1.一種ctDNA超低頻突變檢測(cè)文庫的構(gòu)建方法,其特征在于,包括以下步驟:
S1,從全血中提取cfDNA;
S2,對(duì)所述cfDNA進(jìn)行末端修復(fù)及3’端添加A堿基;
S3,將所述S2得到的cfDNA的末端連接含有隨機(jī)標(biāo)簽序列的接頭;
S4,根據(jù)所述接頭的序列及目標(biāo)區(qū)域設(shè)計(jì)多重PCR的引物進(jìn)行目標(biāo)區(qū)域捕獲,所述多重PCR的引物中上游引物為通用引物,匹配所述接頭的序列,下游引物為擴(kuò)增所述目標(biāo)區(qū)域的特異性引物;
S5,對(duì)所述S4的PCR產(chǎn)物進(jìn)行磁珠純化,去除掉未非特異性擴(kuò)增的小片段DNA及引物二聚體;以及
S6,對(duì)所述S5的產(chǎn)物進(jìn)行PCR擴(kuò)增,同時(shí)引入index序列,得到所述ctDNA超低頻突變的文庫。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的構(gòu)建方法,其特征在于,所述隨機(jī)標(biāo)簽序列的長度為12bp。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的構(gòu)建方法,其特征在于,所述接頭為如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示的脫氧核苷酸序列。
4.一種用于ctDNA超低頻突變檢測(cè)文庫構(gòu)建的試劑盒,其特征在于,包括:cfDNA提取試劑、對(duì)cfDNA進(jìn)行末端修復(fù)及3’端添加A堿基的試劑、含有隨機(jī)標(biāo)簽序列的接頭、接頭連接試劑、根據(jù)所述接頭的序列及目標(biāo)區(qū)域設(shè)計(jì)的多重PCR引物,所述多重PCR引物中上游引物為通用引物,匹配所述接頭的序列,下游引物為擴(kuò)增所述目標(biāo)區(qū)域的特異性引物,對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行磁珠純化的試劑,去除掉未非特異性擴(kuò)增的小片段DNA及引物二聚體的試劑,用于PCR擴(kuò)增的試劑,將index序列引入DNA片段的引物。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的試劑盒,其特征在于,所述隨機(jī)標(biāo)簽序列的長度為12bp。
6.根據(jù)權(quán)利要求4所述的試劑盒,其特征在于,所述接頭包括如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示的脫氧核苷酸序列。
7.一種文庫檢測(cè)數(shù)據(jù)的分析方法,所述文庫為如權(quán)利要求1至3中任一項(xiàng)所述的ctDNA超低頻突變檢測(cè)文庫,其特征在于,包括以下步驟:
S1,對(duì)所述文庫測(cè)序后的數(shù)據(jù)通過隨機(jī)標(biāo)簽序列進(jìn)行聚類分析,排除掉PCR擴(kuò)增錯(cuò)誤及測(cè)序錯(cuò)誤產(chǎn)生的序列數(shù)據(jù);
S2,剩余的數(shù)據(jù)質(zhì)控合格后進(jìn)入變異檢測(cè)分析。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的分析方法,其特征在于,所述S2包括:采用samtools軟件進(jìn)行突變檢測(cè),并根據(jù)聚類完的標(biāo)簽序列進(jìn)行計(jì)數(shù),在同一標(biāo)簽中支持突變的reads占80%以上則計(jì)數(shù),所有標(biāo)簽在同一個(gè)突變出現(xiàn)2次算作陽性檢出,合并點(diǎn)突變檢出結(jié)果,使用annovar軟件進(jìn)行注釋,得到氨基酸水平突變注釋。