本發(fā)明涉及全自動醫(yī)療檢測設(shè)備領(lǐng)域，特別提供了一種用于幫助循環(huán)腫瘤細(xì)胞與抗體磁珠結(jié)合的外磁場輔助孵育裝置、方法及其應(yīng)用。

背景技術(shù)：

循環(huán)腫瘤細(xì)胞(Circulating tumor cell，CTC)是指從腫瘤上脫落并進(jìn)入循環(huán)系統(tǒng)的癌細(xì)胞，其可自發(fā)或通過診療操作從實(shí)體腫瘤病灶(原發(fā)灶或轉(zhuǎn)移灶)脫落，進(jìn)入體循環(huán)系統(tǒng)(如外周血)。大部分CTC進(jìn)入外周血后會發(fā)生凋亡或被吞噬，少數(shù)能夠逃逸并錨著病灶以外的組織或器官上，進(jìn)而發(fā)展成為轉(zhuǎn)移灶，增加惡性腫瘤患者死亡風(fēng)險。這些細(xì)胞可以通過簡單的血液檢測來發(fā)現(xiàn)，可作為癌癥的生物學(xué)標(biāo)志物，指示體內(nèi)是否存在腫瘤，以及它們的遺傳狀況和藥物敏感性。與手術(shù)干預(yù)不同，CTC與縱向研究兼容，能夠有效指導(dǎo)治療。CTC檢測可有效地應(yīng)用于體外早期診斷、預(yù)后評價、個體化治療(包括快速臨床化療藥物篩選和耐藥性的檢測)、腫瘤復(fù)發(fā)監(jiān)測及新的腫瘤藥物開發(fā)等。但CTC檢測步驟較多、操作繁瑣，也阻礙了該項(xiàng)技術(shù)在臨床上的推廣。

目前常規(guī)的CTC檢測分為兩個步驟，即CTC富集(或捕獲)步驟和CTC檢測分析步驟。常用的CTC捕獲技術(shù)有梯度密度離心技術(shù)、濾膜技術(shù)、流式細(xì)胞技術(shù)、微流控芯片技術(shù)和免疫磁珠技術(shù)。其中，免疫磁珠技術(shù)涉及試樣的混勻、細(xì)胞磁吸附等步驟，適合在大體積上樣條件下對少量的特殊細(xì)胞進(jìn)行分離，對于CTC檢測應(yīng)用尤其有利，其操作步驟相對簡單，易于實(shí)現(xiàn)自動化。

目前國內(nèi)已上市的循環(huán)腫瘤細(xì)胞富集設(shè)備是強(qiáng)生公司的cellsearch系統(tǒng)和ctcbiopsy系統(tǒng)(非磁捕獲系統(tǒng)，采用了物理過濾的方式)。為了更好地實(shí)現(xiàn)抗體磁珠與CTC細(xì)胞的結(jié)合，通常采用外磁場輔助孵育裝置對混合物進(jìn)行磁孵育。cellsearch系統(tǒng)就基于免疫磁珠分選原理，采用外磁體提升抗體磁珠對循環(huán)腫瘤細(xì)胞捕獲效率。具體地利用外磁體在導(dǎo)軌上的周期往返運(yùn)動，實(shí)現(xiàn)離心管中磁場的改變，但其結(jié)構(gòu)比較復(fù)雜，且在對試樣進(jìn)行吸附觀察時，發(fā)現(xiàn)磁珠與試樣結(jié)合的效率比較低。此外，由于使用外磁體周期往返運(yùn)動產(chǎn)生變化磁場，需要采用額外的電機(jī)對其進(jìn)行驅(qū)動，而不利于設(shè)備的小型化和集成化。

因此，本領(lǐng)域的技術(shù)人員致力于開發(fā)一種結(jié)構(gòu)簡單，便于設(shè)備集成化的外磁場孵育裝置，高效快速精確地完成孵育過程。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

有鑒于現(xiàn)有技術(shù)的上述缺陷，本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是提供一種外磁場輔助孵育裝置，包括至少一組磁體組合，所述磁體組合由分立的多塊柱狀磁體組成，每組所述磁體組合呈夾狀，其夾口形狀適于多塊所述柱狀磁體同時靠近或抵靠盛放待孵育物的容器器壁，所有所述柱狀磁體的同名磁極朝向所述夾口設(shè)置。

在本發(fā)明的一個較優(yōu)實(shí)施例中，其孵育裝置還包括驅(qū)動電機(jī)、離心裝置，所述驅(qū)動電機(jī)與所述磁體組合連接，用于驅(qū)動所述磁體組合靠近或抵靠所述離心裝置。其離心裝置更進(jìn)一步地采用步進(jìn)電機(jī)驅(qū)動。

在本發(fā)明的一個較優(yōu)實(shí)施例中，所述柱狀磁體為釹鐵硼磁體。

在本發(fā)明的一個較優(yōu)實(shí)施例中，所述磁體組合的高度為所述盛放待孵育物的容器的1/3～2/3。柱狀磁體的N-S方向?yàn)檩S向，垂直于N-S方向?yàn)榉ㄏ颉Ｓ善溆捎谑⒎糯跤锏娜萜魍ǔ楣軤钗?，而磁體提供的磁場需要覆蓋所有管內(nèi)液體，因此需要磁體在法向上具有一定的高度。

在本發(fā)明的一個較優(yōu)實(shí)施例中，所述柱狀磁體的數(shù)量為3。

本發(fā)明還提供了一種外磁場輔助的孵育方法，包括以下步驟：

磁體靠近離心管；

孵育；

攪拌混勻；

磁體離開離心管；

離心機(jī)轉(zhuǎn)動至少一個工位；

重復(fù)上述步驟直至孵育過程完成。

本發(fā)明還提供了上述外磁場輔助孵育裝置在循環(huán)腫瘤細(xì)胞檢測系統(tǒng)中的應(yīng)用。

本發(fā)明進(jìn)一步提供了上述外磁場輔助孵育方法在循環(huán)腫瘤細(xì)胞檢測系統(tǒng)中的應(yīng)用。

技術(shù)效果

本發(fā)明提供了一種外磁場孵育裝置及其使用方法，具有磁場強(qiáng)、裝置結(jié)構(gòu)簡單的特點(diǎn)，通過將其與驅(qū)動電機(jī)和離心裝置聯(lián)用，提高了設(shè)備的集成化、自動化程度。

以下將結(jié)合附圖對本發(fā)明的構(gòu)思、具體結(jié)構(gòu)及產(chǎn)生的技術(shù)效果作進(jìn)一步說明，以充分地了解本發(fā)明的目的、特征和效果。

附圖說明

圖1是本發(fā)明的一個優(yōu)選實(shí)施例中的磁體與離心管的結(jié)構(gòu)正視圖；

圖2是圖1實(shí)施例中磁體與離心管的結(jié)構(gòu)頂視圖；

圖3是圖1的等同實(shí)施例中磁體與離心管對的結(jié)構(gòu)頂視圖；

圖4是圖1實(shí)施例的磁體組合安裝于CTC腫瘤細(xì)胞檢測系統(tǒng)中的結(jié)構(gòu)頂視圖。

附圖標(biāo)記：1-釹鐵硼磁體，2-離心管，3-驅(qū)動電機(jī)，4-磁座，5-限位機(jī)構(gòu)。

具體實(shí)施方式

下面詳細(xì)描述本發(fā)明的實(shí)施例，所述實(shí)施例的示例在附圖中示出，其中自始至終相同或類似的標(biāo)號表示相同或類似的元件或具有相同或類似功能的元件。下面通過參考附圖描述的實(shí)施例是示例性的，旨在用于解釋本發(fā)明，而不能理解為對本發(fā)明的限制。

實(shí)施例1

本實(shí)施例提供了一種用于CTC循環(huán)腫瘤細(xì)胞檢測系統(tǒng)中的外磁場輔助孵育裝置，如圖1所示，該孵育裝置的功能部分結(jié)構(gòu)單元由一組三聯(lián)磁鐵組成，三聯(lián)磁鐵的高度h約為試管長度的1/2，以此保證磁場對整個試管內(nèi)盛發(fā)有抗體磁珠部分的全部覆蓋。

該三聯(lián)磁鐵為三塊柱狀釹鐵硼強(qiáng)磁鐵1的N極互相靠近組成的夾狀組合，由于同性相斥的作用，三塊釹鐵硼磁鐵1彼此靠近而不接觸，圍成的夾口形狀根據(jù)檢測系統(tǒng)中使用的離心管2尺寸計算得到，如圖2所示，其夾口大小恰好適合放入離心管2，同時保持與離心管2緊密接觸，從而保持對離心管2內(nèi)部抗體磁珠的引力，使得抗體磁珠在接近三聯(lián)磁體時可保持定向移動。

將該結(jié)構(gòu)單元安裝于CTC循環(huán)腫瘤細(xì)胞檢測系統(tǒng)中，可以利用與離心裝置的聯(lián)用提高設(shè)備的集成化程度。如圖3所示，將4組三聯(lián)磁鐵安裝于磁座4之上，由驅(qū)動電機(jī)3帶動磁座4與三聯(lián)磁鐵進(jìn)行運(yùn)動，驅(qū)動電機(jī)3推動磁座4運(yùn)動至最遠(yuǎn)端時，可接近抵靠離心管2下端，三聯(lián)磁鐵產(chǎn)生的強(qiáng)磁場，管中的抗體磁珠在磁場的作用下定向運(yùn)動能力提高，捕獲全血樣品中的分析物或提取物。而后，驅(qū)動電機(jī)3回復(fù)至起始位，該起始位位置由限位機(jī)構(gòu)5進(jìn)行限定，限位機(jī)構(gòu)5同軌道上的凸起配合限制了磁座4的移動行程，可配合驅(qū)動電機(jī)3實(shí)現(xiàn)在工作位置和起始位置的迅速轉(zhuǎn)移。圖3中僅給出了離心裝置中與磁座4配合的部分，本實(shí)施例中的離心平臺可容納12只離心管2，兩兩一組，離心平臺采用步進(jìn)電機(jī)驅(qū)動，因此可在每次完成磁珠定向移動后，迅速撤回磁座4，同時離心機(jī)構(gòu)旋轉(zhuǎn)兩個工位，使下兩組離心管2進(jìn)入工作位置，同時將三聯(lián)磁鐵抵靠至離心管2管壁。在離心管2隨離心盤緩慢運(yùn)動時，管中磁場消失；對管內(nèi)液體進(jìn)行攪拌混勻后，當(dāng)離心管2再次運(yùn)動靠近該輔助裝置時，實(shí)現(xiàn)與上述相同的功能。依次類推，通過磁珠數(shù)次反復(fù)的定向運(yùn)動，提高磁珠對分析物或提取物的結(jié)合概率/捕獲效率。整個過程可通過步進(jìn)電機(jī)和驅(qū)動電機(jī)3的移動速度，自動化地快速地完成抗體磁珠與CTC細(xì)胞結(jié)合的孵育過程。

以下詳述使用本實(shí)施例中的外磁場輔助孵育裝置完成CTC細(xì)胞和抗體磁珠結(jié)合過程的孵育過程的方法，方法包括以下步驟：

將盛發(fā)有待孵育物的離心管放入離心平臺的對應(yīng)位置；

入位檢測；

驅(qū)動電機(jī)驅(qū)動三聯(lián)磁體靠近離心管至工作位置，完成抗體磁珠定向移動；

保持一定時間的同時，利用攪拌裝置對非工作位置的離心管進(jìn)行攪拌混勻；

驅(qū)動電機(jī)驅(qū)動三聯(lián)磁體離開離心管至起始位置；

離心機(jī)旋轉(zhuǎn)兩個工位，使另外四只離心管進(jìn)入工作位置；

重復(fù)以上步驟，持續(xù)一定時間，直至整個孵育過程完成。

實(shí)施例2

將實(shí)施例1中的裝置用于提高抗體磁珠對分析物或提取物的捕獲效率，其中所述分析物或提取物為循環(huán)腫瘤細(xì)胞。

通過下面的試驗(yàn)驗(yàn)證后證實(shí)，本發(fā)明的裝置與cellsearch系統(tǒng)中的同功能結(jié)構(gòu)相比，可以大大提高抗體磁珠的捕獲效率，尤其是在全血樣品中捕獲循環(huán)腫瘤細(xì)胞的能力，便于對其進(jìn)行進(jìn)一步的磁富集。

試驗(yàn)?zāi)康暮驮O(shè)計：在全血基質(zhì)中手動提取CTC，對比不同外加磁場對CTC回收率的影響。

試驗(yàn)分組設(shè)置如下：

組1：采用強(qiáng)生試劑，全血加入人乳腺癌細(xì)胞SKBR3后加入混合的樣品稀釋緩沖液(DB)，磁珠，增強(qiáng)劑溶液，孵育條件三聯(lián)磁鐵磁場作用2min，滴管反復(fù)吹打混勻1min，靜置2min，做12個循環(huán)，用雙頭磁棒進(jìn)行提取，設(shè)置雙孔實(shí)驗(yàn)；

組2：全血加入SKBR3細(xì)胞后，加入混合好的強(qiáng)生DB、強(qiáng)生磁珠和Genovo增強(qiáng)劑，孵育條件：攪拌棒在全血不同位置間隔攪拌60min，用磁棒進(jìn)行提取，設(shè)置雙孔實(shí)驗(yàn)。

組3：采用強(qiáng)生試劑，全血加入SKBR3后加入混合的DB，磁珠，增強(qiáng)劑溶液，孵育條件強(qiáng)生磁鐵磁場作用2min，滴管反復(fù)吹打混勻1min，靜置2min，做12個循環(huán)，用雙頭磁棒進(jìn)行提取，設(shè)置雙孔實(shí)驗(yàn)；

所使用的試驗(yàn)材料參見下表1。

表1試驗(yàn)材料

操作步驟包括：

1.準(zhǔn)備：向用到的96孔板、14mL圓底離心管加入2％牛血清白蛋白(BSA)，室溫封閉10min，移液器吸頭使用前均在2％BSA中吹打5次。

2.細(xì)胞計數(shù)：吸盡并回收封閉96孔板的BSA，分別取50uL稀釋并染色好的SKBR3細(xì)胞，加入至封閉好的96孔板中，靜置，用EVOS(thermo公司生產(chǎn)的一臺全自動顯微成像系統(tǒng)，可以自動對細(xì)胞進(jìn)行成像掃描，并進(jìn)行半自動計數(shù))掃描并計數(shù)。

3.孵育：將計數(shù)好的細(xì)胞中加入清洗后的全血中，按照試驗(yàn)組的要求添加試劑，并進(jìn)行孵育1h。

4.吸附：放入磁棒進(jìn)行吸附，條件：磁棒在全血四個位置(每次移動距離為1.25cm)各靜置15分鐘，共吸附1h。

5.清洗：將磁棒轉(zhuǎn)移到含有5mL磷酸緩沖液(PBS)的24孔深孔板中進(jìn)行漂洗。

6.保存：將清洗后的磁棒轉(zhuǎn)移到含有3mL PBS的14mL圓底離心管中，等待計數(shù)。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果及討論：

表2各組試驗(yàn)結(jié)果對比

從表2中可以看出，在無外磁體的情況下，捕獲效率為79.7％；在使用強(qiáng)生外磁體時，捕獲效率為88.7％；而使用本發(fā)明的外磁體時，捕獲效率為103.5％。由此可知，本發(fā)明的外磁體可以大大提高捕獲效率。

以上詳細(xì)描述了本發(fā)明的較佳具體實(shí)施例。應(yīng)當(dāng)理解，本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員無需創(chuàng)造性勞動就可以根據(jù)本發(fā)明的構(gòu)思作出諸多修改和變化。因此，凡本技術(shù)領(lǐng)域中技術(shù)人員依本發(fā)明的構(gòu)思在現(xiàn)有技術(shù)的基礎(chǔ)上通過邏輯分析、推理或者有限的實(shí)驗(yàn)可以得到的技術(shù)方案，皆應(yīng)在由權(quán)利要求書所確定的保護(hù)范圍內(nèi)。