本發(fā)明屬于化學(xué)生物學(xué)領(lǐng)域，具體涉及一種功能多肽及其制藥用途，尤其涉及：(一)利用功能多肽對上述兩類核糖核酸的包裹、靶向性細(xì)胞內(nèi)運(yùn)輸；(二)利用功能多肽運(yùn)輸上述兩類核糖核酸實(shí)現(xiàn)的核糖核酸干擾治療；(三)利用功能多肽實(shí)現(xiàn)的核糖核酸干擾治療效果的實(shí)時(shí)評估。

背景技術(shù)：

核糖核酸干擾(rnainterference,rnai)是近年來發(fā)現(xiàn)的針對體內(nèi)特定靶基因進(jìn)行調(diào)節(jié)的生物過程。在rnai過程中，小分子非編碼rna，如內(nèi)源性的微小核糖核酸(microrna,mirna)和外源性的小干擾核糖核酸(smallinterferingrna,sirna)可通過堿基互補(bǔ)配對的原則使它們的靶信使核糖核酸(mrna)被降解或抑制它們的翻譯。rnai不僅與體內(nèi)生理過程緊密相關(guān)，并且在眾多疾病的發(fā)生發(fā)展中也有著舉足輕重的作用。因而，sirna和mirna近年來已經(jīng)被視為可通過rnai實(shí)現(xiàn)治療目的的一類新型的先導(dǎo)藥物。然而，由于sirna和mirna本身的負(fù)電性及在血清等復(fù)雜生理環(huán)境中的不穩(wěn)定性，sirna和mirna的運(yùn)輸仍然需要額外的載體實(shí)現(xiàn)，這就要求所用的載體需要具有優(yōu)良的生物相容性、可降解性及運(yùn)輸操作過程的簡便性。另外，在rnai治療過程中仍有兩個(gè)需要解決的關(guān)鍵問題：運(yùn)輸過程中如何實(shí)現(xiàn)sirna和mirna的靶向運(yùn)輸以提高rnai治療的效率；運(yùn)輸過程中如何實(shí)現(xiàn)rnai治療效果的實(shí)時(shí)成像以用于評估rnai治療的效率。

多肽是一類具有優(yōu)良生物相容性的化學(xué)分子，其可通過化學(xué)手段輕易修飾各類不同的功能基團(tuán)，具有良好的生物應(yīng)用潛力。在本發(fā)明中，發(fā)明人發(fā)明了可在陽離子九聚精氨酸的兩端通過特定化學(xué)方法引入靶向細(xì)胞膜表面受體的分子，以及可對rnai治療效果評估的成像探針，利用得到的功能多肽可實(shí)現(xiàn)小干擾核糖核酸和微小核糖核酸的細(xì)胞內(nèi)靶向運(yùn)輸、治療以及治療效果的實(shí)時(shí)成像。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

解決的技術(shù)問題：本發(fā)明提供一種功能多肽及其制藥用途，可實(shí)現(xiàn)小干擾核糖核酸和微小核糖核酸的細(xì)胞內(nèi)靶向運(yùn)輸、治療以及治療效果的實(shí)時(shí)成像。

技術(shù)方案：功能多肽，結(jié)構(gòu)如下所示：

其中r代表l-構(gòu)型的精氨酸，x為連接基團(tuán)，yy為靶向分子，pyr為吡唑啉熒光團(tuán)，z為可被不同蛋白酶識別剪切的短肽，quencher為對應(yīng)于pyr的熒光淬滅基團(tuán)；y或pyr-z-quencher可分別連接在九聚精氨酸的n端或c端。

上述x為含一至十個(gè)碳的烷基、低聚或多聚乙二醇、二硫鍵、酰胺鍵、酯鍵、醚鍵或三氮唑。

上述y為葉酸、透明質(zhì)酸、鏈狀rgd肽、環(huán)狀rgd肽、rvg肽、tat肽、mpg肽、eb1肽、egfr抗體或her2抗體。

上述z為蛋白酶底物肽段devd、plgvr、gpgpnq或kk。

上述quencher為dabcyl、qsy21或bhq。

上述pyr為光點(diǎn)擊化學(xué)反應(yīng)熒光產(chǎn)物吡唑啉，化學(xué)結(jié)構(gòu)特征如下：

其中x或z可以連接在任意位置上，ar1和ar2分別為苯環(huán)或萘環(huán)。

功能多肽的優(yōu)選結(jié)構(gòu)如fa-r9-fpcas3所示：

上述功能多肽在制備核糖核酸干擾診療藥物中的應(yīng)用。

上述功能多肽在篩選核糖核酸干擾診療藥物中的應(yīng)用。

有益效果：本發(fā)明提供的功能多肽及其制藥用途，可用于sirna和mirna細(xì)胞內(nèi)靶向運(yùn)輸、治療及診斷。能夠?qū)崿F(xiàn)小干擾核糖核酸和微小核糖核酸的細(xì)胞內(nèi)靶向運(yùn)輸、治療以及治療效果的實(shí)時(shí)成像。適用于制備核糖核酸干擾診療藥物，及篩選核糖核酸干擾診療藥物。

附圖說明

圖1為fa-r9-fpcas3的質(zhì)譜圖；

圖2為凝膠電泳分析圖；

圖3為納米顆粒尺寸及電位趨勢圖；

圖4為hela細(xì)胞內(nèi)mir-34a運(yùn)輸定量分析圖；

圖5為hepg2、mcf-7、a549細(xì)胞內(nèi)mir-34a運(yùn)輸定量分析圖；每組柱狀數(shù)據(jù)自左往右依次為blank、mirnc-nc、mirnc-34a、lipo-34a。

圖6為hela細(xì)胞內(nèi)熒光素酶實(shí)驗(yàn)結(jié)果圖；

圖7為hela細(xì)胞內(nèi)sirt1、caspase-3蛋白表達(dá)測試結(jié)果圖；

圖8為hela細(xì)胞凋亡結(jié)果圖；

圖9為hela細(xì)胞內(nèi)mir-34a的功能實(shí)時(shí)成像結(jié)果圖；

圖10為hela細(xì)胞內(nèi)caspase-3蛋白量隨時(shí)間變化結(jié)果圖。

具體實(shí)施方式

下面結(jié)合具體實(shí)施例來進(jìn)一步描述本發(fā)明，本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)和特點(diǎn)將會隨著描述而更為清楚。但是，應(yīng)理解所述實(shí)施例僅是范例性的，不對本發(fā)明的保護(hù)范圍構(gòu)成任何限制。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)該理解的是，在不偏離本發(fā)明的精神下，可以對技術(shù)方案的細(xì)節(jié)和形式進(jìn)行修改或替換，但這些修改或替換均落入本發(fā)明的保護(hù)范圍。

(一)功能多肽與sirna或mirna的納米復(fù)合物的制備

將功能多肽與sirna或mirna以一定比例稀釋于高糖培養(yǎng)基或磷酸鹽緩沖液中，混勻后置于室溫放置30分鐘。

(二)sirna和mirna的靶向運(yùn)輸

選取細(xì)胞膜表面富含上述靶向基團(tuán)受體的細(xì)胞系，將上述得到的rna納米復(fù)合物加入到細(xì)胞內(nèi)，一定時(shí)間后，提取細(xì)胞內(nèi)rna并用定量rt-pcr對細(xì)胞內(nèi)sirna或mirna的表達(dá)量進(jìn)行測定。

(三)熒光素酶實(shí)驗(yàn)

通過功能多肽運(yùn)輸?shù)膕irna和mirna刺激細(xì)胞內(nèi)的熒光素酶信號變化判斷其生物活性，具體流程如下：

(1)構(gòu)建含有sirna或mirna結(jié)合位點(diǎn)的熒光素酶質(zhì)粒；

(2)將質(zhì)粒轉(zhuǎn)染到測試細(xì)胞內(nèi)后，用功能多肽運(yùn)輸相應(yīng)的sirna或mirna；

(3)72小時(shí)后測定細(xì)胞內(nèi)熒光素酶信號。

(四)蛋白印跡實(shí)驗(yàn)

利用功能多肽運(yùn)輸相應(yīng)的sirna或mirna到細(xì)胞內(nèi)，在培養(yǎng)不同時(shí)間后，提取細(xì)胞內(nèi)的總蛋白，利用sds-page進(jìn)行分離，并將蛋白轉(zhuǎn)印到pvdf膜上后利用相應(yīng)抗體進(jìn)行檢測。

(五)流式細(xì)胞凋亡測試

利用功能多肽運(yùn)輸相應(yīng)的sirna或mirna到細(xì)胞內(nèi)。在培養(yǎng)不同時(shí)間后，收集細(xì)胞，利用細(xì)胞凋亡檢測試劑盒對凋亡細(xì)胞進(jìn)行染色，并用流式細(xì)胞儀進(jìn)行定量分析。

(六)共聚焦熒光成像

利用功能多肽運(yùn)輸相應(yīng)的sirna或mirna到細(xì)胞內(nèi)。在培養(yǎng)不同時(shí)間后，利用pyr的熒光對運(yùn)輸?shù)膕irna或mirna在細(xì)胞內(nèi)的功能進(jìn)行直接成像。

實(shí)施例1、fa-r9-fpcas3的合成

1、pa-r(pbf)9的合成

通過標(biāo)準(zhǔn)固相合成方法，以氯三苯甲基氯樹脂為固相載體合成九聚精氨酸，最后在末端通過o-苯并三氮唑-四甲基脲六氟磷酸鹽(hbtu)連接丁炔酸，隨后加入1％三氟乙酸(tfa)/二氯甲烷(體積比)從樹脂上切除，再用hplc分離得到pa-r(pbf)9。

2、1b的合成

通過標(biāo)準(zhǔn)固相合成方法，以氨基樹脂為固相載體合成devdk序列，最后在末端通過hbtu連接3-馬來酰亞胺基丙酸，隨后加入tfa切除保護(hù)基團(tuán)，再用hplc分離得到中間產(chǎn)物。將37mg中間產(chǎn)物(0.049mmol)與18mgdabcylnhs酯(0.049mmol，百靈威)(溶解在dmso中，加入87μln，n-二異丙基乙胺(dipea，0.5mmol)，室溫反應(yīng)過夜，隨后用hplc分離得到1b(31mg，62.9％)。

3、tet-nh2的合成

將175mg化合物1a(1mmol)溶解在二氯甲烷中，隨后在冰浴條件下加入205mg氯甲酸異丁酯(1.5mmol)以及152mg4-甲基嗎啉(1.5mmol)，室溫?cái)嚢?小時(shí)后加入237mg化合物1b(1mmol)。室溫下繼續(xù)反應(yīng)4小時(shí)后，柱層析分離得到283mg1c(71％)。將1c溶解于二氯甲烷中，加入50％(體積比)tfa，室溫反應(yīng)1小時(shí)后，蒸干溶劑后得到196mgtet-nh2(92.8％)。

其中1b的合成方法:

(1)化合物1b-1(1.5g，10mmol)和對甲基苯磺酰肼(1.86g，10mmol)溶于甲醇(50ml)及水(50ml)中，室溫?cái)嚢?分鐘，析出大量白色固體，過濾得1b-23g(產(chǎn)率93％)。

(2)苯胺重氮鹽是通過將2ml冷的亞硝酸鈉溶液(5mmol)在5℃以下倒入含有1.3ml濃鹽酸的苯胺(5mmol)的50wt.％乙醇水溶液中制備得到。將重氮鹽滴加到30ml溶有1b(1.6g，5mmol)的吡啶溶液中，控制反應(yīng)溫度在-10℃至-15℃。滴加完全后繼續(xù)反應(yīng)3小時(shí)后，用二氯甲烷和水萃取反應(yīng)，有機(jī)層合并后用稀鹽酸洗滌并用無水硫酸鈉干燥。減壓蒸餾去除溶劑后，通過柱層析提出得到黃色粉末1b-30.7g(產(chǎn)率53％)。

(3)1b-3(0.6g，2.5mmol)溶解于dioxane(10ml)中，加熱回流(80℃)na2s(3g，7.5mmol)的水溶液(5ml)滴加到dioxane中。繼續(xù)加熱回流2小時(shí)，二氯甲烷和水萃取反應(yīng)，有機(jī)層合并后用無水硫酸鈉干燥。減壓蒸餾去除溶劑后，通過柱層析提出得到黃色粉末1b0.5g(產(chǎn)率80％)。

4、fa-n3的合成

將44mg葉酸(2a，0.1mmol)溶解于dmso中，加入51mg二環(huán)己基碳二亞胺(dcc，0.2mmol)以及22mgn-羥基琥珀酰亞胺(nhs，0.2mmol)。室溫反應(yīng)過夜后，濾去沉淀，加入44mg氨基三聚乙二醇疊氮(2b，0.2mmol，tci)以及61mg4-二甲氨基吡啶(dmap，0.5mmol)，室溫反應(yīng)4小時(shí)以后，用hplc分離得到fa-n3(15mg，23.4％)。

5、1a的合成

將175mg的pa-r(pbf)9(0.046mmol)與14mg的氨基修飾的四氮唑分子(tet-nh2)(0.046mmol)溶解在二氯甲烷中，隨后加入30mg的hbtu(0.08mmol)以及28μl的n，n-二異丙基乙胺(dipea，百靈威)(0.016mmol)?；旌弦涸谑覝叵聰嚢柽^夜，蒸去溶劑后，加入tfa切除保護(hù)基團(tuán)，隨后用hplc分離得到1a(41mg，50.1％)。

5、r9-fpcas3的合成

將18mg的1a(0.01mmol)與20mg的1b(0.02mmol)溶解在乙腈/pbs的混合溶液中(ch3cn/pbs，體積比1/1)，隨后用發(fā)射波長為302nm的手提紫外燈光照30分鐘，隨即用hplc分離得到r9-fpcas3(18mg，65％)。

6、fa-r9-fpcas3的合成

將10mg的r9-fpcas3(0.0036mmol)與5mg的fa-n3(0.0072mmol)溶解在dmso/h2o的混合溶液中(dmso/h2o，體積比2/1)，隨后加入200mg抗壞血酸鈉，3.2mg的硫酸銅，50mg的thpta，在30℃反應(yīng)4小時(shí)。隨后用hplc分離得到fa-r9-fpcas3(3.6mg，29.4％)。分子量理論值為3398.7425，實(shí)際測量值為3399.4939(圖1)。

fa-r9-fpcas3對mir-34a的包裹

將100pmolemir-34a溶解于100μldmem中，后將0.2μl，0.4μl，0.6μl，0.8μl的5mmfa-r9-fpcas3分別加入到dmem中，得到幾組不同摩爾比的混合液，將混合液置于室溫中放置30分鐘。

凝膠電泳分析

配制2％瓊脂糖凝膠，分別取上述混合液進(jìn)行電泳分析，并用溴化乙錠對mir-34a進(jìn)行顯色。如圖2所示，在fa-r9-fpcas3的比例逐漸增加時(shí)，游離的mir-34a逐漸消失，表明兩者的納米復(fù)合物逐漸生成，且復(fù)合物的大小和電位也隨之變化(圖3)。

靶向細(xì)胞內(nèi)運(yùn)輸

將hela細(xì)胞種入12孔板中，24小時(shí)后，將mir-34a或陰性對照nc與fa-r9-fpcas3的混合液加入到細(xì)胞培養(yǎng)基中，mir-34a或陰性對照nc的終濃度為100nm，培養(yǎng)24小時(shí)后，用trizol提取細(xì)胞內(nèi)rna。如圖4所示，當(dāng)fa-r9-fpcas3的摩爾比例逐漸增加時(shí)，進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)的mir-34a的量也逐漸增加，當(dāng)摩爾比例為30/1時(shí)達(dá)到最佳轉(zhuǎn)運(yùn)效果，該比例的復(fù)合物定義為mirnc-34a，陰性對照為mirnc-nc，且轉(zhuǎn)運(yùn)效率與商業(yè)化的試劑lipofectamine2000相當(dāng)。

取葉酸受體陰性的hepg2、mcf-7、a549細(xì)胞作為對照，進(jìn)行上述相同實(shí)驗(yàn)。如圖5所示，mirnc-34a向陰性細(xì)胞中轉(zhuǎn)運(yùn)mir-34a的效率較低，驗(yàn)證了靶向運(yùn)輸?shù)哪芰Α?/p>

mirna表達(dá)量的測定

取出1μg的rna進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)制備相應(yīng)的cdna樣品。具體逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)10μl體系為：

5×amvbuffer(takara)2μl

amv(takara)0.5μl

rtprimer(abi)0.5μl

dntpmixture(takara)1μl

depch2o5μl

rna1μl

反應(yīng)程序?yàn)椋?6℃30min，42℃30min，85℃5min，4℃保存。制備好的cdna再用探針法(taqman)pcr對mir-122進(jìn)行實(shí)時(shí)定量。

20μltaqmanpcr反應(yīng)體系為：

10×buffer(takara)2μl

mgcl2(25mm)(takara)1.2μl

taq(takara)0.3μl

dntpmixture(10mm)0.4μl

probe(abi)0.33μl

cdna1μl

distilledh2o14.77μl

pcr反應(yīng)程序?yàn)?5℃5min，95℃15s后60℃1min40個(gè)循環(huán)擴(kuò)增，實(shí)時(shí)熒光信號均在每個(gè)循環(huán)的60℃采集。

熒光素酶實(shí)驗(yàn)

(1)報(bào)告質(zhì)粒的構(gòu)建

使用hindiii和spel(itakara)內(nèi)切酶剪切l(wèi)uciferase報(bào)告質(zhì)粒(promega)的3’utr端，將得到的片斷進(jìn)行電泳分離純化。mir-34a的互補(bǔ)序列分別通過dna連接酶，t4ligase(takara)，插入到純化得到的luciferase報(bào)告質(zhì)粒中，并轉(zhuǎn)化到感受態(tài)大腸桿菌內(nèi)，再通過含有氨芐的篩選平板篩選得到可能的陽性質(zhì)粒。最終將該報(bào)告質(zhì)粒進(jìn)行測序確認(rèn)其正確性(invitrogen)。

(2)熒光素酶分析

鑒定后的報(bào)告質(zhì)粒通過轉(zhuǎn)染進(jìn)入hela細(xì)胞中。首先將細(xì)胞種到24孔板中，當(dāng)細(xì)胞密度達(dá)到70-80％時(shí)，將0.25μgmir-34a報(bào)告質(zhì)粒和0.15μgβ-galactosidase內(nèi)參質(zhì)粒用lipofectamine2000試劑轉(zhuǎn)染進(jìn)細(xì)胞，轉(zhuǎn)染操作遵循invitrogen產(chǎn)品說明。在轉(zhuǎn)染4小時(shí)后，將mir-34a或陰性對照nc用fa-r9-fpcas3運(yùn)輸?shù)郊?xì)胞中(摩爾比1/30)，mir-34a或陰性對照nc的終濃度為100nm，繼續(xù)培養(yǎng)72小時(shí)后，測定luciferase和β-galactosidase內(nèi)參信號。如圖6所示，mirnc-34a向細(xì)胞內(nèi)運(yùn)輸?shù)膍ir-34a仍然具有抑制靶基因表達(dá)的功能。

蛋白印跡實(shí)驗(yàn)

將hela細(xì)胞種入6厘米培養(yǎng)皿中，24小時(shí)后，將mir-34a或陰性對照nc與fa-r9-fpcas3的混合液(摩爾比1/30)加入到細(xì)胞培養(yǎng)基中，mir-34a或陰性對照nc的終濃度為300nm，培養(yǎng)24小時(shí)到72小時(shí)后，提取蛋白裂解液。將蛋白裂解液與1×sdsloadingbuffer混勻后，根據(jù)蛋白的大小選擇不同濃度(一般10％)的sds-page對樣品進(jìn)行蛋白分離。蛋白成功分離后，將蛋白濕轉(zhuǎn)到pvdf膜上，再用含有5wt.％脫脂奶粉的tbst/tween-20緩沖液進(jìn)行1小時(shí)封膜，然后用一抗4℃過夜孵育，tbst/tween-2010min洗滌四次，二抗室溫孵育1小時(shí)，再用tbst/tween-2010min洗滌四次，最后用ecl試劑顯影蛋白條帶。如圖7所示，相比于空白細(xì)胞或mirnc-nc處理的細(xì)胞，mirnc-34a處理的細(xì)胞內(nèi)mir-34a的直接靶標(biāo)sirt1的表達(dá)量顯著下降，而下游的caspase-3表達(dá)量顯著上升，表明mir-34a具有調(diào)控功能。

流式凋亡檢測實(shí)驗(yàn)

將hela細(xì)胞種入6孔板中，24小時(shí)后，將mir-34a或陰性對照nc與fa-r9-fpcas3的混合液(摩爾比1/30)加入到細(xì)胞培養(yǎng)基中，mir-34a或陰性對照nc的終濃度為300nm，培養(yǎng)24小時(shí)到72小時(shí)后，收集細(xì)胞并用流式凋亡檢測試劑盒進(jìn)行染色，隨后用流式細(xì)胞儀式進(jìn)行定量檢測。如圖8所示，相比于空白細(xì)胞或mirnc-nc處理的細(xì)胞，mirnc-34a處理的細(xì)胞凋亡顯著上升。

細(xì)胞內(nèi)mir-34a功能實(shí)時(shí)成像實(shí)驗(yàn)

將hela細(xì)胞種入35毫米共聚焦培養(yǎng)皿中，24小時(shí)后，將mir-34a與fa-r9-fpcas3的混合液(摩爾比1/30)加入到細(xì)胞培養(yǎng)基中，mir-34a的終濃度為300nm，培養(yǎng)24小時(shí)到72小時(shí)后，在共聚焦熒光顯微鏡下直接觀察pyr的熒光，細(xì)胞核選用draq5染色。如圖9所示，在mirnc-34a處理后，對應(yīng)于激活caspase-3表達(dá)量的pyr熒光也隨孵育時(shí)間逐漸增強(qiáng)，而細(xì)胞表型也提示細(xì)胞逐漸凋亡。而蛋白印跡結(jié)果也驗(yàn)證了成像結(jié)果(圖10)。

上述具體實(shí)施方式不以任何形式限制本發(fā)明的技術(shù)方案，凡是采用等同替換或等效變換的方式所獲得的技術(shù)方案均落在本發(fā)明的保護(hù)范圍。