。

終極腐霉zau22pythiumultimum在不含麝香霉菌的pda平皿正常生長，而在含麝香霉菌株muscodorsp.w-s-41、muscodorsp.zjlq024、muscodorsp.zjlq070、muscodorsp.zjlq023的pda平皿生長減緩或停止，從表6中對病原菌終極腐霉zau22pythiumultimum的抑制率和復活情況來看，抑菌率順序為muscodorsp.w-s-41>muscodorsp.zjlq070>muscodorsp.zjlq024>muscodorsp.zjlq023，muscodorsp.w-s-41較其他報道的已知菌對終極腐霉zau22pythiumultimum的抑菌效果為最好之一。

本實驗以上結果表明，麝香霉菌株muscodorsp.w-s-41，在抑制腐爛病的病原菌青終極腐霉zau22pythiumultimum上有很好的抑制作用，抑制率達100％，且復接的病原菌不能復活。用麝香霉菌株muscodorsp.w-s-41制成的菌劑，尤其是活性載體制劑，可以作為防治由終極腐霉zau22pythiumultimum引起的腐爛病等。

從實驗一至實驗五中可見，本發(fā)明的菌株麝香霉菌株muscodorsp.w-s-41對植物病原真菌的抑制率都較已知的麝香霉菌株效果好，可以達到廣譜的綜合防治效果，比現有技術取得了更好的效果，利用真菌產生的vocs來控制農作物生產過程中的病原微生物，具有對非靶標生物無毒害，不污染環(huán)境，不破環(huán)生態(tài)平衡，不會誘導有害微生物、病毒及昆蟲等產生抗藥性，是本發(fā)明的亮點。

實施例2、麝香霉菌muscodorsp.w-s-41菌劑制備

基于本發(fā)明闡述的麝香霉菌muscodorsp.w-s-41具有高效廣譜的殺滅真菌的效果，本發(fā)明還涉及包含麝香霉菌muscodorsp.w-s-41的菌劑。本發(fā)明所述的菌劑，是指是由有益微生物制成的活菌制劑，包括生物制劑、生物肥料、生物農藥、活性載體制劑等，包括包含了活菌成分麝香霉菌株muscodorsp.w-s-41或者麝香霉菌株muscodorsp.w-s-41的代謝產物的各種單一產物或組合物。本實施例的活性載體制劑包括固體載體、培養(yǎng)基、穩(wěn)定劑和活菌。

本發(fā)明制備菌株muscodorsp.w-s-41活性載體制劑的方法，該方法包括(1)muscodorsp.w-s-41種子培養(yǎng)液的制備，(2)將muscodorsp.w-s-41種子液接種于載體培養(yǎng)基中，(3)muscodorsp.w-s-41在載體培養(yǎng)基中培養(yǎng)生長，(4)muscodorsp.w-s-41載體培養(yǎng)物的干燥密封包裝。適當的固體載體為垤石、珍珠巖或硅藻土，最優(yōu)選為硅藻土；培養(yǎng)基為包括鈣離子、鎂離子、鐵離子、磷酸鹽離子和其它微量元素、蛋白胨、酵母提取物、大豆餅粉、葡萄糖、小米粒、大麥粉、麩皮、土豆汁和玉米漿的其中之一或任一組合物；穩(wěn)定劑包括蔗糖、葡萄糖、甘油或乳糖其中之一或任一組合物，最優(yōu)選為甘油；以及合適的培養(yǎng)條件，包括ph、溫度、濕度及培養(yǎng)時間。

具體如下：

1)、在優(yōu)選的實施方案中麝香霉菌muscodorsp.w-s-41種子液制備是通過將麝香霉菌muscodorsp.w-s-41在pda培養(yǎng)基上活化后，將2g菌餅接入優(yōu)化后的液體培養(yǎng)基200ml中來制備種子液。

優(yōu)選的種子液體培養(yǎng)基為馬鈴薯葡萄糖培養(yǎng)液(即，pdb培養(yǎng)基，馬鈴薯葡萄糖培養(yǎng)基)、mid改訂培養(yǎng)液(每升含：蔗糖30.00g，蛋白胨1.00g，酵母粉0.25g，酒石酸銨5.00g，ca(no3)20.28g，kno30.08g，kcl0.06g，mgso40.36g，nah2po4·h2o0.02g，fecl3·6h2o2.0mg，mnso45.0mg，znso4·7h2o2.5mg，h3bo31.4mg，ki0.7mg，其余為水，ph5.5)、大麥粉酵母粉培養(yǎng)基(每升含：大麥粉30g、酵母粉5.0g、蛋白胨3.0g、ca(no3)20.4g，kno30.12g，kcl0.2g，mgso40.25g，fecl3·6h2o5.0mg，mnso45.0mg，znso4·7h2o5.0mg，h3bo32.0mg，ki1.0mg，其余為水，ph5.5)、小米粉酵母粉培養(yǎng)基(每升含：小米粉30g、酵母粉5.0g、蛋白胨3.0g、ca(no3)20.4g，kno30.12g，kcl0.2g，mgso40.25g，fecl3·6h2o5.0mg，mnso45.0mg，znso4·7h2o5.0mg，h3bo32.0mg，ki1.0mg，其余為水，ph5.5)和細米糠酵母粉培養(yǎng)基(每升含：細米糠30g、酵母粉5.0g、蛋白胨3.0g、ca(no3)20.4g，kno30.12g，kcl0.2g，mgso40.25g，fecl3·6h2o5.0mg，mnso45.0mg，znso4·7h2o5.0mg，h3bo32.0mg，ki1.0mg，其余為水，ph5.5)，更優(yōu)選為大麥粉酵母粉培養(yǎng)基、小米粉酵母粉培養(yǎng)基和細米糠酵母粉培養(yǎng)基，最優(yōu)選為小米粉酵母粉培養(yǎng)基。種子培養(yǎng)液的制備在控制的溫度以及ph和轉速下生長，以獲得高細胞密度的培養(yǎng)物。優(yōu)選的溫度介于10-30℃之間，更優(yōu)選介于20-28℃之間，最優(yōu)選為25℃。優(yōu)選的ph是3-8，優(yōu)選4-7，更優(yōu)選為5.5。優(yōu)選的轉速為50-300rpm之間，更優(yōu)介于100-200rpm，最優(yōu)選為150rpm。培養(yǎng)時間優(yōu)選為2-10d，更優(yōu)選為3-8d，最優(yōu)選為5d，培養(yǎng)之后采收全部種子培養(yǎng)液。

2)、將制備好的muscodorsp.w-s-41種子培養(yǎng)液接入載體培養(yǎng)基中，在優(yōu)化后的培養(yǎng)條件下生長。

優(yōu)選的固體載體為垤石、珍珠巖或硅藻土，最優(yōu)選為硅藻土；優(yōu)選培養(yǎng)基包括鈣離子、鎂離子、鐵離子、磷酸鹽離子和其它微量元素、蛋白胨、酵母提取物、大豆餅粉、蔗糖、可溶性淀粉、葡萄糖、小米粒、大麥粉、麩皮、細米糠、土豆汁和玉米漿的組合物；更優(yōu)選為硝酸鈣、硫酸鎂、磷酸二氫鉀、氯化鉀、硫酸鋅、硫酸錳、氯化鐵、硼酸、碘化鉀、蛋白胨、酵母提取物、大豆餅粉、葡萄糖、小米粒、大麥粉、麩皮、細米糠、土豆汁和玉米漿的組合物，最優(yōu)選為硝酸鈣、硫酸鎂、磷酸二氫鉀、氯化鉀、硫酸鋅、硫酸錳、氯化鐵、硼酸、碘化鉀、蛋白胨、酵母提取物、大豆餅粉、葡萄糖、小米粒、麩皮、細米糠、土豆汁的組合物。優(yōu)選固體載體硅藻土在載體培養(yǎng)基中(干基計)的比例50-90％，更優(yōu)為70-90％，最優(yōu)為85％。作為本發(fā)明的培養(yǎng)基的改進，該載體培養(yǎng)基的組成為：硅藻土380g/kg、硝酸鈣0.4g/kg、硫酸鎂0.25g/kg、磷酸二氫鉀1.0g/kg、氯化鉀0.2g/kg、硫酸鋅5mg/kg、硫酸錳5mg/kg、氯化鐵5mg/kg、硼酸2mg/kg、碘化鉀1mg/kg、蛋白胨5.0g/kg、酵母提取物3.0g/kg、大豆餅粉5.0g/kg、葡萄糖10.0g/kg、小米粒20.0g/kg、麩皮30.0g/kg、細米糠20.0g/kg，其余為土豆汁，從而將濕度控制在45％。也就是說：將酸鈣、硫酸鎂、磷酸二氫鉀、氯化鉀、硫酸鋅、硫酸錳、氯化鐵、硼酸、碘化鉀、蛋白胨、酵母提取物、大豆餅粉、葡萄糖、小米粒、麩皮、細米糠的組合物溶于土豆汁中形成混合液，再與硅藻土混合均勻。優(yōu)選溫度為20-30℃，更優(yōu)選為22-28℃，最優(yōu)選為25℃。優(yōu)選的生長時間為1-15d，更優(yōu)選3-12d，最優(yōu)選為7d。優(yōu)選的濕度控制在20-80％，更優(yōu)為30-70％，最優(yōu)為55％。優(yōu)選接種時種子培養(yǎng)液與載體培養(yǎng)基的比例為1-20％(重量比)，更優(yōu)選的比例為5-15％，最優(yōu)選10％。

培養(yǎng)所得物即為活性載體制劑。

3)在活性載體制劑中添加穩(wěn)定劑，例如蔗糖、葡萄糖、甘油或乳糖等，以保持菌體細胞的活性。

在優(yōu)選的方案中，穩(wěn)定劑為蔗糖、葡萄糖、甘油或乳糖，更優(yōu)選為蔗糖、葡萄糖、甘油，最優(yōu)選為甘油。添加穩(wěn)定劑的時間為固體發(fā)酵培養(yǎng)結束時加入，在穩(wěn)定劑加入量優(yōu)選方案中，優(yōu)選的比例為5-20％(穩(wěn)定劑：活性載體制劑的重量比)，更優(yōu)選為10-15％，最優(yōu)選為10％。之后再進行干燥包裝，干燥時采用低溫低凍技術，以抑制muscodorsp.w-s-41菌體細胞的生長代謝活動。優(yōu)選商品活性載體制劑的水分控制指標為10-50％，更優(yōu)化為15-35％，最優(yōu)為20％。包裝是為了給活性載體制劑提供一個穩(wěn)定安全的貯存與使用微環(huán)境，本發(fā)明是將干燥后的活性載體制劑裝入透氣透濕的環(huán)境中，外層采用無紡布保護，在內層玻璃膜袋中事先配備定量的活化營養(yǎng)液，只要使用時用手擠壓就可以使營養(yǎng)液加入活性載體制劑中，以使菌株muscodorsp.w-s-41菌體細胞得到水分和營養(yǎng)以恢復生長，釋放出抗菌活性的揮發(fā)性混合物vocs?；罨癄I養(yǎng)液包括水、蛋白胨、酵母提取物、生物生長素、葡萄糖及微量元素。

最后，還需要注意的是，以上列舉的僅是本發(fā)明的若干個具體實施例。顯然，本發(fā)明不限于以上實施例，還可以有許多變形。本領域的普通技術人員能從本發(fā)明公開的內容直接導出或聯想到的所有變形，均應認為是本發(fā)明的保護范圍。

<110>浙江大學

<120>麝香霉菌w-s-41及其用途

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<212>dna

<213>麝香霉菌（muscodorsp.）

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