本發(fā)明屬于生物制藥技術(shù)領(lǐng)域，具體而言，涉及一種化合物F083-0063的抗腫瘤應(yīng)用。

背景技術(shù)：

保羅樣激酶1(PLK1)作為細(xì)胞周期必要的調(diào)節(jié)因子，是公認(rèn)的抗腫瘤藥物靶點(diǎn)。PLKs最初作為有絲分裂必需的基因之一發(fā)現(xiàn)于果蠅中，是一類從酵母到人類都高度保守的絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶[1-3]。人類的PLKs共包括五個(gè)成員[4]。這類激酶在N端有一個(gè)保守的酶活性區(qū)域(KD)外,在C端有一個(gè)高度保守的(叫做polo-box-PBD)的非催化活性區(qū)，主要調(diào)節(jié)蛋白和底物或調(diào)節(jié)因子之間的相互作用[5,6]。PLK1在調(diào)節(jié)細(xì)胞分裂的過(guò)程中(包括中心體功能、有絲分裂中染色體動(dòng)態(tài)平衡、紡錘體功能和胞質(zhì)分裂)發(fā)揮著多種必需和非必需的功能[3,6,7]。

大量的研究將PLKs與腫瘤從不同的方面聯(lián)系在一起。PLK1在多種腫瘤細(xì)胞系中高表達(dá)，且和不良預(yù)后密切相關(guān)[8-10]。與健康組織相比，多種不同組織來(lái)源的腫瘤對(duì)低表達(dá)的PLK1更敏感，這在理論上打開(kāi)了一個(gè)治療契機(jī)。更有研究發(fā)現(xiàn)Ras轉(zhuǎn)化和p53缺陷的細(xì)胞與PLK1的高活性密切相關(guān)[11-14]?；谏鲜鲈?，PLK1被公認(rèn)為是一個(gè)很好的抗腫瘤藥物靶點(diǎn)。而PLK2和3則在細(xì)胞周期檢驗(yàn)點(diǎn)發(fā)揮作用并具有抗細(xì)胞增殖的功能，被認(rèn)為屬于腫瘤抑制因子[15-18]。

近些年來(lái)發(fā)現(xiàn)了很多PLK1的激酶活性抑制劑，有一些已經(jīng)進(jìn)入了臨床研究階段[19,20]。由于激酶結(jié)構(gòu)域在激酶中高度保守，使得PLK1抑制劑的特異性不強(qiáng)，尤其對(duì)PLK家族其他成員[21]。BI2536及其衍生物Volasertib(BI6727)是目前最有前景的PLK1抑制劑[22,23]。Volasertib處于臨床前第三階段，已取得了不錯(cuò)的療效，特別是對(duì)急需新藥的急性髓細(xì)胞樣白血病(AML)的治療上[24]。2013年，F(xiàn)DA給與Volasertib“突破性治療”的高度評(píng)價(jià)。這些發(fā)展都在此證明了PLK1作為抗腫瘤藥物靶點(diǎn)的可行性。然而，毒性仍然是一個(gè)函待解決的難題[24]。同時(shí)BI2536和Volasertib對(duì)于PLK2、3還有其他激酶也具有抑制活性，IC₅₀值相當(dāng)[22,23,25]。由于PLK2和3具有類似腫瘤抑制的功能，理想的藥物還是只針對(duì)PLK1。

利用抑制PBD來(lái)干預(yù)PLK1的功能成為近年來(lái)的替代策略。PLK1有功能的PBD是細(xì)胞分裂必不可少的[26-28]。PLK1在中心體、著絲粒、胞質(zhì)分裂中的中心紡錘體等發(fā)揮作用均需要通過(guò)PB才能與底物結(jié)合并[3，29,30]。不同于KD，PBD是PLK家族所特有的且不同成員之間的PBD在序列和結(jié)構(gòu)上相較KD相似度更低。并且不同PLK成員傾向結(jié)合的磷酸肽基序不同[6，31,32]。因此，PBD是比KD更適合于篩選針對(duì)PLK1的抑制劑的靶點(diǎn)。除此之外，PLK1的功能有些更依賴于KD，有些更依賴于PBD。因此，抑制PBD和抑制KD導(dǎo)致對(duì)PLK1功能影響是不同的，這使得PBD抑制劑更有優(yōu)勢(shì)[33]。PBD抑制劑還能協(xié)同性的和KD抑制劑一起發(fā)揮作用。

基于此，采用PBD作用篩選PLK1抑制劑的靶點(diǎn)已越來(lái)越引起關(guān)注。Poloxin和其同系物thymoquinone(TQ)的發(fā)現(xiàn)第一次證明了這個(gè)策略的可行性，這兩個(gè)化合物是利用體外的熒光偏振模型篩選得到的[34,35]。它們均能在體外低納摩爾水平抑制PBD活性。但是，這兩個(gè)化合物需要更高的濃度才能誘導(dǎo)凋亡和擾亂有絲分裂。PBD和TQ共結(jié)晶顯示TQ是通過(guò)非共價(jià)結(jié)合于PBD的磷酸肽結(jié)合區(qū)域[36]。通過(guò)熒光標(biāo)記的PBD與固定化的磷酸肽結(jié)合的體外檢測(cè)篩選得到了另一個(gè)PBD抑制劑PPG[37]。此化合物也同樣存在需要高濃度才能影響有絲分裂的問(wèn)題。最具潛力的PBD化學(xué)抑制劑是磷酸肽或類肽分子。但是，此類抑制劑的細(xì)胞通透性成為其一大瓶頸[38,39]。

尋找新型的以Plk1PBD為靶點(diǎn)的抗腫瘤小分子抑制劑將對(duì)Plk1高表達(dá)的腫瘤治療帶來(lái)新的希望。

參考文獻(xiàn)：

[1]Llamazares,S.et al.polo encodes a protein kinase homolog required for mitosis in Drosophila.Genes Dev 5,2153–65(1991).

[2]Sunkel,C.E.&Glover,D.M.polo,a mitotic mutant of Drosophila displaying abnormal spindle poles.J Cell Sci 89(Pt 1),25–38(1988).

[3]Archambault,V.&Glover,D.M.Polo-like kinases:conservation and divergence in their functions and regulation.Nat Rev Mol Cell Biol 10,265–75(2009).

[4]de Carcer,G.,Manning,G.&Malumbres,M.From Plk1to Plk5:functional evolution of polo-like kinases.Cell Cycle 10,2255–62(2011).

[5]Elia,A.E.,Cantley,L.C.&Yaffe,M.B.Proteomic screen finds pSer/pThr-binding domain localizing Plk1to mitotic substrates.Science 299,1228–31(2003).

[6]Zitouni,S.,Nabais,C.,Jana,S.C.,Guerrero,A.&Bettencourt-Dias,M.Polo-like kinases:structural variations lead to multiple functions.Nat Rev Mol Cell Biol 15,433–52(2014).

[7]Petronczki,M.,Lenart,P.&Peters,J.M.Polo on the Rise-from Mitotic Entry to Cytokinesis with Plk1.Dev Cell 14,646–59(2008).

[8]Strebhardt,K.&Ullrich,A.Targeting polo-like kinase 1for cancer therapy.Nat Rev Cancer 6,321–30(2006).

[9]Strebhardt,K.Multifaceted polo-like kinases:drug targets and antitargets for cancer therapy.Nat Rev Drug Discov 9,643–60(2010).

[10]Degenhardt,Y.&Lampkin,T.Targeting Polo-like kinase in cancer therapy.Clin Cancer Res 16,384–9(2010).

[11]Liu,X.,Lei,M.&Erikson,R.L.Normal cells,but not cancer cells,survive severe Plk1depletion.Mol Cell Biol 26,2093–108(2006).

[12]Schmit,T.L.,Zhong,W.,Setaluri,V.,Spiegelman,V.S.&Ahmad,N.Targeted depletion of Polo-like kinase(Plk)1 through lentiviral shRNA or a small-molecule inhibitor causes mitotic catastrophe and induction of apoptosis in human melanoma cells.J Invest Dermatol 129,2843–53(2009).

[13]Luo,J.et al.A genome-wide RNAi screen identifies multiple synthetic lethal interactions with the Ras oncogene.Cell 137,835–48(2009).

[14]Guan,R.et al.Small interfering RNA-mediated Polo-like kinase 1 depletion preferentially reduces the survival of p53-defective,oncogenic transformed cells and inhibits tumor growth in animals.Cancer Res 65,2698–704(2005).

[15]Yang,Y.et al.Polo-like kinase 3 functions as a tumor suppressor and is a negative regulator of hypoxia-inducible factor-1 alpha under hypoxic conditions.Cancer Res 68,4077–85(2008).

[16]Smith,P.,Syed,N.&Crook,T.Epigenetic inactivation implies a tumor suppressor function in hematologic malignancies for Pololike kinase 2 but not Polo-like kinase 3.Cell Cycle 5,1262–4(2006).

[17]Coley,H.M.et al.Polo Like Kinase 2 Tumour Suppressor and cancer biomarker:new perspectives on drug sensitivity/resistance in ovarian cancer.Oncotarget 3,78–83(2012).

[18]Helmke,C.,Becker,S.&Strebhardt,K.The role of Plk3 in oncogenesis.Oncogene 35,135–47(2015).

[19]Lee,K.S.,Burke,T.R.Jr.,Park,J.E.,Bang,J.K.&Lee,E.Recent Advances and New Strategies in Targeting Plk1 for Anticancer Therapy.Trends Pharmacol Sci 36,858–77(2015).

[20]Liu,X.Targeting Polo-Like Kinases:A Promising Therapeutic Approach for Cancer Treatment.Transl Oncol 8,185–95(2015).

[21]McInnes,C.&Wyatt,M.D.PLK1 as an oncology target:current status and future potential.Drug Discov Today 16,619–25(2011).

[22]Steegmaier,M.et al.BI 2536,a potent and selective inhibitor of polo-like kinase 1,inhibits tumor growth in vivo.Curr Biol 17,316–22(2007).

[23]Rudolph,D.et al.BI 6727,a Polo-like kinase inhibitor with improved pharmacokinetic profile and broad antitumor activity.Clin Cancer Res 15,3094–102(2009).

[24]Gjertsen,B.T.&Schoffski,P.Discovery and development of the Polo-like kinase inhibitor volasertib in cancer therapy.Leukemia 29,11–9(2015).

[25]Davis,M.I.et al.Comprehensive analysis of kinase inhibitor selectivity.Nat Biotechnol29,1046–51(2011).

[26]Seong,Y.S.et al.A spindle checkpoint arrest and a cytokinesis failure by the dominant-negative polo-box domain of Plk1 in U-2 OS cells.J Biol Chem 277,32282–93(2002).

[27]Hanisch,A.,Wehner,A.,Nigg,E.A.&Sillje,H.H.Different Plk1 functions show distinct dependencies on Polo-Box domainmediated targeting.Mol Biol Cell 17,448–59(2006).

[28]Lera,R.F.&Burkard,M.E.High mitotic activity of Polo-like kinase 1 is required for chromosome segregation and genomic integrity in human epithelial cells.J Biol Chem 287,42812–25(2012).

[29]Lee,K.S.,Grenfell,T.Z.,Yarm,F.R.&Erikson,R.L.Mutation of the polo-box disrupts localization and mitotic functions of the mammalian polo kinase Plk.Proc Natl Acad Sci USA 95,9301–6(1998).

[30]Jang,Y.J.,Lin,C.Y.,Ma,S.&Erikson,R.L.Functional studies on the role of the C-terminal domain of mammalian polo-like kinase.Proc Natl Acad Sci USA 99,1984–9(2002).

[31]Yun,S.M.et al.Structural and functional analyses of minimal phosphopeptides targeting the polo-box domain of polo-like kinase 1.Nat Struct Mol Biol 16,876–82(2009).

[32]van de Weerdt,B.C.et al.Polo-box domains confer target specificity to the Polo-like kinase family.Biochim Biophys Acta 1783,1015–22(2008).

[33]Archambault,V.,Lepine,G.&Kachaner,D.Understanding the Polo Kinase machine.Oncogene 34,4799–807(2015).

[34]Reindl,W.,Yuan,J.,Kramer,A.,Strebhardt,K.&Berg,T.Inhibition of polo-like kinase 1by blocking polo-box domain-dependent protein-protein interactions.Chem Biol 15,459–66(2008).

[35]Yuan,J.et al.Polo-box domain inhibitor poloxin activates the spindle assembly checkpoint and inhibits tumor growth in vivo.Am J Pathol 179,2091–9(2011).

[36]Yin,Z.,Song,Y.&Rehse,P.H.Thymoquinone blocks pSer/pThr recognition by Plk1Polo-box domain as a phosphate mimic.ACS Chem Biol 8,303–8(2013).

[37]Watanabe,N.et al.Deficiency in chromosome congression by the inhibition of Plk1polo box domain-dependent recognition.J Biol Chem 284,2344–53(2009).

[38]Park,J.E.et al.Putting a bit into the polo-box domain of polo-like kinase 1.J Anal Sci Technol 6,27(2015).

[39]Park,J.E.,Kim,T.S.,Kim,B.Y.&Lee,K.S.Selective blockade of cancer cell proliferation and anchorage-independent growth by Plk1activity-dependent suicidal inhibition of its polo-box domain.Cell Cycle 14,3624–34(2015).

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明首先涉及一種具備抗腫瘤活性的小分子化合物F083-0063，其結(jié)構(gòu)如式1所示，化學(xué)名為3-甲酰胺-N-(呋喃-2-基甲基)-1-硫酮-5-氧代-8氯-4,5-雙氫-1H–噻唑并[3,4-a]喹唑啉，

本發(fā)明還涉及以所述的小分子化合物F083-0063為主要活性成分的制劑或藥物。

本發(fā)明還涉及一種抗腫瘤藥物，所述的藥物包括，

(1)治療有效量的小分子化合物F083-0063；

(2)必要的藥用輔料。

本發(fā)明還涉及所述的小分子化合物F083-0063在制備如下制劑中的應(yīng)用；

(1)結(jié)合于Plk1的PBD的特定區(qū)域并阻斷其功能的阻斷劑，所述的Plk1的PBD的特定區(qū)域?yàn)镻lk1蛋白三級(jí)結(jié)構(gòu)中的His538、Lys540、Arg557構(gòu)成的結(jié)構(gòu)區(qū)域；

(2)阻滯細(xì)胞至G2/M期的細(xì)胞周期調(diào)節(jié)劑，所述的細(xì)胞優(yōu)選為腫瘤細(xì)胞系，最優(yōu)選為肝癌、子宮癌或結(jié)直腸癌細(xì)胞；

(3)促進(jìn)細(xì)胞凋亡制劑，所述的細(xì)胞優(yōu)選為腫瘤細(xì)胞系，最優(yōu)選為肝癌、子宮癌或結(jié)直腸癌細(xì)胞；

(4)抑制腫瘤細(xì)胞遷移的抑制劑，所述的腫瘤細(xì)胞優(yōu)選為子宮癌細(xì)胞。

本發(fā)明還涉及所述的小分子化合物F083-0063的如下應(yīng)用：

(1)抑制Plk1與其天然配體結(jié)合；

(2)阻滯細(xì)胞至G2/M期；

(3)促進(jìn)細(xì)胞凋亡，所述的細(xì)胞優(yōu)選為腫瘤細(xì)胞系，最優(yōu)選為肝癌、子宮癌或結(jié)直腸癌細(xì)胞；

(4)抑制腫瘤細(xì)胞的遷移和轉(zhuǎn)移，所述的腫瘤細(xì)胞優(yōu)選為子宮癌細(xì)胞；

(5)抑制腫瘤和/或抑制腫瘤的轉(zhuǎn)移，所述的腫瘤優(yōu)選為肝癌、子宮癌或結(jié)直腸癌。

本發(fā)明還涉及一種以Plk1 PBD活性中心的關(guān)鍵氨基酸空間結(jié)構(gòu)為靶標(biāo)的Plk1抑制劑的篩選方法，所述的Plk1 PBD活性中心的關(guān)鍵氨基酸空間結(jié)構(gòu)為Plk1蛋白的His538、Lys540、Arg557在具備生物學(xué)活性的Plk1蛋白三級(jí)結(jié)構(gòu)的空間構(gòu)象中形成的立體結(jié)構(gòu)，所述的篩選方法為：使用分子對(duì)接預(yù)測(cè)靶標(biāo)和化合物的相互結(jié)合。

附圖說(shuō)明

圖1、F083-0063的結(jié)構(gòu)及基本功能，1A，F(xiàn)083-0063的分子結(jié)構(gòu)；1B，F(xiàn)083-0063的量效關(guān)系曲線；1C，F(xiàn)083-0063在HeLa細(xì)胞中的細(xì)胞毒性。

圖2、F083-0063的功能驗(yàn)證，2A，F(xiàn)083-0063時(shí)間依賴性的引發(fā)HeLa細(xì)胞G2/M期阻滯；2B，F(xiàn)083-0063引發(fā)時(shí)間依賴性的G2/M期阻滯的定量分析；2C，F(xiàn)083-0063劑量依賴性的引發(fā)HeLa細(xì)胞G2/M期阻滯；2D，F(xiàn)083-0063引發(fā)劑量依賴性的G2/M期阻滯的定量分析；2E，Western Blot分析F083-0063引發(fā)G2/M期阻滯。

圖3、F083-0063促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡，3A，F(xiàn)083-0063引發(fā)HeLa細(xì)胞的大量凋亡；3B，F(xiàn)083-0063引發(fā)細(xì)胞大量凋亡的定量分析。

圖4、F083-0063抑制細(xì)胞遷移，4A，F(xiàn)083-0063時(shí)間依賴性的抑制HeLa細(xì)胞遷移；4B，F(xiàn)083-0063引發(fā)時(shí)間依賴性的細(xì)胞遷移的定量分析；4C，F(xiàn)083-0063劑量依賴性的抑制HeLa細(xì)胞遷移；4D，F(xiàn)083-0063引發(fā)劑量依賴性的細(xì)胞遷移的定量分析。

圖5、F083-0063與Plk1PBD結(jié)合方式驗(yàn)證，F(xiàn)083-0063和Plk1PBD分子對(duì)接示意圖。

具體實(shí)施方式

實(shí)施例1.細(xì)胞的培養(yǎng)

人成骨肉瘤細(xì)胞MG63、人子宮頸癌細(xì)胞HeLa、人結(jié)腸癌細(xì)胞HCT-116、人結(jié)腸癌細(xì)胞HT-29、人肝癌細(xì)胞HepG2、人前列腺癌PC3、人肝細(xì)胞L02，所有細(xì)胞均為貼壁細(xì)胞，約48h傳代一次。待細(xì)胞長(zhǎng)滿后，棄舊培養(yǎng)基，用PBS漂洗細(xì)胞后棄掉，之后加適量胰酶，在室溫下消化約2-10min，棄掉消化液，立即加入含10％FBS的培養(yǎng)基，以抑制胰蛋白酶活力，用彎頭吸管反復(fù)輕輕吹打培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)細(xì)胞，使細(xì)胞完全脫離瓶底且吹打使之分散為單個(gè)細(xì)胞懸液。再按1:3-1:6比例接種細(xì)胞懸液于新的細(xì)胞瓶?jī)?nèi)，然后補(bǔ)加適量完全培養(yǎng)基，放入培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)。培養(yǎng)條件：37℃，5％CO₂。

實(shí)施例2.化合物F083-0063對(duì)PLK1PBD抑制活性的測(cè)定

本活性測(cè)定采用熒光偏振(FP)高通量篩選模型進(jìn)行化合物活性的測(cè)定。

測(cè)定原理：

主要基于熒光分子的偏振性與其受激發(fā)時(shí)熒光分子的旋轉(zhuǎn)速度密切相關(guān)的原理。當(dāng)熒光分子受平面偏振光激發(fā)時(shí)，如果熒光分子在受激發(fā)時(shí)保持靜止?fàn)顟B(tài)，那么發(fā)射光將位于同樣的偏振平面；如果熒光分子在受激發(fā)時(shí)保持旋轉(zhuǎn)狀態(tài)，那么發(fā)射光將位于與激發(fā)光不同的偏振面。如果用垂直的偏振光激發(fā)熒光素，可以在垂直的和水平的偏振平面檢測(cè)發(fā)射光光強(qiáng)(發(fā)射光從垂直平面偏向水平平面的程度與熒光素標(biāo)記的分子的遷移率有關(guān))。如果分子量較大，受激發(fā)時(shí)熒光分子的旋轉(zhuǎn)速度較慢，則發(fā)射光偏振程度較高；如果分子量較小，受激發(fā)時(shí)熒光分子的旋轉(zhuǎn)速度較快，則發(fā)射光相對(duì)于激發(fā)光平面將去偏振化。因此，本研究擬建立的熒光偏振高通量篩選方法將以FITC-Poloboxtide((FITC-GPMQSpTPLNG-OH；MW:1583.61；Purity＞95％；λex/λem:485/535nm，由上海強(qiáng)耀生物科技有限公司合成)作為Plk1PBD的模擬底物，從而進(jìn)行靶向Plk1PBD的小分子抑制劑的活性測(cè)定。

測(cè)定方法：

(1)將400nM Plk1PBD溶液以30μL/孔依次加入到384孔板中，將10mg·mL^-1的F083-0063進(jìn)行倍比稀釋后，以終濃度10μg·mL^-1、5μg·mL^-1、2.5μg·mL^-1、2μg·mL^-1、1μg·mL^-1、0.5μg·mL^-1、0.25μg·mL^-1、0.1μg·mL^-1、0.05μg·mL^-1、0.02μg·mL^-1、0.01μg·mL^-1依次加入到384孔板中并做好對(duì)應(yīng)的準(zhǔn)確記錄，以同時(shí)加入0.3μL DMSO孔作為陰性對(duì)照(Negative Control,0％Inhibition)；以僅含有60μL 30nM FITC-Probe孔為陽(yáng)性對(duì)照(Positive Control,100％Inhibition)。將其混勻后室溫緩慢振搖，孵育60min。

(2)將60nM FITC-Probe以30μL/孔依次加入到384孔板中的上述各反應(yīng)孔中，將其混勻后室溫緩慢振搖，避光孵育15min，以多功能微孔板檢測(cè)儀進(jìn)行mP檢測(cè)。

(3)用如下方程計(jì)算待測(cè)化合物抑制率：

并以GraphPad Primer 5擬合抑制曲線確定化合物F083-0063的表觀IC₅₀。

以FP實(shí)驗(yàn)測(cè)得不同濃度化合物對(duì)Plk1PBD的抑制率(表1)對(duì)化合物F083-0063進(jìn)行量效關(guān)系分析，表觀IC₅₀≈1.9±0.1μM(圖1B)，能在體外抑制Plk1PBD的活性。

選用HeLa細(xì)胞作為腫瘤細(xì)胞的代表細(xì)胞，以MTT方法進(jìn)行小分子抑制劑F083-0063的細(xì)胞毒性初步評(píng)價(jià)。在上述實(shí)驗(yàn)中，我們發(fā)現(xiàn)小分子抑制劑F083-0063對(duì)HeLa細(xì)胞具有明顯的細(xì)胞毒性，其IC₅₀值約為5.8±0.6μM(圖1C，表2)。

表1不同濃度化合物F083-0063對(duì)Plk1PBD的抑制率

實(shí)施例3、小分子抑制劑F083-0063的細(xì)胞毒性測(cè)定

利用MTT比色實(shí)驗(yàn)進(jìn)行。

測(cè)定原理：

活細(xì)胞線粒體中的琥珀酸脫氫酶能使外源性MTT還原為水不溶性的藍(lán)紫色結(jié)晶甲瓚(Formazan)并沉積在細(xì)胞中，而死細(xì)胞無(wú)此功能。二甲基亞砜(DMSO)能溶解細(xì)胞中的甲瓚，用酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀在560nm波長(zhǎng)處測(cè)定其光吸收值，可間接反映活細(xì)胞數(shù)量。在一定細(xì)胞數(shù)范圍內(nèi)，MTT結(jié)晶形成的量與活細(xì)胞數(shù)成正比。

測(cè)定方法：

(1)從保存細(xì)胞凍存管的液氮中取出細(xì)胞凍存管后，迅速投入37℃水浴中，輕輕搖動(dòng)使其盡快融化。然后從37℃水浴中取出細(xì)胞凍存管，用乙醇消毒后，1000rpm×5min離心，小心地吸去上清液，再加入1mL培養(yǎng)液重懸細(xì)胞并再次離心。用生長(zhǎng)培養(yǎng)基適當(dāng)稀釋后，接種培養(yǎng)瓶，接種密度以5×10⁵/mL為宜。將細(xì)胞培養(yǎng)瓶放入CO2培養(yǎng)箱37℃、5％CO2靜止培養(yǎng)。次日更換培養(yǎng)液，繼續(xù)培養(yǎng)備用。

(2)以0.25％胰蛋白酶消化單層貼壁培養(yǎng)的細(xì)胞，用含10％FBS的生長(zhǎng)培養(yǎng)基配成單細(xì)胞懸液，以4～5×10³/mL接種于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板，每孔體積200μL，同時(shí)96孔細(xì)胞培養(yǎng)板的邊緣孔以無(wú)菌PBS填充，盡量避免邊緣效應(yīng)。

(3)將上述接種細(xì)胞的96孔細(xì)胞培養(yǎng)板放入CO2培養(yǎng)箱，在37℃、5％CO₂條件下靜止培養(yǎng)24小時(shí)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期。

(4)準(zhǔn)備從10μg·mL^-1開(kāi)始以生長(zhǎng)培養(yǎng)基梯度稀釋的化合物F083-0063，共制備8個(gè)梯度濃度(100μM、75μM、50μM、25μM、10μM、5μM、2.5μM、1μM)的稀釋液。

(5)小心地吸棄各孔內(nèi)的生長(zhǎng)培養(yǎng)基后，將化合物F083-0063的上述8個(gè)梯度濃度分別加入對(duì)應(yīng)96孔細(xì)胞培養(yǎng)板，每孔200μL，每個(gè)濃度設(shè)置3組復(fù)孔并做好相應(yīng)的標(biāo)記。以加入DMSO組為陰性對(duì)照，只含正常培養(yǎng)基組為陽(yáng)性對(duì)照，各組分別設(shè)置3組復(fù)孔。

(6)在37℃、5％CO₂培養(yǎng)條件下，化合物F083-0063與細(xì)胞繼續(xù)共培養(yǎng)48小時(shí)。小心地吸棄各孔內(nèi)生長(zhǎng)培養(yǎng)基，每孔各加入200μL新鮮生長(zhǎng)培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)24小時(shí)。

(7)培養(yǎng)24小時(shí)后，每孔加入MTT溶液22μL，37℃避光培養(yǎng)4小時(shí)后終止培養(yǎng)。小心地吸棄各孔內(nèi)培養(yǎng)基后，每孔加入150μL DMSO，避光震蕩15min，使甲瓚充分溶解呈紫色。

(8)選擇560nm波長(zhǎng)，在多功能微孔板檢測(cè)儀上測(cè)定各孔OD值，記錄并保存數(shù)據(jù)，以GraphPad Prism 5擬合化合物F083-0063在各細(xì)胞株的生長(zhǎng)抑制曲線并計(jì)算其IC₅₀值。

本實(shí)驗(yàn)選用本室保存的6株臨床常見(jiàn)的人癌細(xì)胞系和1株正常人源細(xì)胞，以MTT比色法進(jìn)行小分子抑制劑F083-0063的細(xì)胞毒性評(píng)價(jià)。發(fā)現(xiàn)小分子抑制劑F083-0063對(duì)6株腫瘤細(xì)胞具有不同的細(xì)胞毒性，IC₅₀值差別較大，其中對(duì)Hela的細(xì)胞毒性最為明顯，IC₅₀小于10μM(表2)。但是，小分子抑制劑F083-0063對(duì)L02代表的正常細(xì)胞的細(xì)胞毒性與腫瘤細(xì)胞的細(xì)胞毒性相比并沒(méi)有顯著差別。上述數(shù)據(jù)表明，小分子抑制劑F083-0063在體外對(duì)腫瘤細(xì)胞和正常細(xì)胞具有等同的細(xì)胞毒性。

表2小分子抑制劑F083-0063對(duì)腫瘤細(xì)胞和正常細(xì)胞的細(xì)胞毒性

實(shí)施例4、小分子抑制劑F083-0063對(duì)Hela細(xì)胞周期的影響

利用流式細(xì)胞儀和Western blot進(jìn)行。

測(cè)定原理：

由于細(xì)胞周期各時(shí)相的DNA含量不同，通常正常細(xì)胞的G1/G0期具有二倍體細(xì)胞的DNA含量(2N)，而G2/M期具有四倍體細(xì)胞的DNA含量(4N),而S期的DNA含量介于二倍體和四倍體之間。PI可以與DNA結(jié)合，其熒光強(qiáng)度直接反映了細(xì)胞內(nèi)DNA含量。因此，通過(guò)流式細(xì)胞儀PI染色法對(duì)細(xì)胞內(nèi)DNA含量進(jìn)行檢測(cè)時(shí)，可以將細(xì)胞周期各時(shí)相區(qū)分為G1/G0期，S期和G2/M期,獲得的流式直方圖對(duì)應(yīng)的各細(xì)胞周期可通過(guò)特殊軟件計(jì)算各時(shí)相的細(xì)胞百分率。

測(cè)定方法：

周期同步化的HeLa細(xì)胞是后續(xù)FACS和Western Blot進(jìn)行細(xì)胞周期分析的基礎(chǔ)，周期同步化方法如下：

(1)將HeLa細(xì)胞以0.25％胰酶消化后，以3×10⁵/mL接種于6孔細(xì)胞培養(yǎng)板，接種量2mL/孔。將細(xì)胞板置于37℃、5％CO₂條件下培養(yǎng)24h至指數(shù)生長(zhǎng)期。

(2)細(xì)胞貼壁后，小心地棄掉生長(zhǎng)培養(yǎng)基后，以無(wú)菌PBS漂洗細(xì)胞1次。然后加入終濃度2mM Thymidine的生長(zhǎng)培養(yǎng)基，在37℃、5％CO₂條件下繼續(xù)培養(yǎng)12h。

(3)小心地棄掉含2mM Thymidine的生長(zhǎng)培養(yǎng)基后，以無(wú)菌PBS漂洗細(xì)胞1次。更換新鮮的生長(zhǎng)培養(yǎng)基，在37℃、5％CO₂條件下繼續(xù)培養(yǎng)12h。

(4)輕輕地棄掉正常生長(zhǎng)培養(yǎng)基后，以無(wú)菌PBS漂洗細(xì)胞1次。然后再次加入終濃度2mM Thymidine的生長(zhǎng)培養(yǎng)基，在37℃、5％CO₂條件下培養(yǎng)12h后，此時(shí)所有的HeLa細(xì)胞的周期將被阻滯在G1/S期。

將同步化的HeLa細(xì)胞以小分子抑制劑F083-0063作用24h，在各設(shè)置的時(shí)間點(diǎn)收集細(xì)胞并與DMSO對(duì)照組比較，以FACS進(jìn)行HeLa細(xì)胞周期的綜合分析。

以FACS進(jìn)行HeLa細(xì)胞周期的綜合分析：

(5)在上述含有細(xì)胞周期同步化的HeLa細(xì)胞6孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，分別加入含有20μM小分子抑制劑F083-0063的新鮮培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)，在0h、12h、16h和24h時(shí)間點(diǎn)分別收集細(xì)胞。

(6)在上述各時(shí)間點(diǎn)收集的細(xì)胞分別以4℃預(yù)冷的PBS漂洗細(xì)胞3次并以0.25％胰酶消化細(xì)胞，再以4℃預(yù)冷的PBS重懸細(xì)胞，1000rpm×6min離心并收集細(xì)胞。

(7)小心地棄掉離心后的細(xì)胞上清液，緩慢加入4℃預(yù)冷的含70％乙醇的PBS固定液1mL充分懸浮細(xì)胞，4℃固定30min。

(8)固定后的細(xì)胞以1200rpm×6min離心并收集細(xì)胞，小心地棄掉乙醇固定液。爾后加入100μL PI/RNase A溶液并充分混勻，37℃避光孵育30min。

(9)各樣品做好對(duì)應(yīng)的標(biāo)記后，將細(xì)胞過(guò)濾到BD流式細(xì)胞管，各管再補(bǔ)加400μL PBS后，以FACS進(jìn)行分析。

(10)將含5μM、10μM、15μM和20μM小分子抑制劑F083-0063的新鮮培養(yǎng)基加入到周期同步化的HeLa細(xì)胞中并在作用12h后收集細(xì)胞，固定步驟及PI染色步驟同上所述，以FACS進(jìn)行量效關(guān)系分析。

或，以Western Blot進(jìn)行HeLa細(xì)胞周期的綜合分析：

(5)將周期同步化的HeLa細(xì)胞以5μM、10μM和15μM小分子抑制劑F083-0063作用16h后，收集細(xì)胞。各收集的細(xì)胞樣品分別加入60μL RIPA細(xì)胞裂解液(含100μg/mL PMSF)，充分懸浮細(xì)胞，冰浴30min，12000rpm×30min離心，小心地吸取上清液并做好對(duì)應(yīng)的標(biāo)記，再以BCA法進(jìn)行裂解蛋白的定量。裂解蛋白定量后，將各樣品的蛋白裂解液濃度調(diào)整為2mg/mL，每次上樣量約為30～40μg/Lane。

(6)準(zhǔn)備15％SDS-PAGE，上樣量30μg/Lane。SDS-PAGE電泳結(jié)束后，將聚丙烯酰胺凝膠和2張3mm Bio-Rad濾紙放入4℃預(yù)冷的1×轉(zhuǎn)移緩沖液中浸泡2～5min。

(7)將裁剪的與膠尺寸相當(dāng)?shù)腜VDF膜先用甲醇潤(rùn)濕30s，再用蒸餾水洗1min，然后置于上述1×轉(zhuǎn)移緩沖液浸泡2min。

(8)在Bio-Rad半干法轉(zhuǎn)膜儀的正極上放置一張平衡過(guò)的濾紙，將PVDF膜整齊地放在濾紙上，然后將聚丙烯酰胺凝膠平鋪于PVDF膜上，最后在該凝膠上面再整齊地放置另一張平衡過(guò)的濾紙。用潔凈的試管小心地輕壓，以去除夾層中的氣泡，然后以上述少許1×轉(zhuǎn)移緩沖液潤(rùn)濕周圍，使其保持一定的導(dǎo)電性。最后放置轉(zhuǎn)膜儀的負(fù)極并壓緊、壓實(shí)。

(9)Western Blot電轉(zhuǎn)條件設(shè)置：恒流轉(zhuǎn)膜0.2A×30min。

(10)電轉(zhuǎn)結(jié)束后，用鑷子小心地取出PVDF膜浸入TBST洗滌1次，再用鑷子小心夾出并室溫晾干后，依據(jù)預(yù)染Marker標(biāo)示分子量和目的蛋白分子量適當(dāng)裁剪PVDF膜并做好相應(yīng)的標(biāo)記。

(11)將裁剪的PVDF膜放入含5％Milk-TBST的封閉液中室溫緩慢振搖2h進(jìn)行封閉。

(12)封閉結(jié)束后，取出PVDF膜，將其放入到TBST中漂洗3次，每次10min。漂洗完畢后將標(biāo)記好的PVDF膜放入孵育盒中進(jìn)行一抗孵育反應(yīng)。

(13)按照相關(guān)抗體說(shuō)明書(shū)，以封閉液稀釋上述抗體并將抗體稀釋液置于孵育盒中，室溫緩慢振搖1h后，4℃過(guò)夜。

(14)從孵育盒中取出PVDF膜，用TBST漂洗3次，每次10min。漂洗完畢后再將PVDF膜放入孵育盒中進(jìn)行二抗孵育反應(yīng)。

(15)用封閉液稀釋對(duì)應(yīng)的HPR-Secondary Antibody(WB 1:2000)并將其置于含有對(duì)應(yīng)一抗孵育完畢的PVDF膜的孵育盒中，室溫緩慢振搖1～2h。

(16)從孵育盒中取出PVDF膜，用TBST漂洗3次，每次10min。然后進(jìn)行顯色反應(yīng)。

(17)顯色反應(yīng)：在PVDF膜正面(印記目的蛋白一面)加入適量增強(qiáng)型HRP底物化學(xué)發(fā)光液(按照說(shuō)明書(shū)配制A:B＝1:1)，立即置于凝膠成像儀中曝光5～10s后成像。

從流式結(jié)果可以看到，化合物F083-0063作用12h后G2/M的含量為53.3±1.8％，作用16h時(shí)G2/M的含量為7.3±0.2％，作用24h時(shí)G2/M的含量為3.1±0.4％，如(表3，圖2A，2B)所示趨勢(shì)呈現(xiàn)逐漸下降，這應(yīng)該是與化合物在不同時(shí)間的作用強(qiáng)度有關(guān)。接下來(lái)我們選取12h作為G2/M期阻滯的比較時(shí)間點(diǎn)。

在流式實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，當(dāng)5μM、10μM、15μM和20μM小分子抑制劑F083-0063作用于周期同步化的HeLa細(xì)胞12h時(shí)，與DMSO對(duì)照組相比，隨著小分子抑制劑F083-0063劑量的不斷增加，HeLa細(xì)胞的G2/M期比率逐漸升高(表4)。與DMSO對(duì)照組的G2/M期比率0.3±0.1％相比，20μM小分子抑制劑F083-0063作用于周期同步化的HeLa細(xì)胞12h后，HeLa細(xì)胞的G2/M期比率達(dá)到56.4±2.3％，HeLa細(xì)胞的G2/M期比率呈劑量依賴性的增加趨勢(shì)(圖2C，2D)。上述數(shù)據(jù)表明，小分子抑制劑F083-0063對(duì)HeLa細(xì)胞的G2/M期阻滯作用具有明顯的劑量依賴性。

表3化合物F083-0063作用12h后對(duì)細(xì)胞周期的阻滯效果

表4化合物F083-0063劑量變化對(duì)HeLa細(xì)胞的G2/M期的阻滯效率

Western Blot實(shí)驗(yàn)中，我們發(fā)現(xiàn)5μM、10μM、15μM小分子抑制劑F083-0063作用12h的HeLa細(xì)胞中Plk1、Cyclin B1、pHH-3隨著F083-0063劑量的不斷增加而逐漸積聚。其中，15μM小分子抑制劑F083-0063引發(fā)的周期阻滯中含有大量的M期細(xì)胞(圖2D)。Plk1、CyclinB1、pHH-3在HeLa細(xì)胞周期中的大量積聚表明，小分子抑制劑F083-0063引發(fā)了HeLa細(xì)胞的G2/M期阻滯。

綜上所述，小分子抑制劑F083-0063可以引發(fā)HeLa細(xì)胞發(fā)生G2/M期阻滯。

實(shí)施例5.小分子抑制劑F083-0063對(duì)HeLa細(xì)胞凋亡的影響

利用Annexin V/PI雙染法進(jìn)行。

測(cè)定原理：

磷酯酰絲氨酸(PS)是一種帶負(fù)電荷的磷脂，正常主要存在于細(xì)胞膜的內(nèi)面，在細(xì)胞發(fā)生凋亡時(shí)細(xì)胞膜上的這種磷脂分布的不對(duì)稱性被破壞而使PS暴露在細(xì)胞膜外。Annexin V是一種Ca2+依賴的磷脂結(jié)合蛋白，具有易于結(jié)合到磷脂類如PS的特性，對(duì)PS有高度的親和性。但PS轉(zhuǎn)移到細(xì)胞膜外不是凋亡所獨(dú)特的，也可發(fā)生在細(xì)胞壞死中。凋亡細(xì)胞對(duì)所有用于細(xì)胞活性鑒定的染料如PI有抗染性，壞死細(xì)胞則不能。細(xì)胞膜有損傷的細(xì)胞的DNA可被PI著染產(chǎn)生紅色熒光，而細(xì)胞膜保持完好的細(xì)胞則不會(huì)有紅色熒光產(chǎn)生。因此，在細(xì)胞凋亡的早期PI不會(huì)著染而沒(méi)有紅色熒光信號(hào)。正常活細(xì)胞與此相似。在雙變量流式細(xì)胞儀的散點(diǎn)圖上，左下象限顯示活細(xì)胞，為(FITC-/PI-)；右上象限是非活細(xì)胞，即凋亡晚期的細(xì)胞和壞死細(xì)胞，為(FITC+/PI+)；而右下象限為早期凋亡細(xì)胞，顯現(xiàn)(FITC+/PI-)；而左上象限為許可范圍內(nèi)的檢測(cè)誤差。

測(cè)定方法：

Annexin V/PI雙染法

(1)將HeLa細(xì)胞以0.25％胰酶消化后，以3×10⁶/mL接種于6孔細(xì)胞培養(yǎng)板，接種量2mL/孔。將細(xì)胞板置于37℃、5％CO2條件下培養(yǎng)24h至指數(shù)生長(zhǎng)期。

(2)上述HeLa細(xì)胞培養(yǎng)24后，以無(wú)菌PBS清洗細(xì)胞3次，更換分別含有DMSO、5μM、10μM、15μM小分子抑制劑F083-0063的新鮮培養(yǎng)液。做好相應(yīng)標(biāo)記后，將細(xì)胞板置于37℃、5％CO₂條件下繼續(xù)培養(yǎng)24h。

(3)取出上述細(xì)胞培養(yǎng)板，以PBS小心地漂洗1次，再以0.25％胰酶消化細(xì)胞，1000rpm×5min離心，收集細(xì)胞。

(4)用去離子水按1:4稀釋結(jié)合緩沖液(1×結(jié)合緩沖液：10mM Hepes/NaOH、140mM NaCl,2.5mM CaCl₂pH7.4)。

(5)將上述消化的HeLa細(xì)胞以4℃預(yù)冷的PBS洗滌2次，用250μL 1×結(jié)合緩沖液懸浮細(xì)胞，調(diào)節(jié)其濃度為5×10⁶/mL。

(6)取100μL的細(xì)胞懸液(細(xì)胞數(shù)約為5×10⁵)于EP管中，再加入5μL Annexin V-Alexa Fluor 488，室溫避光孵育30min。

(7)在上述反應(yīng)體系中再加入5μL PI，室溫避光孵育5～10min。

(8)將上述細(xì)胞懸液過(guò)濾到BD流式管中，再補(bǔ)加400μL PBS并做好對(duì)應(yīng)的標(biāo)記，立刻以流式細(xì)胞儀(BD Biosciences)進(jìn)行檢測(cè)和數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析。

根據(jù)雙染實(shí)驗(yàn)中，小分子抑制劑F083-0063作用24h后，通過(guò)流式細(xì)胞儀檢測(cè)與對(duì)照組相比加藥組在5μM、15μM、25μM濃度下，隨著小分子抑制劑劑量的逐漸增加，HeLa細(xì)胞的凋亡比例逐漸增大。如早期凋亡比例由6.2±0.1％增加到37.1±0.4％(表5，圖3A，3B)。當(dāng)濃度達(dá)到25μM時(shí)早期凋亡比例增加到43.6±3.5％?？梢?jiàn)小分子抑制劑可以很明顯的引起細(xì)胞凋亡并且具有較為明顯的濃度依賴性。

表5化合物F083-0063劑量變化對(duì)細(xì)胞凋亡的影響

綜上所述，小分子抑制劑F083-0063可以引發(fā)HeLa細(xì)胞發(fā)生大量凋亡。

實(shí)施例6.小分子抑制劑F083-0063對(duì)HeLa細(xì)胞遷移的影響

利用細(xì)胞劃痕法進(jìn)行

測(cè)定原理：

細(xì)胞劃痕法是測(cè)定腫瘤細(xì)胞的運(yùn)動(dòng)性的方法之一。在體外培養(yǎng)的單層細(xì)胞上，劃痕致傷，然后在加入藥物等試驗(yàn)條件觀察其對(duì)腫瘤細(xì)胞遷移的影響。

測(cè)定方法：

劃痕實(shí)驗(yàn)

(1)事先將Maker筆，直尺，槍，槍頭均放入超凈臺(tái)中紫外照射至少30min，先用Maker筆在6孔板的背面比著直尺劃線，線與線之間距離至少為0.5-1cm，橫穿過(guò)孔，每孔至少穿過(guò)3條線，以便在不同視野下觀察。

(2)以5×10⁵個(gè)/孔的密度接種于6孔板中，接種的密度以不同細(xì)胞而有所差異，掌握為過(guò)夜鋪滿為好。

(3)培養(yǎng)24h后，顯微鏡下觀察細(xì)胞的生長(zhǎng)情況，看細(xì)胞是否鋪滿，若狀態(tài)良好，則用槍頭比著直尺，劃得線盡量垂直于背面的橫線痕跡，槍頭要垂直，不要傾斜。

(4)用滅過(guò)菌的PBS清洗3次，除去劃痕下的細(xì)胞，加入以配好濃度的陽(yáng)性化合物(5μM、10μM、15μM、20μM)，放入37℃5％CO2的培養(yǎng)箱孵育培養(yǎng)48h后取樣，拍照。

(5)小分子抑制劑F083-0063濃度為20μM，分別培養(yǎng)12h、24h、36h、48h后，進(jìn)行取樣拍照。

20μM的小分子抑制劑F083-0063，分別作用12h、24h、36h、48h后觀察細(xì)胞的遷移情況，與對(duì)照組相比，12h與對(duì)照組相近，隨時(shí)間延長(zhǎng)，加藥組遷移明顯受到抑制，表現(xiàn)出時(shí)間依賴性(圖4A、4B)。

細(xì)胞遷移結(jié)果如(圖4C、4D)所示,與對(duì)照組相比,加藥組的細(xì)胞遷移能力明顯減弱,尤其是在20μM時(shí),由最開(kāi)始的58.8±0.5％變?yōu)?9.6±0.7％。隨著劑量的逐漸增加,遷移率明顯受抑制,存在劑量依賴性。

實(shí)施例7.小分子抑制劑F083-0063與Plk1PBD結(jié)合方式的研究-分子對(duì)接

利用Discovery Studio 4.0軟件(Designed by Accelrys Inc.San Diego,CA)軟件進(jìn)行。

測(cè)定原理：

分子對(duì)接(Molecular Docking)是指配體與受體之間通過(guò)能量匹配和幾何匹配而互相識(shí)別的過(guò)程，其主要包括靜電作用、氫鍵作用、疏水作用力、范德華力等。近年來(lái)，隨著計(jì)算機(jī)輔助藥物設(shè)計(jì)技術(shù)的飛速發(fā)展，分子對(duì)接技術(shù)已成為基于結(jié)構(gòu)的藥物設(shè)計(jì)和計(jì)算機(jī)輔助藥物設(shè)計(jì)的重要方法之一。Discovery Studio 4.0軟件(Designed by Accelrys Inc.San Diego,CA)是目前全球應(yīng)用最為廣泛的計(jì)算機(jī)輔助設(shè)計(jì)平臺(tái)之一，其在計(jì)算分子模擬和藥物設(shè)計(jì)領(lǐng)域都有著極其廣泛的應(yīng)用。

Discovery Studio 4.0軟件有多個(gè)模塊，主要功能包括：蛋白質(zhì)的表征(包括蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用)、同源建模、分子力學(xué)計(jì)算、分子動(dòng)力學(xué)模擬、基于結(jié)構(gòu)藥物設(shè)計(jì)(包括配體-蛋白質(zhì)相互作用、全新藥物設(shè)計(jì)和分子對(duì)接)、基于小分子的藥物設(shè)計(jì)(包括定量構(gòu)效關(guān)系、藥效團(tuán)、數(shù)據(jù)庫(kù)篩選、ADMET)和組合庫(kù)的設(shè)計(jì)與分析等。

測(cè)定方法：

在以Discovery Studio 4.0軟件進(jìn)行的小分子抑制劑F083-0063和Plk1PBD的分子對(duì)接中，我們選擇PDB(Protein Data Bank)中4H71結(jié)構(gòu)。

使用Discovery Studio 4.0軟件將小分子抑制劑F083-0063與Plk1PBD的活性中心(PDB code 4H71)進(jìn)行分子對(duì)接。PLK1PBD結(jié)構(gòu)域是由His538、Lys540、TRP414(是氨基酸中的一種色氨酸，是人體必需氨基酸)、Lys540和Asp416等多個(gè)氨基酸組成，通過(guò)對(duì)接結(jié)果顯示(圖5)，F(xiàn)083-0063與PLK1PBD的結(jié)構(gòu)域呈現(xiàn)出較高的親和性，其中小分子抑制劑苯環(huán)上的羰基能與His538、Lys540、TRP414形成牢固的氫鍵，同時(shí)與TRP414、ASP416、ARG516以及ARG557形成疊加的π鍵，此外，F(xiàn)083-0063與PLK1PBD還存在非共價(jià)鍵的競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合方式，進(jìn)而使得小分子抑制劑與PBD結(jié)構(gòu)域結(jié)合得更加緊密。

最后需要說(shuō)明的是，以上實(shí)施例僅用于幫助本領(lǐng)域技術(shù)人員理解本發(fā)明技術(shù)方案的實(shí)質(zhì)，而不用于對(duì)本發(fā)明保護(hù)范圍的限制。