本發(fā)明涉及楔天牛鑒定技術(shù)領(lǐng)域，具體為進(jìn)境植物檢疫性有害生物八點(diǎn)楔天牛的快速鑒定方法。
背景技術(shù)：
八點(diǎn)楔天牛Saperda octopunctata Scopoli，1772屬昆蟲綱、鞘翅目、天?？?、溝脛天牛亞科、楔天牛屬。楔天牛屬非中國(guó)種(Saperda spp.)為我國(guó)進(jìn)境植物檢疫性有害生物，八點(diǎn)楔天牛Saperda octopuntata Scopoli是我國(guó)未有分布的楔天牛屬的非中國(guó)種。寄主：闊葉樹，主要為害椴木(Tilia)，也對(duì)楊樹(Populus)和榆樹(Ulmus)造成為害。地理分布：奧地利、斯洛文尼亞、俄羅斯、瑞士、克羅地亞、波黑、捷克、斯洛伐克、馬達(dá)維、法國(guó)、烏克蘭、阿爾巴尼亞、波蘭、羅馬尼亞、南斯拉夫、意大利、匈牙利、德國(guó)、希臘、比利時(shí)、西班牙。生物學(xué)習(xí)性：八點(diǎn)楔天牛是蛀干害蟲，主要在幼蟲期為害樹木。為害狀主要為侵入孔、蛀屑、蟲糞、羽化孔、幼蟲的排糞孔、膨大的蟲瘤、刻槽或空洞眼等。成蟲出孔后補(bǔ)充營(yíng)養(yǎng)，取食葉片和嫩梢造成掉葉斷梢，影響樹木景觀和生長(zhǎng)，并在枝條嫩梢和樹干上咬食形成產(chǎn)卵刻槽。幼蟲先在樹皮下取食，后鉆入木質(zhì)部，在樹干內(nèi)部形成縱橫交錯(cuò)的蟲道。成蟲和幼蟲為害造成的刻槽、排糞孔、羽化孔在樹干表面形成蟲瘤或空洞眼，受害樹干極易風(fēng)折，引起幼樹死亡，老樹折斷或斷枝。
傳統(tǒng)檢疫鑒定方法為根據(jù)昆蟲的外部形態(tài)特征鑒定和判別是否為禁止入境的檢疫性有害生物；現(xiàn)有技術(shù)主要注重的是八點(diǎn)楔天牛的外部形態(tài)特征鑒別，當(dāng)蟲態(tài)不是適合形態(tài)鑒定的成蟲或蟲體不完整時(shí)，就無法鑒定準(zhǔn)確到種。針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)的缺點(diǎn)，本發(fā)明的分子生物學(xué)方法有效解決了非成蟲蟲態(tài)或蟲體不完整時(shí)的檢測(cè)鑒定問題。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：
本發(fā)明的目的在于提供一種進(jìn)境植物檢疫性有害生物八點(diǎn)楔天牛的快速鑒定方法，以解決上述背景技術(shù)中提出的問題。
為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明提供如下技術(shù)方案：進(jìn)境植物檢疫性有害生物八點(diǎn)楔天牛的快速鑒定方法，包括以下步驟：
A、提取八點(diǎn)楔天牛及楔天牛屬DNA；
B、對(duì)八點(diǎn)楔天牛及楔天牛屬DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增；
C、PCR產(chǎn)物保存一段時(shí)間后測(cè)序；
D、序列比對(duì)，確定楔天牛種類。
優(yōu)選的，所述步驟B中PCR擴(kuò)增方法包括以下步驟：
A、將對(duì)象PCR加入模版DNA2ul以及秋水仙素溶液中，并將混合物搖勻；
B、將秋水仙素溶液升溫至85℃-95℃，使混合物變性，反應(yīng)時(shí)間為50s-80s；之后對(duì)其進(jìn)行鏈霉親和素修飾；
C、對(duì)步驟B修飾后的混合液快速冷卻至50℃-60℃進(jìn)行退火處理；退火時(shí)間為30s-60s；
D、對(duì)步驟C退火后的混合液再次升溫至80℃-90℃，時(shí)間為30s-60s，進(jìn)行二次變性；
E、最后在磁富集單重PCR的基礎(chǔ)之上，對(duì)以上三個(gè)個(gè)位點(diǎn)進(jìn)行磁富集多重PCR擴(kuò)增。
優(yōu)選的，所述步驟C中保存液包括乙酸鈉、乙二胺四乙酸二鈉和糖原；所述保存液中乙酸鈉的濃度為1mol/L-2mol/L，乙二胺四乙酸二鈉的濃度為0.02mol/L-0.06mol/L，糖原的濃度為2g/L-6g/L。
優(yōu)選的，所述步驟C中保存時(shí)間為30min-90min。
與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的有益效果是：本發(fā)明有效解決了非成蟲蟲態(tài)或蟲體不完整時(shí)的檢測(cè)鑒定問題，能快速識(shí)別和鑒定出八點(diǎn)楔天牛及其楔天牛屬部分近似種，防止有害生物傳入中國(guó)，以免對(duì)中國(guó)的農(nóng)林生產(chǎn)和生態(tài)環(huán)境造成破壞，并能顯著提高八點(diǎn)楔天牛的疫情截獲率；本發(fā)明采用的PCR擴(kuò)增方法操作簡(jiǎn)單，有效避免蛋白氨基酸丟失，且穩(wěn)定性好，表達(dá)量高；另外本發(fā)明中采用的保存液能夠提高PCR測(cè)序中間產(chǎn)物在保存后的測(cè)序成功率，進(jìn)一步提高了鑒定效率。
具體實(shí)施方式
下面對(duì)本發(fā)明實(shí)施例中的技術(shù)方案進(jìn)行清楚、完整地描述，顯然，所描述的實(shí)施例僅僅是本發(fā)明一部分實(shí)施例，而不是全部的實(shí)施例?；诒景l(fā)明中的實(shí)施例，本領(lǐng)域普通技術(shù)人員在沒有做出創(chuàng)造性勞動(dòng)前提下所獲得的所有其他實(shí)施例，都屬于本發(fā)明保護(hù)的范圍。
實(shí)施例一：
進(jìn)境植物檢疫性有害生物八點(diǎn)楔天牛的快速鑒定方法，包括以下步驟：
A、提取八點(diǎn)楔天牛及楔天牛屬DNA；
B、對(duì)八點(diǎn)楔天牛及楔天牛屬DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增；
C、PCR產(chǎn)物保存一段時(shí)間后測(cè)序；
D、序列比對(duì)，確定楔天牛種類。
本實(shí)施例中，步驟B中PCR擴(kuò)增方法包括以下步驟：
A、將對(duì)象PCR加入模版DNA2ul以及秋水仙素溶液中，并將混合物搖勻；
B、將秋水仙素溶液升溫至85℃，使混合物變性，反應(yīng)時(shí)間為50s；之后對(duì)其進(jìn)行鏈霉親和素修飾；
C、對(duì)步驟B修飾后的混合液快速冷卻至50℃進(jìn)行退火處理；退火時(shí)間為30s；
D、對(duì)步驟C退火后的混合液再次升溫至80℃，時(shí)間為30s，進(jìn)行二次變性；
E、最后在磁富集單重PCR的基礎(chǔ)之上，對(duì)以上三個(gè)個(gè)位點(diǎn)進(jìn)行磁富集多重PCR擴(kuò)增。
本實(shí)施例中，步驟C中保存液包括乙酸鈉、乙二胺四乙酸二鈉和糖原；所述保存液中乙酸鈉的濃度為1mol/L，乙二胺四乙酸二鈉的濃度為0.02mol/L，糖原的濃度為2g/L；保存時(shí)間為30min。
實(shí)施例二：
進(jìn)境植物檢疫性有害生物八點(diǎn)楔天牛的快速鑒定方法，包括以下步驟：
A、提取八點(diǎn)楔天牛及楔天牛屬DNA；
B、對(duì)八點(diǎn)楔天牛及楔天牛屬DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增；
C、PCR產(chǎn)物保存一段時(shí)間后測(cè)序；
D、序列比對(duì)，確定楔天牛種類。
本實(shí)施例中，步驟B中PCR擴(kuò)增方法包括以下步驟：
A、將對(duì)象PCR加入模版DNA2ul以及秋水仙素溶液中，并將混合物搖勻；
B、將秋水仙素溶液升溫至95℃，使混合物變性，反應(yīng)時(shí)間為80s；之后對(duì)其進(jìn)行鏈霉親和素修飾；
C、對(duì)步驟B修飾后的混合液快速冷卻至60℃進(jìn)行退火處理；退火時(shí)間為60s；
D、對(duì)步驟C退火后的混合液再次升溫至90℃，時(shí)間為60s，進(jìn)行二次變性；
E、最后在磁富集單重PCR的基礎(chǔ)之上，對(duì)以上三個(gè)個(gè)位點(diǎn)進(jìn)行磁富集多重PCR擴(kuò)增。
本實(shí)施例中，步驟C中保存液包括乙酸鈉、乙二胺四乙酸二鈉和糖原；所述保存液中乙酸鈉的濃度為2mol/L，乙二胺四乙酸二鈉的濃度為0.06mol/L，糖原的濃度為6g/L；保存時(shí)間為90min。
實(shí)施例三：
進(jìn)境植物檢疫性有害生物八點(diǎn)楔天牛的快速鑒定方法，包括以下步驟：
A、提取八點(diǎn)楔天牛及楔天牛屬DNA；
B、對(duì)八點(diǎn)楔天牛及楔天牛屬DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增；
C、PCR產(chǎn)物保存一段時(shí)間后測(cè)序；
D、序列比對(duì)，確定楔天牛種類。
本實(shí)施例中，步驟B中PCR擴(kuò)增方法包括以下步驟：
A、將對(duì)象PCR加入模版DNA2ul以及秋水仙素溶液中，并將混合物搖勻；
B、將秋水仙素溶液升溫至88℃，使混合物變性，反應(yīng)時(shí)間為60s；之后對(duì)其進(jìn)行鏈霉親和素修飾；
C、對(duì)步驟B修飾后的混合液快速冷卻至52℃進(jìn)行退火處理；退火時(shí)間為35s；
D、對(duì)步驟C退火后的混合液再次升溫至82℃，時(shí)間為35s，進(jìn)行二次變性；
E、最后在磁富集單重PCR的基礎(chǔ)之上，對(duì)以上三個(gè)個(gè)位點(diǎn)進(jìn)行磁富集多重PCR擴(kuò)增。
本實(shí)施例中，步驟C中保存液包括乙酸鈉、乙二胺四乙酸二鈉和糖原；所述保存液中乙酸鈉的濃度為1.2mol/L，乙二胺四乙酸二鈉的濃度為0.03mol/L，糖原的濃度為3g/L；保存時(shí)間為40min。
實(shí)施例四：
進(jìn)境植物檢疫性有害生物八點(diǎn)楔天牛的快速鑒定方法，包括以下步驟：
A、提取八點(diǎn)楔天牛及楔天牛屬DNA；
B、對(duì)八點(diǎn)楔天牛及楔天牛屬DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增；
C、PCR產(chǎn)物保存一段時(shí)間后測(cè)序；
D、序列比對(duì)，確定楔天牛種類。
本實(shí)施例中，步驟B中PCR擴(kuò)增方法包括以下步驟：
A、將對(duì)象PCR加入模版DNA2ul以及秋水仙素溶液中，并將混合物搖勻；
B、將秋水仙素溶液升溫至92℃，使混合物變性，反應(yīng)時(shí)間為70s；之后對(duì)其進(jìn)行鏈霉親和素修飾；
C、對(duì)步驟B修飾后的混合液快速冷卻至58℃進(jìn)行退火處理；退火時(shí)間為50s；
D、對(duì)步驟C退火后的混合液再次升溫至88℃，時(shí)間為50s，進(jìn)行二次變性；
E、最后在磁富集單重PCR的基礎(chǔ)之上，對(duì)以上三個(gè)個(gè)位點(diǎn)進(jìn)行磁富集多重PCR擴(kuò)增。
本實(shí)施例中，步驟C中保存液包括乙酸鈉、乙二胺四乙酸二鈉和糖原；所述保存液中乙酸鈉的濃度為1.8mol/L，乙二胺四乙酸二鈉的濃度為0.05mol/L，糖原的濃度為5g/L；保存時(shí)間為80min。
實(shí)施例五：
進(jìn)境植物檢疫性有害生物八點(diǎn)楔天牛的快速鑒定方法，包括以下步驟：
A、提取八點(diǎn)楔天牛及楔天牛屬DNA；
B、對(duì)八點(diǎn)楔天牛及楔天牛屬DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增；
C、PCR產(chǎn)物保存一段時(shí)間后測(cè)序；
D、序列比對(duì)，確定楔天牛種類。
本實(shí)施例中，步驟B中PCR擴(kuò)增方法包括以下步驟：
A、將對(duì)象PCR加入模版DNA2ul以及秋水仙素溶液中，并將混合物搖勻；
B、將秋水仙素溶液升溫至90℃，使混合物變性，反應(yīng)時(shí)間為65s；之后對(duì)其進(jìn)行鏈霉親和素修飾；
C、對(duì)步驟B修飾后的混合液快速冷卻至55℃進(jìn)行退火處理；退火時(shí)間為45s；
D、對(duì)步驟C退火后的混合液再次升溫至85℃，時(shí)間為45s，進(jìn)行二次變性；
E、最后在磁富集單重PCR的基礎(chǔ)之上，對(duì)以上三個(gè)個(gè)位點(diǎn)進(jìn)行磁富集多重PCR擴(kuò)增。
本實(shí)施例中，步驟C中保存液包括乙酸鈉、乙二胺四乙酸二鈉和糖原；所述保存液中乙酸鈉的濃度為1.5mol/L，乙二胺四乙酸二鈉的濃度為0.04mol/L，糖原的濃度為4g/L；保存時(shí)間為60min。
本發(fā)明有效解決了非成蟲蟲態(tài)或蟲體不完整時(shí)的檢測(cè)鑒定問題，能快速識(shí)別和鑒定出八點(diǎn)楔天牛及其楔天牛屬部分近似種，防止有害生物傳入中國(guó)，以免對(duì)中國(guó)的農(nóng)林生產(chǎn)和生態(tài)環(huán)境造成破壞，并能顯著提高八點(diǎn)楔天牛的疫情截獲率；本發(fā)明采用的PCR擴(kuò)增方法操作簡(jiǎn)單，有效避免蛋白氨基酸丟失，且穩(wěn)定性好，表達(dá)量高；另外本發(fā)明中采用的保存液能夠提高PCR測(cè)序中間產(chǎn)物在保存后的測(cè)序成功率，進(jìn)一步提高了鑒定效率。
盡管已經(jīng)示出和描述了本發(fā)明的實(shí)施例，對(duì)于本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員而言，可以理解在不脫離本發(fā)明的原理和精神的情況下可以對(duì)這些實(shí)施例進(jìn)行多種變化、修改、替換和變型，本發(fā)明的范圍由所附權(quán)利要求及其等同物限定。