本發(fā)明涉及纖維素降解領(lǐng)域，具體地，涉及一株硝基還原假單胞菌(pseudomonasnitroreducens)及其發(fā)酵產(chǎn)物和在降解纖維素中用途。

背景技術(shù)：

我國是農(nóng)業(yè)大國，各類農(nóng)作物秸稈資源十分豐富，但當(dāng)秸稈直接還田后在土壤中分解轉(zhuǎn)化的周期長，難以作為當(dāng)季作物的肥源。同時，每年約有30％的剩余作物秸稈不能有效得到處理和利用，在收割季節(jié)秸稈被集中焚燒的現(xiàn)象日益突出，污染空氣并危害人們的身體健康。使用傳統(tǒng)的物化方法，如酸處理、堿處理以及蒸汽加熱等方法處理秸稈等纖維素，存在反應(yīng)條件劇烈、設(shè)備昂貴、成本較高、帶來新的環(huán)境污染等問題。而利用投加纖維素高效降解菌的方法經(jīng)濟(jì)、有效，正逐漸成為當(dāng)前的研究熱點(diǎn)。

目前獲得的產(chǎn)纖維素酶微生物的纖維素內(nèi)切酶活和濾紙酶活均較低，例如，張淑紅從青藏高原篩選一株低溫產(chǎn)纖維素酶的假單胞菌lhg-c9，內(nèi)切酶活為3.02u/ml(張淑紅,劉秀花,梁峰,等.低溫纖維素降解菌的篩選及其酶學(xué)性質(zhì)初步研究)；趙方圓等人的研究表明：纖維素降解菌aspergillussp.yn1內(nèi)切酶活及總酶活可達(dá)到0.553u/ml和0.15u/ml(見趙方圓和范寧杰等,纖維素降解菌aspergillussp.yn1的產(chǎn)酶條件及酶學(xué)特性[j].微生物學(xué)通報,2010,37(8):1194-1199)；黃寧珍等研究的纖維素降解真菌34內(nèi)切酶和總酶活能達(dá)到325.67u/l和144.14u/l(見黃寧珍和付傳明等,纖維素降解真菌分離篩選、產(chǎn)酶特性及高效水解菌系的初步構(gòu)建[j].西南農(nóng)業(yè)學(xué)報,2010,23(5):1489-1496)。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的是提供一株能夠高效降解纖維素的硝基還原假單胞菌及其發(fā)酵產(chǎn)物和用途。

為了實(shí)現(xiàn)上述目的，第一方面，本發(fā)明提供了一種硝基還原假單胞菌，該硝基還原假單胞菌的保藏編號為cgmccno.13412。

第二方面，本發(fā)明提供了培養(yǎng)第一方面所述的硝基還原假單胞菌的方法，包括：將所述硝基還原假單胞菌接種至發(fā)酵培養(yǎng)基中進(jìn)行發(fā)酵。

第三方面，本發(fā)明提供了根據(jù)第二方面所述的方法得到的發(fā)酵產(chǎn)物。

第四方面，本發(fā)明提供了一種降解纖維素的方法，包括：將降解劑與含纖維素的原料接觸，所述降解劑為第一方面所述的硝基還原假單胞菌和/或第一方面所述的硝基還原假單胞菌的發(fā)酵產(chǎn)物。

第五方面，本發(fā)明提供了第一方面所述的硝基還原假單胞菌和/或第一方面所述的硝基還原假單胞菌的發(fā)酵產(chǎn)物在降解纖維素中的用途。

本發(fā)明的硝基還原假單胞菌能夠高效降解纖維素，其發(fā)酵產(chǎn)物同時具有纖維素內(nèi)切酶、纖維素外切酶、β-葡萄糖苷酶、木質(zhì)素過氧化物酶、錳過氧化物酶和漆酶酶活，且酶活性較高。

本發(fā)明的其它特征和優(yōu)點(diǎn)將在隨后的具體實(shí)施方式部分予以詳細(xì)說明。

生物保藏

本發(fā)明的硝基還原假單胞菌，于2016年12月2日被保藏在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(地址：北京市朝陽區(qū)北辰西路1號院3號，中國科學(xué)院微生物研究所，郵政編碼：100101)(保藏單位的縮寫為cgmcc)，保藏編號為cgmccno.13412。

附圖說明

附圖是用來提供對本發(fā)明的進(jìn)一步理解，并且構(gòu)成說明書的一部分，與下面的具體實(shí)施方式一起用于解釋本發(fā)明，但并不構(gòu)成對本發(fā)明的限制。在附圖中：

圖1是液體培養(yǎng)本發(fā)明的硝基還原假單胞菌時纖維素內(nèi)切酶活隨培養(yǎng)時間的變化曲線圖；

圖2是液體培養(yǎng)本發(fā)明的硝基還原假單胞菌時總酶活隨培養(yǎng)時間的變化曲線圖；

圖3是固體培養(yǎng)本發(fā)明的硝基還原假單胞菌時纖維素內(nèi)切酶活隨培養(yǎng)時間的變化曲線圖；

圖4是固體培養(yǎng)本發(fā)明的硝基還原假單胞菌時總酶活隨培養(yǎng)時間的變化曲線圖。

具體實(shí)施方式

以下對本發(fā)明的具體實(shí)施方式進(jìn)行詳細(xì)說明。應(yīng)當(dāng)理解的是，此處所描述的具體實(shí)施方式僅用于說明和解釋本發(fā)明，并不用于限制本發(fā)明。

在本文中所披露的范圍的端點(diǎn)和任何值都不限于該精確的范圍或值，這些范圍或值應(yīng)當(dāng)理解為包含接近這些范圍或值的值。對于數(shù)值范圍來說，各個范圍的端點(diǎn)值之間、各個范圍的端點(diǎn)值和單獨(dú)的點(diǎn)值之間，以及單獨(dú)的點(diǎn)值之間可以彼此組合而得到一個或多個新的數(shù)值范圍，這些數(shù)值范圍應(yīng)被視為在本文中具體公開。

在本發(fā)明中，在未作相反說明的情況下，使用的術(shù)語“酶活力”的大小即酶含量的多少，用酶活力單位表示，即酶單位(u)，本發(fā)明中酶單位的定義是：對于纖維素內(nèi)切酶活和濾紙酶活，采用dns法測定，以每分鐘催化纖維素水解產(chǎn)生1μg的葡萄糖所需要的酶量為1個酶活力單位，即1u＝1μg/min，對于木質(zhì)素過氧化物酶、錳過氧化物酶和漆酶，采用紫外分光光度法測定，用每分鐘吸光度值增加0.1的酶量來表示1個酶活力單位。“酶的比活力”代表每單位體積樣品的催化能力，能夠反應(yīng)酶活大小，其值越大，表明酶活越高，比活力的計算公式為：比活力(u/ml)＝總酶活力單位數(shù)/ml樣品，本發(fā)明中，“酶活”與“酶活力”可互換使用?！盀V紙酶活”亦稱總酶活，指纖維素內(nèi)切酶、纖維素外切酶和β-葡萄糖苷酶的總酶活。

本發(fā)明提供的硝基還原假單胞菌的保藏編號為cgmccno.13412。該菌株生長快速，產(chǎn)纖維素酶能力強(qiáng)，降解秸稈效果明顯，可應(yīng)用于大田秸稈助腐，對大田耕種啟到很好的促進(jìn)作用，有助于提高土壤肥力，增強(qiáng)農(nóng)作物所需營養(yǎng)物質(zhì)，促進(jìn)植物生長，具有廣闊的應(yīng)用前景。

本發(fā)明提供的培養(yǎng)上述硝基還原假單胞菌的方法包括：將所述硝基還原假單胞菌接種至發(fā)酵培養(yǎng)基中進(jìn)行發(fā)酵。

通常地，相對于每升的發(fā)酵培養(yǎng)基，所述硝基還原假單胞菌的接種量為20-30mg(以干重計)。

本發(fā)明中，所述發(fā)酵培養(yǎng)基可以為各種常規(guī)的能夠?yàn)橄趸€原假單胞菌提供營養(yǎng)物質(zhì)的培養(yǎng)基，可以為lb培養(yǎng)基，也可以為含羧甲基纖維素鈉的培養(yǎng)基，例如，每升的發(fā)酵培養(yǎng)基可以含有羧甲基纖維素鈉(cmc-na，或淀粉)12-15g，nacl4-5g，kh2po40.5-1g，mgso4·7h2o0.2-0.5g，蛋白胨(或牛肉膏)12-15g，酵母粉4-5g。一般地，如果進(jìn)行固體培養(yǎng)，每升的發(fā)酵培養(yǎng)基還可以含有瓊脂18-20g。

對發(fā)酵的條件沒有特別的要求，為了獲得酶活力更優(yōu)的發(fā)酵清液，優(yōu)選地，所述發(fā)酵的條件包括：溫度為28-35℃，時間為2-4天，ph值為6-8。

本發(fā)明中，所述方法還可以包括在發(fā)酵前對硝基還原假單胞菌依次進(jìn)行活化和種子培養(yǎng)，活化是為了將保藏狀態(tài)的菌種放入適宜的培養(yǎng)基中培養(yǎng)，使其恢復(fù)發(fā)酵性能；種子培養(yǎng)是為了得到較多的純而壯的培養(yǎng)物，即獲得活力旺盛、接種數(shù)量足夠的硝基還原假單胞菌?？梢圆捎帽绢I(lǐng)域常規(guī)的方法進(jìn)行活化和種子培養(yǎng)，例如，所述活化可以包括將硝基還原假單胞菌的菌絲體接種至lb平板上，28-32℃下培養(yǎng)3-5天。所述種子培養(yǎng)可以包括將活化后的硝基還原假單胞菌接種至種子培養(yǎng)基(液體)中，28-32℃培養(yǎng)2-3天。lb平板和種子培養(yǎng)基均為本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知，在此不再贅述。

本發(fā)明還提供了根據(jù)上述方法得到的發(fā)酵產(chǎn)物。所述發(fā)酵產(chǎn)物可以指分離菌體(5000-8000rpm條件下離心10-15min)后獲得的發(fā)酵清液(上清液)。本發(fā)明獲得的發(fā)酵產(chǎn)物具有較強(qiáng)的纖維素降解活性，可以應(yīng)用于降解植物性廢料(如大豆桿、玉米秸稈、麩皮、棉籽殼、花生殼、玉米芯等)。

本發(fā)明提供的降解纖維素的方法包括：將降解劑與含纖維素的原料接觸，所述降解劑為如上所述的硝基還原假單胞菌和/或其發(fā)酵產(chǎn)物。所述發(fā)酵產(chǎn)物優(yōu)選為如上所述的發(fā)酵產(chǎn)物，在此不再詳述。

根據(jù)本發(fā)明，所述降解劑為硝基還原假單胞菌時，相對于每克的以纖維素計的含纖維素的原料，所述降解劑的用量優(yōu)選為2-3mg。優(yōu)選地，所述接觸的條件包括：溫度為28-35℃，時間為2-10天。

根據(jù)本發(fā)明，所述發(fā)酵產(chǎn)物為發(fā)酵清液與菌體的混合物或者發(fā)酵清液。

所述降解劑為發(fā)酵清液時，相對于每克的以纖維素計的含纖維素的原料，所述降解劑以蛋白計的用量可以為0.4-0.5mg。優(yōu)選地，所述接觸的條件包括：溫度為28-30℃，時間為3-4天。

所述降解劑為發(fā)酵清液與菌體的混合物時，相對于每克的以纖維素計的含纖維素的原料，所述降解劑以硝基還原假單胞菌計的用量可以為2-3mg。優(yōu)選地，所述接觸的條件包括：溫度為28-35℃，時間為2-10天。

根據(jù)本發(fā)明的降解纖維素的方法，所述發(fā)酵產(chǎn)物優(yōu)選為如上所述的發(fā)酵產(chǎn)物。

根據(jù)本發(fā)明，所述含纖維素的原料可以為各種常見的植物性廢料(如秸稈、種子殼、木質(zhì)廢料、紙屑、棉屑、玉米芯和甘蔗渣等)。

根據(jù)本發(fā)明，為了促進(jìn)纖維素的降解，所述接觸還可以在無機(jī)鹽的存在下進(jìn)行，例如磷酸二氫鉀、硫酸鎂、硫酸銨和酵母粉等中的至少一種。相對于每克的含纖維素的原料(以干重計)，磷酸氫二鉀的用量可以為4-6mg，磷酸二氫鉀的用量可以為4-6mg，七水硫酸鎂的用量可以為0.5-1.5mg，硫酸銨的用量可以為5-10mg，酵母粉的用量可以為3-40mg。

本發(fā)明還提供了如上所述的硝基還原假單胞菌和/或其發(fā)酵產(chǎn)物在降解纖維素中的用途。

以下將通過實(shí)施例對本發(fā)明進(jìn)行詳細(xì)描述。

實(shí)施例1

(1)將菌株gm(即保藏編號為cgmccno.13412的硝基還原假單胞菌)接種至gu-pda平板(葡萄糖：20g，馬鈴薯浸粉3g，磷酸二氫鉀：3g，硫酸鎂：1.5g，瓊脂：15g，愈創(chuàng)木酚：1g)，于30℃在恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)7d，菌落周圍出現(xiàn)紅棕色變色圈，分別測得菌落直徑(d)為7mm和變色圈的直徑(h)為13mm，比值(h/d)為1.86，說明本發(fā)明的菌株具有較好的木質(zhì)素酶活。

(2)將菌株gm(以干重計，接種量為25mg/l)于恒溫(30℃)振蕩器(170rpm)中培養(yǎng)4d，使用的培養(yǎng)基(1l)組成為：cmc-na10g，kh2po44g，mgso4·7h2o0.3g，蛋白胨3g，酵母粉0.5g，(nh4)2so42g，cacl2·2h2o0.3g，吐溫-800.2g，ph為6.5-7；將得到的培養(yǎng)物在6000rpm條件下離心15min，取上清液(即發(fā)酵清液)為粗酶液。通過dns法(參照文獻(xiàn)纖維素降解菌aspergillussp.yn1的產(chǎn)酶條件及酶學(xué)特性,微生物學(xué)通報,2010,37(8):1194-1199)對粗酶液進(jìn)行纖維素內(nèi)切酶活和濾紙酶活測定。通過紫外分光光度計(參照文獻(xiàn)高效木質(zhì)素降解菌株的分離篩選,浙江大學(xué)學(xué)報(農(nóng)業(yè)與生命科學(xué)版),2011,37(3):259-262)測量粗酶液的木質(zhì)素過氧化物酶、錳過氧化物酶和漆酶的酶活。結(jié)果顯示，纖維素內(nèi)切酶活力和濾紙酶活力分別達(dá)到78.61u/ml，13.74u/ml；木質(zhì)素過氧化物酶、錳過氧化物酶和漆酶的酶活力分別為0.087u/ml、0.12u/ml和0.035u/ml。

實(shí)施例2

(1)按照實(shí)施例1步驟(2)培養(yǎng)菌株gm，不同的是，每隔24h采樣測定纖維素內(nèi)切酶活和總酶活(也即濾紙酶活)，并制作以時間為橫坐標(biāo)，以酶活為坐標(biāo)的酶活性曲線。得出其酶活與培養(yǎng)時間的關(guān)系，結(jié)果分別如圖1和圖2所示，可以看出，在液體培養(yǎng)條件下，兩種酶活均在第3天達(dá)最大值，分別為82.35u/ml和11.87u/ml。

(2)將菌株gm(以干重計，接種量為25mg/l)于恒溫(30℃)下進(jìn)行培養(yǎng)，使用的培養(yǎng)基組成為：小麥秸稈(2mm左右，取自河北保定)50g，磷酸二氫鉀1g，七水硫酸鎂0.025g，硫酸銨1g，去離子水100ml。每隔24h按照實(shí)施例1步驟(2)的方法采樣測定纖維素內(nèi)切酶活和濾紙酶活，并制作以時間為橫坐標(biāo)，以酶活為坐標(biāo)的酶活性曲線。得出其酶活與培養(yǎng)時間的關(guān)系，結(jié)果分別如圖3和圖4所示，可以看出，在固體培養(yǎng)條件下，兩種酶活在第5天達(dá)最大值，分別為1187.26u/ml和208.43u/ml。

實(shí)施例3

將50ml錐形瓶和研磨好的小麥秸稈(2mm左右，取自河北保定)高溫烘干后稱重，精確到0.1mg，記為w1(錐形瓶)和w2(小麥秸稈)。小麥秸稈稱取1g，含0.5重量％酵母粉的無機(jī)鹽溶液(含5mg磷酸氫二鉀、5mg磷酸二氫鉀、1mg七水硫酸鎂和5mg硫酸銨)7.5g，放入50ml錐形瓶中在121℃下滅菌15min。加入菌株gm接種液1ml(以硝基還原假單胞菌計的用量為2.5mg)，放入恒溫培養(yǎng)箱，在30℃下培養(yǎng)10d。菌株作一個平行對照組，結(jié)果取平均值。在121℃下滅菌15min，烘干稱重，記為w3(錐形瓶和培養(yǎng)物的總重)。按照“降解率＝(w1+w2-w3)/w2×100％”計算菌株降解秸稈的降解率，結(jié)果為37.2％。

從以上結(jié)果可以看出，本發(fā)明的硝基還原假單胞菌的發(fā)酵產(chǎn)物同時具有纖維素內(nèi)切酶、纖維素外切酶、β-葡萄糖苷酶、木質(zhì)素過氧化物酶、錳過氧化物酶和漆酶酶活，且活性較高，將其用于降解秸稈時能夠獲得較高的降解率。

以上詳細(xì)描述了本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方式，但是，本發(fā)明并不限于上述實(shí)施方式中的具體細(xì)節(jié)，在本發(fā)明的技術(shù)構(gòu)思范圍內(nèi)，可以對本發(fā)明的技術(shù)方案進(jìn)行多種簡單變型，這些簡單變型均屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。

另外需要說明的是，在上述具體實(shí)施方式中所描述的各個具體技術(shù)特征，在不矛盾的情況下，可以通過任何合適的方式進(jìn)行組合，為了避免不必要的重復(fù)，本發(fā)明對各種可能的組合方式不再另行說明。

此外，本發(fā)明的各種不同的實(shí)施方式之間也可以進(jìn)行任意組合，只要其不違背本發(fā)明的思想，其同樣應(yīng)當(dāng)視為本發(fā)明所公開的內(nèi)容。