本發(fā)明屬于農(nóng)作物病害診斷和分子生物學(xué)技術(shù)領(lǐng)域，特別是涉及一種反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(RT-PCR)的體系及其應(yīng)用，利用該體系可通過一次PCR檢測5種侵染西瓜的RNA病毒，達(dá)到準(zhǔn)確、快速、高效檢測的目的。

背景技術(shù)：

西瓜(Citrullus lanatus)是葫蘆科西瓜屬植物，為夏季水果，果肉鮮甜多汁，能降溫去暑；種子含油，可作消遣食品；果皮可藥用，有清熱、利尿、降血壓的功效。自1978年以來，世界西瓜生產(chǎn)持續(xù)發(fā)展，種植面積、總產(chǎn)量和單產(chǎn)均有大幅提高。據(jù)聯(lián)合國糧食與農(nóng)業(yè)組織統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)庫(FAOSTAT)2013年的數(shù)據(jù)，全世界共有117個(gè)國家種植西瓜，西瓜的種植總面積和產(chǎn)量分別為348.921萬公頃和10927.87萬噸,位列水果的第7位和第1位；我國是最大的西瓜生產(chǎn)國，2013年種植面積和產(chǎn)量分別為183.98萬公頃和7318.88萬噸，占全世界52.73％和66.97％。

隨著西瓜種植面積的不斷擴(kuò)大，種植區(qū)氣候和耕作制度的變化，西瓜病毒病的發(fā)生呈現(xiàn)逐年上升趨勢，重病田發(fā)病率約為30～50％,甚至高達(dá)85％，嚴(yán)重影響了西瓜的產(chǎn)量、品質(zhì)以及農(nóng)民的種植積極性。目前在我國能夠引起西瓜病毒病害的主要病原有：馬鈴薯Y病毒屬(Potyvirus)的小西葫蘆黃花葉病毒(Zucchini yellow mosaic virus,ZYMV)和西瓜花葉病毒(Watermelon mosaic virus,WMV)，煙草花葉病毒屬(Tobamovirus)的黃瓜綠斑駁花葉病毒(Cucumber green mottle mosaic virus,CGMMV)和煙草花葉病毒(Tobacco mosaic virus,TMV)，馬鈴薯卷葉病毒屬(Polerovirus)的甜瓜蚜傳黃化病毒(Melon aphid-borne yellows virus,MABYV)、豇豆花葉病毒屬(Comovirus)的南瓜花葉病毒(Squash mosaic virus,SqMV)、黃瓜花葉病毒屬(Cucumovirus)的黃瓜花葉病毒(Cucumber mosaic virus,CMV)以及丁型雙分病毒屬(Deltapartitivirus)的西瓜潛隱病毒(Citrullus lanatus cryptic virus,CiLCV)。在自然條件下，西瓜植株受到2種或2種以上病毒復(fù)合侵染的情況非常普遍，往往會(huì)導(dǎo)致病害癥狀復(fù)雜，難以識別病原種類，給病害早期診斷、監(jiān)測預(yù)警和田間有效防控帶來極大的困難。2015和2016年在河南開封西瓜田發(fā)生了嚴(yán)重的病毒病害，經(jīng)小RNA深度測序和PCR鑒定發(fā)現(xiàn)存在CiLCV、CGMMV、ZYMV、MABYV和WMV 5種病毒單一或兩種以上病毒不同組合的復(fù)合侵染型，最多5種病毒可以同時(shí)侵染一株西瓜苗。但由于小RNA深度測序成本昂貴，且需要較高的生物信息學(xué)分析技能，難以大規(guī)模應(yīng)用于生產(chǎn)實(shí)踐。因此生產(chǎn)上急需一種快速、準(zhǔn)確、簡單、易操作的方法同時(shí)鑒別多種病毒病原。

隨著分子生物學(xué)技術(shù)的長足發(fā)展，基于核酸操作的多項(xiàng)技術(shù)在病毒病害的檢測中發(fā)揮了巨大的作用，如多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)、實(shí)時(shí)熒光定量PCR、基因芯片、核酸等溫?cái)U(kuò)增等技術(shù)可同時(shí)檢測多個(gè)靶標(biāo)病原物，具有快速、準(zhǔn)確、樣品消耗少等特點(diǎn)。多重PCR(multiplex PCR)技術(shù)因其快速、靈敏、準(zhǔn)確等優(yōu)點(diǎn)已被廣泛應(yīng)用于病毒、細(xì)菌、真菌等病原物的檢測和鑒定，為病害的早期診斷發(fā)揮著巨大的作用。多重PCR是指在同一個(gè)PCR反應(yīng)體系中同時(shí)加入兩種或兩種以上的靶標(biāo)病原物的核苷酸模板和特異性引物對，通過一次擴(kuò)增反應(yīng)獲得大小不同的兩種或兩種以上的目的基因片段，從而同時(shí)區(qū)別兩種或兩種以上靶標(biāo)病原物?；诖嗽恚景l(fā)明建立了CiLCV、CGMMV、ZYMV、MABYV和WMV等5種病毒的一步法RT-PCR檢測體系，該體系可以準(zhǔn)確、高效、快速的鑒定田間自然發(fā)病的西瓜標(biāo)樣，為西瓜病害的早期診斷和鑒定提供手段。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于提供一種用于同步檢測五種侵染西瓜的病毒病原的方法。該方法能夠準(zhǔn)確、高效、靈敏的同時(shí)檢測多種西瓜病毒病原。

一種同步檢測CiLCV、CGMMV、ZYMV、MABYV和WMV五種西瓜病毒的多重RT-PCR方法，在同一PCR體系中，包含有如下特異性引物對：

擴(kuò)增CiLCV的特異性引物的核苷酸序列為：

SEQ ID NO.1：5′-CATTGGTGGAGCACAAAACAAA-3′，

SEQ ID NO.2：5′-TTGCGTCTTAGCCTATCTGC-3′；

擴(kuò)增CGMMV的特異性引物的核苷酸序列為：

SEQ ID NO.3：5′-GTTGCGAGGAATGTGATGTA-3′，

SEQ ID NO.4：5′-AAGACTGTCTGCGAACCTCC-3′；

擴(kuò)增ZYMV的特異性引物的核苷酸序列為：

SEQ ID NO.5：5′-AGCAAACTGTGGCAGACGCT-3′，

SEQ ID NO.6：5′-CTAGTAAGGTATGCATGTTT-3′；

擴(kuò)增MABYV的特異性引物的核苷酸序列為：

SEQ ID NO.7：5′-TTGGAGGTTATGCAGATTTTCG-3′；

SEQ ID NO.8：5′-GCCGGTCATCAGTATCAAGTCT-3′；

擴(kuò)增WMV的特異性引物的核苷酸序列為：

SEQ ID NO.9：5′-TCGAATACAAGCCCAATCAA-3′；

SEQ ID NO.10：5′-ACGGACTTTCAGAGTTTCTC-3′。

所述PCR體系中CiLCV、CGMMV、ZYMV、MABYV和WMV引物的摩爾比為3：4：4：3：3。

所述的PCR體系總體積25μL，其中含有cDNA 2μL、10mmol/L dNTPs 3μL、rTaq 5U、25mmol/L的MgCl₂1.5μL以及10μmol/L的CiLCV、CGMMV、ZYMV、MABYV和WMV上下游引物分別為0.3μL、0.4μL、0.4μL、0.3μL、0.3μL。

所述PCR擴(kuò)增反應(yīng)條件為：94℃預(yù)變性3分鐘；按照以下條件進(jìn)行40個(gè)循環(huán)：94℃變性30秒、55℃復(fù)性45秒、72℃延伸90秒；循環(huán)結(jié)束再72℃延伸10分鐘。

上述方法在同步檢測農(nóng)作物五種西瓜病毒病原CiLCV、CGMMV、ZYMV、MABYV和WMV中的應(yīng)用。

所述農(nóng)作物為西瓜。

一種檢測試劑盒，含有上述五對引物。

本發(fā)明提供的CiLCV、CGMMV、ZYMV、MABYV和WMV五種病毒的特異性引物對，通過RT-PCR分別可以獲得1464bp，1023bp，810bp，600bp和327bp的單一的特異性條帶。通過對PCR反應(yīng)體系和條件的優(yōu)化，建立了同步檢測上述五種病毒的多重RT-PCR體系，突破了同步檢測侵染西瓜的CiLCV、CGMMV、ZYMV、MABYV和WMV等五種病毒的技術(shù)瓶頸，也可以為其他病毒病原的鑒定提供借鑒。具體發(fā)明內(nèi)容涉及到：1)病毒RNA的提??；2)特異性引物對的設(shè)計(jì)和特異性分析；3)五種病毒的單重PCR鑒定體系；4)多重PCR檢測體系的建立與優(yōu)化；5)多重PCR體系靈敏度的測定；6)多重PCR體系在田間樣品檢測中的應(yīng)用。本發(fā)明的多重PCR的最佳體系和條件經(jīng)優(yōu)化確定為：10mmol/L dNTPs 3μL、rTaq 5U、25mmol/L MgCl₂1.5μL，以及55℃的退火溫度。多重PCR擴(kuò)增的最佳反應(yīng)條件為：94℃預(yù)變性3分鐘；按照94℃變性30秒、55℃復(fù)性45秒、72℃延伸90秒循環(huán)40次；最后72℃延伸10分鐘。

所述五種病毒的特異性引物對可作為組合同步檢測西瓜上的CiLCV、CGMMV、ZYMV、MABYV和WMV五種病毒，PCR檢測均能獲得單一的特異性條帶，可以用于鑒定五種西瓜病毒病原。

該檢測方法可制作成試劑盒，用于檢測五種病毒病原。

相比于現(xiàn)有技術(shù)，本發(fā)明具有以下優(yōu)點(diǎn)：

1.本發(fā)明首次提出在西瓜上同步檢測CiLCV、CGMMV、ZYMV、MABYV和WMV五種病毒病原，其中CiLCV為本實(shí)驗(yàn)報(bào)道的我國新紀(jì)錄種，國內(nèi)尚未見其檢測方法的報(bào)道(Xin et al.，Virus research，2017，232：106-112)；

2.本發(fā)明設(shè)計(jì)的檢測引物對具有特異性和兼容性，可以同時(shí)擴(kuò)增同一植株中的五種病毒；

3.本發(fā)明優(yōu)化了PCR擴(kuò)增的反應(yīng)體系和條件，在保證檢測結(jié)果準(zhǔn)確的前提下，極大地縮短了檢測時(shí)間，提高了檢測效率；

4.本發(fā)明反應(yīng)體系靈敏性好，該多重PCR體系的檢測底線是10^-2cDNA，可用于西瓜上五種病毒病害的早期監(jiān)測預(yù)警。

5.本發(fā)明是在同一個(gè)PCR體系中經(jīng)過一次擴(kuò)增反應(yīng)完成，既節(jié)約了病毒RNA和PCR擴(kuò)增體系種的各種試劑，最大程度的降低了檢測成本，節(jié)約了人力和時(shí)間。

附圖說明

圖1.五種病毒特異性引物的特異性示意圖.1a為引物對CiLCV-F(SEQ ID NO.1)/CiLCV-R(SEQ ID NO.2)的Primer-Blast檢索結(jié)果；1b為引物對CGMMV-F(SEQ ID NO.3)/CGMMV-R(SEQ ID NO.4)的Primer-Blast檢索結(jié)果；1c為引物對ZYMV-F(SEQ ID NO.5)/ZYMV-R(SEQ ID NO.6)的Primer-Blast檢索結(jié)果；1d為引物對MABYV-F(SEQ ID NO.7)/MABYV-R(SEQ ID NO.8)的Primer-Blast檢索結(jié)果；1e為引物對WMV-F(SEQ ID NO.9)/WMV-R(SEQ ID NO.10)的Primer-Blast檢索結(jié)果。

圖2.五種病毒特異性引物的特異性檢測

泳道M代表核酸標(biāo)準(zhǔn)分子量(DL2000 DNA Marker)，從上到下依次為2000bp、1000bp、750bp、500bp和 250bp；泳道1為以CiLCV、CGMMV、ZYMV、MABYV、WMV、TMV和CMV等7種病毒的混合RNA為模板，本發(fā)明設(shè)計(jì)的五對病毒引物的RT-PCR擴(kuò)增結(jié)果；泳道2為以CiLCV、CGMMV、ZYMV、MABYV和WMV等5種病毒的混合RNA為模板，本發(fā)明設(shè)計(jì)的五對病毒引物的RT-PCR擴(kuò)增結(jié)果；泳道3為健康植株；泳道4～10分別為CiLCV、ZYMV、CGMMV、MABYV、WMV、TMV和CMV等7種病毒的陽性對照。

圖3.五種病毒特異性引物的單重PCR擴(kuò)增結(jié)果

泳道M代表核酸標(biāo)準(zhǔn)分子量(DL2000DNA Marker)，從上到下依次為2000bp、1000bp、750bp、500bp和 250bp；泳道2為健康植株的擴(kuò)增結(jié)果(陰性對照)，未擴(kuò)增到如何條帶；泳道2～6分別為西瓜標(biāo)樣中CiLCV、CGMMV、ZYMV、MABYV和WMV的特異性條帶。

圖4.五種病毒特異性引物的兼容性PCR擴(kuò)增結(jié)果

泳道M代表核酸標(biāo)準(zhǔn)分子量(DL2000DNA Marker)，從上到下分別為2000bp、1000bp、750bp、500bp和250bp；泳道1為以五種病毒復(fù)合侵染的西瓜植株的總RNA為模板，用五種病毒的特異性引物同時(shí)擴(kuò)增的結(jié)果；泳道2為健康植株；泳道3～7分別為CiLCV、CGMMV、ZYMV、MABYV和WMV五種病毒特異性引物的擴(kuò)增結(jié)果。

圖5.多重PCR體系的優(yōu)化

A:退火溫度的優(yōu)化，泳道1～4分別為51℃、53℃、55℃和57℃；B:dNTPs用量的優(yōu)化，泳道1～5分別為2μL、3μL、4μL、5μL和6μL；C:rTaq用量的優(yōu)化，泳道1～5分別為2.5U、3.75U、5U、6.25U和7.5U；圖中M代表核酸標(biāo)準(zhǔn)分子量(DL2000DNA Marker)，從上到下分別為2000bp、1000bp、750bp、500bp和250bp。

圖6.多重PCR體系的靈敏度測定

泳道M代表核酸標(biāo)準(zhǔn)分子量(DL2000DNA Marker)，從上到下分別為2000bp、1000bp、750bp、500bp和250bp；泳道1～5的cDNA濃度分別為10^-1～10^-4。

圖7.應(yīng)用多重PCR體系檢測田間西瓜標(biāo)樣

泳道M代表核酸標(biāo)準(zhǔn)分子量(DL2000DNA Marker)，從上到下分別為2000bp、1000bp、750bp、500bp和250bp；泳道1～10分別為田間西瓜植株標(biāo)樣。

具體實(shí)施方式

下面結(jié)合具體實(shí)施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明，這些實(shí)施例僅用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。

下面所用試劑均為市售。

實(shí)施例1.西瓜葉組織總RNA的提取

采用美國Invitrogen公司的TRIzol試劑提取健康及被CiLCV、CGMMV、ZYMV、MABYV和WMV等5種病毒復(fù)合侵染的西瓜植株的總RNA。操作步驟如下：1)取新鮮或冰凍的西瓜葉片加液氮充分研磨后，迅速轉(zhuǎn)移100mg干粉組織至1.5ml經(jīng)DEPC水處理的無菌離心管中；2)加入1mL TRIzol試劑、充分搖勻，室溫靜置5分鐘；3)加入0.2mL氯仿，劇烈搖動(dòng)15秒，室溫靜置3分鐘；12000g/4℃下離心15分鐘；4)取上清，加入等體積的異丙醇，混勻，冰浴10分鐘；12000g/4℃下離心15分鐘，去上清；5)沉淀中加入1mL預(yù)冷的75％乙醇(無菌DEPC水配制)洗滌，7500g/4℃下離心5分鐘，重復(fù)洗滌沉淀3次；6)干燥沉淀，加50μL DEPC水溶解，此即為西瓜的總RNA溶液。7)將總RNA溶液稀釋50倍，用紫外分光光度計(jì)測定260nm和280nm的OD值，計(jì)算RNA樣品的純度和含量，按260nm處1OD約為單鏈RNA 40μg/mL計(jì)算RNA含量，合格樣品直接使用或-70℃保存、備用。

實(shí)施例2.五種病毒特異性引物的設(shè)計(jì)

根據(jù)NCBI公布的CiLCV、CGMMV、ZYMV、MABYV和WMV等5種病毒的核苷酸序列，采用Vector NTI軟件分別設(shè)計(jì)每種病毒的特異性引物對，每對引物退火溫度相似(51.9℃～59.9℃)，具有一定的保守性，擴(kuò)增產(chǎn)物不形成二級機(jī)構(gòu)，GC含量在40％-60％之間；五對引物之間堿基不互補(bǔ)，引物由上海生物工程有限公司合成(5種病毒的特異性引物情況見表1)。

表1.CiLCV、CGMMV、ZYMV、MABYV和WMV五種病毒的特異性引物

實(shí)施例3.五種病毒引物的特異性分析

利用實(shí)施例2中所設(shè)計(jì)的5對引物分別可以通過RT-PCR檢測CiLCV、CGMMV、ZYMV、MABYV和WMV等5種病毒。與CiLCV同屬于丁型雙分病毒屬(Deltapartitivirus)的其余5種病毒分別是甜菜潛隱病毒2號(Beet cryptic virus 2，BCV2)、甜菜潛隱病毒3號(Beet cryptic virus 3，BCV3)、無花果隱病毒(Fig cryptic virus，F(xiàn)CV)、辣椒隱病毒1號(Pepper cryptic virus 1，PCV1)和辣椒隱病毒2號(Pepper cryptic virus 2，PCV2)，均未見侵染西瓜的報(bào)道。同樣與MABYV同屬于馬鈴薯卷葉病毒屬(Polerovirus)的另外16種病毒，也皆未見有侵染西瓜的報(bào)道。而ZYMV和WMV同屬馬鈴薯Y病毒屬(Potyvirus)，在本體系中采用二者的引物并未擴(kuò)增出對方的條帶，說明二者的引物均具有唯一性。但與CGMMV同屬于煙草花葉病毒屬(Tobamovirus)的TMV能夠侵染西瓜，且為西瓜上常見病毒，下面本發(fā)明采用RT-PCR和數(shù)據(jù)庫檢索的方法證明其引物具有特異性。

為了確保本發(fā)明所設(shè)計(jì)引物的特異性，采用NCBI的在線比對軟件Primer-BLAST(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/)對實(shí)施例2中所設(shè)計(jì)引物的特異性進(jìn)行了檢索。檢索設(shè)置擴(kuò)增長度為100～2000bp，最大擴(kuò)增產(chǎn)物長度為2000bp，檢索NR(All non-redundant GenBank CDS translations+RefSeq Proteins+PDB+SwissProt+PIR+PRF)數(shù)據(jù)庫的所有物種。結(jié)果顯示：以CiLCV-F(SEQ ID NO.1)/CiLCV-R(SEQ ID NO.2)引物對進(jìn)行Primer-Blast，僅檢索到一條長度為1464bp的可能產(chǎn)物，屬于本發(fā)明涉及的CiLCV，未檢索到其它物種(如圖1中1-a)；以CGMMV-F(SEQ ID NO.3)/CGMMV-R(SEQ ID NO.4)為引物對進(jìn)行Primer-Blast，共檢索獲得長度為1023bp的可能產(chǎn)物55條，均屬于CGMMV，未檢索到其它物種(如圖1中1-b)；以ZYMV-F(SEQ ID NO.5)/ZYMV-R(SEQ ID NO.6)為引物對進(jìn)行Primer-Blast檢索，共獲得68條長度為810bp的可能產(chǎn)物，均屬于ZYMV，未檢索到其它物種(如圖1中1-c)；以MABYV-F(SEQ ID NO.7)/MABYV-R(SEQ ID NO.8)進(jìn)行Primer-Blast檢索，共獲得1條長度為600bp的可能產(chǎn)物，屬于MABYV，除此之外未檢索到其它物種(如圖1中1-d)；以WMV-F(SEQ ID NO.9)/WMV-R(SEQ ID NO.10)為引物對進(jìn)行Primer-Blast檢索，共獲得73條長度為327bp的可能產(chǎn)物，均屬于WMV，除此之外未檢索到其它物種(如圖1中1-e)。

本發(fā)明還設(shè)計(jì)了與CGMMV同屬的TMV以及西瓜常見病毒CMV的特異性引物，通過RT-PCR驗(yàn)證了引物的特異性。TMV上下游引物分別為TWV-F：5′-ATGGCTCTAGTTGTTAAAGG-3′和TWV-R：5′-TCGGCACTGACCGATCATTA-3′；CMV上游引物CMV-F序列為：5′-TTGATTCTACCGTGTGGGTG-3′，下游引物CMV-R序列為：5′-GTCCGTAACTACGTTTAGTGACTTC-3′。利用本發(fā)明所設(shè)計(jì)的5對病毒引物，分別以CiLCV、CGMMV、ZYMV、MABYV、WMV 5種病毒RNA及加上TMV和CMV的7種病毒的RNA為模板，同時(shí)進(jìn)行RT-PCR，擴(kuò)增結(jié)果表明：利用本發(fā)明所設(shè)計(jì)的5種病毒引物不能擴(kuò)增出TMV和CMV的目的條帶，僅能擴(kuò)增出CiLCV、CGMMV、ZYMV、MABYV和WMV 5種病毒的特異性條帶(圖2)。實(shí)驗(yàn)設(shè)置健康植株為陰性對照，7對引物單獨(dú)擴(kuò)增7種病毒為陽性對照。因此，本發(fā)明所設(shè)計(jì)的引物具有特異性，檢測結(jié)果準(zhǔn)確可信。

實(shí)施例4.五種西瓜病毒的單重RT-PCR體系

cDNA的合成：反應(yīng)總體積為20μL，其中西瓜總RNA 0.5μg～1μg，10μmol/L通用引物Oligo(dT)18 2μL，DEPC處理的ddH₂O 8μL，混勻后90℃變性2～3min，置冰上2min；再依次加入5×MMLV Buffer 4μL，10mmol/L dNTPs 2μL，M-MLV反轉(zhuǎn)錄酶(Takara,Dalian,China)1μL以及RRI(Takara,Dalian,China)0.5μL。混勻后，37℃孵育1hr，70℃10min。即可合成cDNA。

PCR反應(yīng)體系：反應(yīng)總體積為25μL，其中cDNA 2μL，10×PCR Buffer(15mmol/L Mg²⁺)2.5μL，10mmol/L dNTPs 2μL，10μmol/L的上下游引物各0.3μL，rTaq(Takara,Dalian,China)1.5U，加ddH₂O補(bǔ)齊25μL。擴(kuò)增條件為94℃預(yù)變性3min，94℃30s、55℃45s和72℃90s共40個(gè)循環(huán)，最后72℃延伸10min。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物在1％瓊脂糖凝膠上電泳，電壓每厘米2伏，電泳1.5～2小時(shí)，紫外下觀察照像。電泳結(jié)果顯示：用CiLCV、CGMMV、ZYMV、MABYV和WMV各自的特異性引物分別擴(kuò)增獲得了1464bp、1023bp、810bp、600bp和327bp的單一條帶(圖3泳道2～6)。

將電泳條帶回收、純化、連接到pEASY-T5載體(北京全式金生物技術(shù)有限公司)，采用凍融法轉(zhuǎn)化Trans-T1的感受態(tài)細(xì)胞(北京全式金生物技術(shù)有限公司)，選取3個(gè)PCR陽性單克隆，經(jīng)北京六合華大基因科技有限公司測序，采用Vector NTI軟件比對，結(jié)果表明獲得的CiLCV、CGMMV、ZYMV、MABYV和WMV五種病毒序列與原參考序列相應(yīng)片段的一致性分別為99.3％、98.1％、99.2％、98.9％、98.5％，均在98％以上，證明了擴(kuò)增結(jié)果的正確性。

實(shí)施例5.五種病毒的多重RT-PCR體系的建立

多重PCR反應(yīng)是在一個(gè)PCR反應(yīng)體系中同時(shí)檢測多種病毒，因此多重PCR反應(yīng)體系中的RNA和引物均為多種病毒RNA和特異性引物對的混合物，其他設(shè)計(jì)如反轉(zhuǎn)錄酶、RNA聚合酶、dNTPs等的濃度相同。本發(fā)明中所用核苷酸模板為CiLCV、CGMMV、ZYMV、MABYV和WMV五種病毒同時(shí)侵染的西瓜植株的總RNA；引物為五種病毒特異性引物對的混合物，引物對的最佳比例為CiLCV：CGMMV：ZYMV：MABYV：WMV＝3：4：4：3：3，結(jié)果表明5對引物分別擴(kuò)增到1464bp、1023bp、810bp、600bp和327bp的單一條帶，具有良好的兼容性(圖4，泳道1)。

PCR反應(yīng)體系的優(yōu)化：本發(fā)明對不同的退火溫度、dNTPs和rTaq濃度等做了優(yōu)化。退火溫度設(shè)置有51、53、55和57℃4個(gè)梯度；在25μL的總反應(yīng)體積中，dNTPs用量設(shè)置有2、3、4、5和6μL的5個(gè)梯度，rTaq用量設(shè)置有2.5、3.75、5、6.25和7.5U的5個(gè)梯度，優(yōu)化結(jié)果表明：最佳退火溫度為55℃，10mM的dNTPs 3μL和rTaq 5U(如圖5)。

最佳的多重RT-PCR體系為：cDNA合成反應(yīng)總體積為20μL，其中西瓜總RNA 1μg，10μmol/L通用引物Oligo(dT)18 2μL,DEPC處理的ddH₂O 8μL，混勻后90℃變性1min，立刻置冰上2min；再依次加入10mmol/L dNTPs 2μL,5×MMLV Buffer 4μL，M-MLV反轉(zhuǎn)錄酶(Takara,Dalian,China)1μL以及RRI(Takara,Dalian,China)0.5μL。混勻后，37℃孵育1hr,70℃10min。取上述合成體系中的cDNA 2μL,10×PCR Buffer(15mmol/L Mg²⁺)2.5μL,10mmol/L dNTPs 3μL,rTaq(Takara,Dalian,China)5U，及CiLCV、CGMMV、ZYMV、MABYV和WMV上下游引物各0.3、0.4、0.4、0.3、0.3μL，加ddH₂O補(bǔ)齊25μL。

最佳反應(yīng)條件為：94℃預(yù)變性3分鐘；94℃變性30秒、55℃退火45秒、72℃延伸90秒，共40個(gè)循環(huán)；最后72℃延伸10分鐘。

PCR反應(yīng)產(chǎn)物在1％瓊脂糖凝膠上電泳，電壓每厘米2伏，電泳1.5～2小時(shí)，紫外下觀察照像。電泳結(jié)果顯示：用BCiLCV、CGMMV、ZYMV、MABYV和WMV各自的特異性引物分別擴(kuò)增獲得了1464bp、1023bp、810bp、600bp和327bp的單一條帶(圖3泳道3～6)。

實(shí)施例6.多重PCR體系的靈敏度測定

將按照實(shí)施例4獲得的cDNA濃度分別稀釋10，100，1000，10000倍(即10^-1-10^-4)，其他PCR擴(kuò)增條件不變，結(jié)果表明當(dāng)cDNA稀釋10倍和100倍時(shí)均能很好的檢測出CiLCV、CGMMV、ZYMV、MABYV和WMV五種病毒；當(dāng)稀釋1000倍時(shí)，雖然CGMMV變得清晰，但是CiLCV已經(jīng)完全檢測不到，ZYMV開始模糊；而當(dāng)稀釋到10000倍時(shí)，CiLCV和ZYMV已經(jīng)完全檢測不到，CGMMV也開始變得模糊。而MABYV和WMV在這四個(gè)濃度梯度下皆能檢測得到(如圖6)，因此，該多重PCR體系的檢測底線是10^-2cDNA。

實(shí)施例7五種病毒多重RT-PCR體系的應(yīng)用

我們應(yīng)用本發(fā)明中所建立的多重RT-PCR體系對2015和2016年采集自河南開封的10個(gè)西瓜標(biāo)樣進(jìn)行檢測，結(jié)果表明：其中2個(gè)樣品為CiLCV、CGMMV、ZYMV、MABYV和WMV五種病毒的復(fù)合侵染型(圖7，泳道3和6)，占檢測樣品的20％；2個(gè)樣品為CGMMV、ZYMV、MABYV和WMV四種病毒的復(fù)合侵染型(圖7，泳道4和8)，占檢測樣品的20％；4個(gè)樣品為ZYMV、MABYV和WMV三種病毒的復(fù)合侵染型(圖7，泳道1、2、7和10)，占檢測樣品的40％；2個(gè)樣品為WMV單獨(dú)侵染(圖7，泳道5和9)，占檢測樣品的20％。PCR產(chǎn)物的序列分析結(jié)果與參考序列相應(yīng)片段的一致性均在98％以上，說明本發(fā)明建立的多重RT-PCR檢測體系可用于田間標(biāo)樣的檢測，且結(jié)果可靠。

SEQUENCE LISTING

<110> 中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所

<120> 一種同步檢測5種西瓜病毒的多重RT-PCR方法及其應(yīng)用

<130> PP17036-ZWB

<160> 10

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 22

<212> DNA

<213> 擴(kuò)增CiLCV的特異性引物的核苷酸序列1

<400> 1

cattggtgga gcacaaaaca aa 22

<210> 2

<211> 20

<212> DNA

<213> 擴(kuò)增CiLCV的特異性引物的核苷酸序列2

<400> 2

ttgcgtctta gcctatctgc 20

<210> 3

<211> 20

<212> DNA

<213> 擴(kuò)增CGMMV的特異性引物的核苷酸序列1

<400> 3

gttgcgagga atgtgatgta 20

<210> 4

<211> 20

<212> DNA

<213> 擴(kuò)增CGMMV的特異性引物的核苷酸序列2

<400> 4

aagactgtct gcgaacctcc 20

<210> 5

<211> 20

<212> DNA

<213> 擴(kuò)增ZYMV的特異性引物的核苷酸序列1

<400> 5

agcaaactgt ggcagacgct 20

<210> 6

<211> 20

<212> DNA

<213> 擴(kuò)增ZYMV的特異性引物的核苷酸序列2

<400> 6

ctagtaaggt atgcatgttt 20

<210> 7

<211> 22

<212> DNA

<213> 擴(kuò)增MABYV的特異性引物的核苷酸序列1

<400> 7

ttggaggtta tgcagatttt cg 22

<210> 8

<211> 22

<212> DNA

<213> 擴(kuò)增MABYV的特異性引物的核苷酸序列2

<400> 8

gccggtcatc agtatcaagt ct 22

<210> 9

<211> 20

<212> DNA

<213> 擴(kuò)增WMV的特異性引物的核苷酸序列1

<400> 9

tcgaatacaa gcccaatcaa 20

<210> 10

<211> 20

<212> DNA

<213> 擴(kuò)增WMV的特異性引物的核苷酸序列2

<400> 10

acggactttc agagtttctc 20