本發(fā)明屬于微藻生物蛋白技術領域,具體而言,涉及小球藻的培養(yǎng)方法,特別涉及增加小球藻蛋白質產量的方法。
背景技術:
蛋白質是一切生命的物質基礎,是細胞的重要組成部分,機體生長、發(fā)育、運動繁殖等生命活動都離不開蛋白質。聯(lián)合國糧農組織2011年的調查顯示,人口的增長速度已經遠遠超過了食品蛋白質供應的增長速度。蛋白質資源缺乏——這一世界性問題已經存在多年。隨著我國經濟建設的不斷發(fā)展,人民生活水平不斷提高,蛋白質總需求量逐年增加。加之我國是人口大國,人口的增長亦使得蛋白質缺乏這一問題尤為嚴重。因此,除努力提高蛋白質利用效率外,我們還迫切需要開發(fā)新的蛋白質資源以取代魚粉、豆粕等價格昂貴的傳統(tǒng)蛋白質。
利用生物技術開發(fā)高效能的單細胞蛋白引起人們的廣泛關注,1967年,第一屆國際單細胞蛋白質會議將富含蛋白質的微生物菌體統(tǒng)稱為單細胞蛋白,其可以作為動物飼料,也可以作為食品添加劑、營養(yǎng)保健品被人類食用,以有效緩解食品蛋白質供應短缺問題。酵母菌、微藻、細菌和真菌是最重要的單細胞蛋白來源。
小球藻是第一種實現(xiàn)人工培養(yǎng)的微藻,細胞結構簡單,易于培養(yǎng),生長速度快,是進行生物技術研究的好材料。小球藻在自然界分布廣泛,環(huán)境適應力較強;且營養(yǎng)價值較高,胞內蛋白質含量可達到大豆的1.25-1.5倍,各種氨基酸齊全,不飽和脂肪酸含量豐富,此外還含有多種生物活性物質,具有抗氧化、抗衰老、預防癌癥、增加免疫力等功效。
發(fā)展小球藻作為飼料或食品添加劑已經有30多年的歷史,已實現(xiàn)產業(yè)化的有小球藻面包、小球藻飲料、小球藻片和膠囊等。日本作為小球藻的生產和消費大國,目前呈現(xiàn)小球藻產品購銷市場空前活躍的局面。
小球藻傳統(tǒng)的培養(yǎng)方式為利用光能和CO2的自養(yǎng),但由于自養(yǎng)培養(yǎng)獲得的小球藻生物量較低,難以獲得理想規(guī)模的藻細胞體,自養(yǎng)方式的商業(yè)化面臨著經濟和技術方面的問題。近年來,小球藻的異養(yǎng)培養(yǎng)成為研究熱點。小球藻細胞在無光照條件下利用有機碳源進行異養(yǎng)生長,可大幅度提高細胞密度,但異養(yǎng)藻細胞內蛋白質的含量較自養(yǎng)顯著降低。有研究發(fā)現(xiàn)微藻體內的物質代謝受外界條件改變而影響,例如,當?shù)床蛔銜r,小球藻胞內油脂積累增加,當?shù)闯渥銜r,物質代謝流會朝著蛋白質積累的方向進行。但小球藻氮代謝未觀察到奢侈性吸收現(xiàn)象,無法實現(xiàn)蛋白質的奢侈性生產。如何在保證小球藻高生物質產量的前提下提高細胞蛋白質含量,是小球藻蛋白質資源開發(fā)利用所必需解決的關鍵問題。
技術實現(xiàn)要素:
本發(fā)明的目的在于針對目前異養(yǎng)小球藻蛋白質含量不高的缺陷,提供一種利用過補償吸收效應增加小球藻生物體內蛋白質含量的方法。利用本發(fā)明方法,能夠在保證異養(yǎng)小球藻高生物量的前提下,有效提高細胞蛋白質含量,實現(xiàn)小球藻蛋白質的高產量。
本發(fā)明的目的是通過如下技術方案實現(xiàn)的。
一種增加異養(yǎng)小球藻胞內蛋白質含量的方法,具體包括如下步驟:
所用普通小球藻購于中國科學院野生生物種質庫——淡水藻種庫,編號FACHB-8,生物學分類屬于綠藻門、綠藻綱、綠球藻目、小球藻科、小球藻屬。但本發(fā)明不限于此一種小球藻。
所用培養(yǎng)基為修改BG11+培養(yǎng)基。氮缺乏修改BG11+培養(yǎng)基配方:
(1)氮源,2-6 mmol L-1
(2)有機碳源,5-30 g L-1
(3)K2HPO4, 3.0-5.0 g溶于100 mL dH2O
(4)MgSO4·7H2O, 6.5-8.5 g溶于100 mL dH2O
(5)CaCl2·2H2O, 2.6-4.6 g溶于100 mL dH2O
(6) 檸檬酸, 0.4-0.8 g溶于100 mL dH2O
(7) 檸檬酸鐵銨, 0.4-0.8 g溶于100 mL dH2O
(8)EDTA-Na2, 0.05-0.15 g溶于100 mL dH2O
(9)Na2CO3, 1.0-3.0 g溶于100 mL dH2O
(10)A5溶液:H3BO3, 2.86g L-1; MnCl2·4H2O, 1.86g L-1; ZnSO4·7H2O, 0.22g L-1; Na2MoO4·2H2O, 0.021g L-1; CuSO4·5H2O, 0.08g L-1; Co(NO3)2·6H2O, 0.05g L-1溶于水中。用1M NaOH或HCl調pH至7.1。
說明:配制母液(3)-(10)號時,藥品分別配制,分別存放。(10)號中的藥品按量配制后混合存放。配制工作液時,?。?)-(10)號母液各1mL,另?。?)氮源2-6 mmol L-1及(2)有機碳源5-30 g L-1,加入蒸餾水中并定容至1000 mL,然后用1 M NaOH或HCl調節(jié)pH至7.1,并115°C濕熱滅菌20 分鐘。固體BG11+培養(yǎng)基為BG11+培養(yǎng)基加入15-20 g L-1的瓊脂粉。
具體操作方法如下。
(1)將固體BG11+平板培養(yǎng)基上的小球藻單菌落接種到BG11+液體培養(yǎng)基中,23-35°C,120-200 rpm,培養(yǎng)2-6天,作為一級種子液。
(2)將一級種子液以5%-40%(V/V)的接種量接種于BG11+液體培養(yǎng)基中,培養(yǎng)2-6天,作為二級種子液。培養(yǎng)條件同一級種子液。
(3) 將二級種子液以5%-40% (V/V)的接種量接種于氮濃度為2-6 mmolL-1的BG11+培養(yǎng)基中。于23-35°C,120-200 rpm下培養(yǎng)。
(4)待小球藻生長至指數(shù)期末期即在培養(yǎng)過程的第2-4 d,將發(fā)酵液轉移至已滅菌的離心管中,2000-4500 rpm離心3-10 min,棄去上清液,藻體沉淀轉移至氮濃度為12-20 mmol L-1的已滅菌培養(yǎng)基中。繼續(xù)于23-35°C,120-200 rpm下培養(yǎng)。
(5)待小球藻生長至指數(shù)期結束即4-8 d,將藻液轉移到離心管中,4000-8000 rpm離心5-12 min,收集藻體,減壓干燥。
本專利提供的技術方案具有以下有益效果:
(1)本發(fā)明區(qū)別于傳統(tǒng)的兩步補料分批發(fā)酵。傳統(tǒng)兩步發(fā)酵的第一階段積累生物量,第二階段積累次級代謝產物;而本發(fā)明的過補償吸收培養(yǎng)的氮缺乏階段僅給予藻細胞氮饑餓刺激,氮充足階段同時進行生物量和蛋白質產物的積累。而且本發(fā)明方法在小球藻生長對數(shù)期補充了充足的新鮮培養(yǎng)基以替代原有培養(yǎng)基,新鮮培養(yǎng)基中含有更豐富的微量元素,有利于小球藻的生長和蛋白質的積累;
(2)有學者研究發(fā)現(xiàn)添加植物激素也能刺激藻細胞蛋白質代謝,增加小球藻蛋白質含量,但植物激素會使小球藻的生長受到抑制,生物量降低,不利于小球藻蛋白質的生產。與添加植物激素提高小球藻蛋白質含量的方法相比,本發(fā)明既能保證小球藻的生物量,又可使其蛋白質含量提高;
(3)本發(fā)明得到的異養(yǎng)小球藻蛋白質含量顯著提高,達到50%以上,與自養(yǎng)小球藻水平相當;
(4)本發(fā)明工藝簡單、操作簡便、生產周期短,條件溫和,原料易得,易于規(guī)?;I(yè)生產。
附圖說明
圖1: 無菌離心法與普通培養(yǎng)法所得小球藻的蛋白質含量、蛋白質產量及生物量。
圖2:此方法所得小球藻中主要成分。
圖3:此方法所得小球藻氨基酸組成。
具體實施方式
為了更好的理解本發(fā)明,下面將結合實施實例對本發(fā)明作進一步解釋。但需要特別說明的是,實施實例僅用于對本發(fā)明進行進一步解釋,本發(fā)明要求保護的范圍并不局限于實施實例表示的范圍。
實施實例1
將固體BG11+平板培養(yǎng)基上的小球藻接種到已滅菌的BG11+液體培養(yǎng)基中,25°C,180 rpm,培養(yǎng)3天,作為一級種子液。
將一級種子液以10%(V/V)的接種量接種于已滅菌的BG11+液體培養(yǎng)基中,培養(yǎng)3天,作為二級種子液。培養(yǎng)條件同一級種子液。
將二級種子液以10%(V/V)的接種量接種于已滅菌的低氮濃度為3 mmol L-1的BG11+培養(yǎng)基中。培養(yǎng)條件為溫度25°C,搖床轉速180 rpm。
待小球藻生長至指數(shù)期末期即在培養(yǎng)過程的第3 d時,在無菌操作條件下4000 rpm離心8 min、收集藻細胞。
將藻細胞立即重懸浮于等體積新鮮的已滅菌的18 mmol L-1高氮濃度培養(yǎng)基中,于25°C中繼續(xù)培養(yǎng)。
待小球藻生長至第7 d時,4000 rpm離心10 min收集藻體,減壓干燥,重量法測定其生物量,凱氏定氮法測定其蛋白質含量。
如附圖1所示,相比普通培養(yǎng)方法,此方法顯著提高了小球藻蛋白質含量,可以達到53.8%。此法獲得的蛋白質產量達1.62 g L-1,生物量為3.01 g L-1。小球藻細胞成分見附圖2、氨基酸成分見附圖3。
實施實例2
將固體BG11+平板培養(yǎng)基上的小球藻接種到已滅菌的BG11+液體培養(yǎng)基中,25°C,180 rpm,培養(yǎng)3天,作為一級種子液。
將一級種子液以10%(V/V)的接種量接種于已滅菌的BG11+液體培養(yǎng)基中,培養(yǎng)3天,作為二級種子液。培養(yǎng)條件同一級種子液。
將二級種子液以10%(V/V)的接種量接種于已滅菌的低氮濃度為3mmol L-1的BG11+培養(yǎng)基中。培養(yǎng)條件為溫度25°C,搖床轉速180 rpm。
待小球藻生長至指數(shù)期末期即在培養(yǎng)過程的第3 d時,在無菌操作條件下4500 rpm離心5 min、收集藻細胞。
將藻細胞立即重懸浮于等體積新鮮的已滅菌的15 mmol L-1高氮濃度培養(yǎng)基中,于25°C中繼續(xù)培養(yǎng)。
待小球藻生長至第7 d時,4500 rpm離心8 min收集藻體,減壓干燥,重量法測定其生物量,凱氏定氮法測定其蛋白質含量。
此方法顯著提高了小球藻蛋白質含量,使之達到50.0%,產量為1.54 g L-1,生物量為3.04 g L-1。
實施實例3
將固體BG11+平板培養(yǎng)基上的小球藻接種到已滅菌的BG11+液體培養(yǎng)基中,25°C,180 rpm,培養(yǎng)3天,作為一級種子液。
將一級種子液以10%(V/V)的接種量接種于已滅菌的BG11+液體培養(yǎng)基中,培養(yǎng)3天,作為二級種子液。培養(yǎng)條件同一級種子液。
將二級種子液以10%(V/V)的接種量接種于已滅菌的低氮濃度為3mmol L-1的BG11+培養(yǎng)基中。培養(yǎng)條件為溫度25°C,搖床轉速180 rpm。
待小球藻生長至指數(shù)期末期即在培養(yǎng)過程的第3 d時,在無菌操作條件下4500 rpm離心5 min、收集藻細胞。
將藻細胞立即重懸浮于等體積新鮮的已滅菌的12 mmol L-1高氮濃度培養(yǎng)基中,于25°C中繼續(xù)培養(yǎng)。
待小球藻生長至第7 d時,4500 rpm離心8 min收集藻體,減壓干燥,重量法測定其生物量,凱氏定氮法測定其蛋白質含量。
此方法顯著提高了小球藻蛋白質含量,使之達到47.1%,產量為1.32 g L-1,生物量為2.81 g L-1。