本發(fā)明是申請(qǐng)日為2012年6月8日，申請(qǐng)?zhí)枮?01280027912.7，標(biāo)題為“用于定向藥物輸送和增強(qiáng)sirna活性的化合物”的專(zhuān)利申請(qǐng)的分案申請(qǐng)。相關(guān)申請(qǐng)的交叉引用本申請(qǐng)要求2011年6月8號(hào)遞交的美國(guó)臨時(shí)申請(qǐng)no.61/494,840和61/494,710的權(quán)利，將其全部?jī)?nèi)容通過(guò)援引合并入本文。本發(fā)明涉及陽(yáng)離子脂質(zhì)和脂溶性維生素化合物的用途，以定向包含sirna的治療性分子和增強(qiáng)其活性。
背景技術(shù)：
：肝纖維化可由活化的肝星形細(xì)胞(hsc)引起，導(dǎo)致多種膠原分子和纖連蛋白沉積在間質(zhì)組織上。這可引起肝硬化、肝功能衰竭、和/或肝細(xì)胞癌。另外長(zhǎng)期的胰腺炎因?yàn)榕c肝纖維化的一樣的機(jī)制的胰纖維化發(fā)生(madro等人，2004；medscimonit.10:ra166-70；jaster,2004,molcancer.6:26)。另外，星形細(xì)胞存在聲帶與喉的聲帶病癥中，例如聲帶瘢痕、聲帶粘膜纖維化、和喉纖維化。為了預(yù)防和治療在這些器官中的和身體的其它部位的纖維化，人們對(duì)開(kāi)發(fā)藥物載體和藥物載體試劑盒有需求。星形細(xì)胞是治療纖維化的重要目標(biāo)候選物之一(fallowfield等人，2004,expertopinthertargets.8:423-35；pinzani等人，2004,digliverdis.36:231-42)。在纖維化期間，星形細(xì)胞由來(lái)自鄰近細(xì)胞的細(xì)胞活素活化，并被活化。已知星形細(xì)胞是維生素a的貯藏細(xì)胞，屬于肌成纖維細(xì)胞家族，并產(chǎn)生許多引起肝纖維化的因子。預(yù)防或治療纖維化的治療性方法嘗試控制膠原新陳代謝、提升膠原降解系統(tǒng)、和抑制星形細(xì)胞的活化，但是在所有情況下，因?yàn)樽饔玫奶禺愋院?或器官特異性低，存在有限的功效和不利的副作用的問(wèn)題。抑制膠原蛋白的合成還沒(méi)有確立為治療性方法。因?yàn)橛幸鸶弊饔玫目赡苄?，定向膠原生產(chǎn)的分子的潛能是有限的。直接抑制膠原生產(chǎn)將是預(yù)防或治療纖維化的顯而易見(jiàn)的方法。為了這樣做，需要控制各種膠原類(lèi)型(collagentypes)i至iv中的一種或多種。實(shí)現(xiàn)此的方法可以是通過(guò)膠原特異性分子伴侶蛋白hsp47，其對(duì)于(對(duì)各種膠原是必需的)分子內(nèi)運(yùn)輸和分子成熟是必需的。因此，如果在器官的星形細(xì)胞中可以特異地控制hsp47的功能，那么有可能抑制器官中的肝纖維化。許多技術(shù)可用于運(yùn)送例如sirna的治療劑進(jìn)細(xì)胞，包括使用病毒轉(zhuǎn)染系統(tǒng)和非病毒轉(zhuǎn)染系統(tǒng)。非病毒轉(zhuǎn)染系統(tǒng)可包括，例如聚合物、脂質(zhì)、脂質(zhì)體、微膠粒、樹(shù)狀具體、和納米材料。先前已有研究用于細(xì)胞轉(zhuǎn)染的聚合物的實(shí)例包括陽(yáng)離子聚合物，例如聚(l-賴氨酸)(pll)、聚乙烯亞胺(pei)、殼聚糖、和聚(2-二甲基氨基)乙基甲基丙烯酸酯(pdmaema)。各種系統(tǒng)具有其各自的優(yōu)點(diǎn)和缺點(diǎn)。例如病毒系統(tǒng)可獲得高轉(zhuǎn)染率，但是可能不如一些非病毒系統(tǒng)安全。此外，病毒系統(tǒng)可能是復(fù)雜的和/或制備是昂貴的。已有報(bào)導(dǎo)例如陽(yáng)離子聚合物的非病毒轉(zhuǎn)染系統(tǒng)用于轉(zhuǎn)化質(zhì)粒dna進(jìn)入細(xì)胞。但是使用陽(yáng)離子聚合物的一些缺點(diǎn)包括其對(duì)細(xì)胞的毒性和/或它們?nèi)狈Ψ€(wěn)定性。因此，迫切需求使用陽(yáng)離子成分的新的化合物、組合物、和方法以改進(jìn)包含核酸的治療藥物至細(xì)胞、組織和有機(jī)體的輸送。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：本發(fā)明的一方面是式i的化合物其中r1和r2獨(dú)立地選自c10至c18的烷基、c12至c18的烯基、和油基；其中r3和r4獨(dú)立地選自c1至c6烷基、和c2至c6鏈烷醇；其中x選自-ch2-、-s-、和-o-、或不存在；其中y選自-(ch2)n、-s(ch2)n、-o(ch2)n-、噻吩、-so2(ch2)n-、和酯，其中n＝1-4；其中a＝1-4；其中b＝1-4；其中c＝1-4；其中z是抗衡離子。一方面，本發(fā)明提供促進(jìn)藥物輸送到靶細(xì)胞的化合物，其包含結(jié)構(gòu)(定向分子)m-接頭-(定向分子)n，其中定向分子類(lèi)視黃醇，其在靶細(xì)胞上具有特異性受體或活化/結(jié)合位點(diǎn)；其中m和n獨(dú)立地是0、1、2、或3；和其中接頭包含聚乙二醇(peg)或類(lèi)peg分子。一個(gè)實(shí)施方式中，類(lèi)視黃醇選自維生素a、維甲酸(retinoicacid)、維a酸(tretinoin)、阿達(dá)帕林、4-羥基(苯基)視黃酰胺(4-hpr)、棕櫚酸視黃酯、視黃醇、飽和維甲酸、和飽和的去甲基化的維甲酸。在另一個(gè)實(shí)施方式中，接頭選自雙酰胺-peg、三酰胺-peg、四酰胺-peg、lys-雙酰胺-peglys、lys-三酰胺-peg-lys、lys-四酰胺-peg-lys、lys-peg-lys、peg2000、peg1250、peg1000、peg750、peg550、peg-glu、glu、c6、gly3、和glunh。在另一個(gè)實(shí)施方式中，該化合物選自類(lèi)視黃醇-peg-類(lèi)視黃醇、(類(lèi)視黃醇)2-peg-(類(lèi)視黃醇)2、va-peg2000-va、(類(lèi)視黃醇)2-雙酰胺-peg-(類(lèi)視黃醇)2、(類(lèi)視黃醇)2-lys-雙酰胺-peg-lys-(類(lèi)視黃醇)2。在另一個(gè)實(shí)施方式中，類(lèi)視黃醇選自維生素a、維甲酸(retinoicacid)、維a酸(tretinoin)、阿達(dá)帕林、4-羥基(苯基)視黃酰胺(4-hpr)、棕櫚酸視黃酯、視黃醇、飽和維甲酸、和飽和的去甲基化的維甲酸。在另一個(gè)實(shí)施方式中，該化合物是以下結(jié)構(gòu)式的合成物(composition)其中q、r、和s各自獨(dú)立地是1、2、3、4、5、6、7、8、9、或10。在另一個(gè)實(shí)施方式中，該化合物的結(jié)構(gòu)式包括：另一方面，本發(fā)明提供星形細(xì)胞特異性藥物載體，其包含星形細(xì)胞特異性量的類(lèi)視黃醇分子，所述類(lèi)視黃醇分子包含結(jié)構(gòu)(類(lèi)視黃醇)m-接頭-(類(lèi)視黃醇)n；其中m和n獨(dú)立地是0、1、2、或3；其中接頭包含聚乙二醇(peg)或類(lèi)peg分子。在另一個(gè)實(shí)施方式中，本發(fā)明提供包含脂質(zhì)體合成物的組合物。在其它實(shí)施方式中，所述脂質(zhì)體合成物包含脂質(zhì)分子雙層的脂質(zhì)囊泡。在某些實(shí)施方式中，在藥物載體到達(dá)星形細(xì)胞之前，類(lèi)視黃醇分子至少部分地暴露于該藥物載體的外部。在另一個(gè)實(shí)施方式中，類(lèi)視黃醇是脂質(zhì)分子的0.1摩爾％至20摩爾％。本發(fā)明中也提供實(shí)施方式，其中脂質(zhì)分子包含一種或多種選自以下的脂質(zhì)：hedc、dodc、hedodc、dspe、dope、和dc-6-14。在另一個(gè)實(shí)施方式中，所述脂質(zhì)分子還包含s104。在某些實(shí)施方式中，藥物載體包含核酸。在其它實(shí)施方式中，所述核酸是能夠敲除星形細(xì)胞中hsp47mrna的表達(dá)的sirna。在另一方面，本發(fā)明提供促進(jìn)藥物輸送至靶細(xì)胞的化合物，其包含結(jié)構(gòu)(脂質(zhì))m-接頭-(定向分子)n，其中定向分子類(lèi)視黃醇或脂溶性維生素，其在靶細(xì)胞上具有特異性受體或活化/結(jié)合位點(diǎn)；其中m和n獨(dú)立地是0、1、2、或3；其中接頭包含聚乙二醇(peg)分子。在一個(gè)實(shí)施方式中，脂質(zhì)選自以下的一種或多種：dodc、hedodc、dspe、dope、和dc-6-14。在另一個(gè)實(shí)施方式中，類(lèi)視黃醇選自維生素a、維甲酸(retinoicacid)、維a酸(tretinoin)、阿達(dá)帕林、4-羥基(苯基)視黃酰胺(4-hpr)、棕櫚酸視黃酯、視黃醇、飽和維甲酸、和飽和的去甲基化的維甲酸。在本發(fā)明的另一實(shí)施方式中，脂溶性維生素是維生素d、維生素e、或維生素k。在另一個(gè)實(shí)施方式中，接頭選自雙酰胺-peg、三酰胺-peg、四酰胺-peg、lys-雙酰胺-peglys、lys-三酰胺-peg-lys、lys-四酰胺-peg-lys、lys-peg-lys、peg2000、peg1250、peg1000、peg750、peg550、peg-glu、glu、c6、gly3、和glunh。在本發(fā)明的另一實(shí)施方式中，選自dspe-peg-va、dspe-peg2000-glu-va、dspe-peg550-va、dope-va、dope-glu-va、dope-glu-nh-va、dope-gly3-va、dc-va、dc-6-va、和ar-6-va。附圖說(shuō)明圖1描述本發(fā)明的某些實(shí)施方式的敲除功效。這包括與dc-6-14脂復(fù)合物與hedc脂質(zhì)體對(duì)照的比較。圖2描述使用陽(yáng)離子脂質(zhì)的基因敲除的體外比較。圖3描述對(duì)用本發(fā)明的示例性hedodc脂質(zhì)體制劑的體內(nèi)基因表達(dá)的評(píng)價(jià)(*表示p<0.05)。圖4描述用實(shí)施例15的示例性hedc脂質(zhì)體制劑的體外基因表達(dá)的評(píng)價(jià)。誤差棒表示標(biāo)準(zhǔn)方差(n＝3)?；谧顑?yōu)滿足顯示了s形的劑量反應(yīng)曲線。從該曲線計(jì)算ec50值。這表明為11.8nm。圖5顯示了使用大鼠dmnq模型的體內(nèi)測(cè)量結(jié)果。減去從首次用于實(shí)驗(yàn)的組確定的背景gp46mrna水平之后，將所有測(cè)試組的值標(biāo)準(zhǔn)化至載體組的平均gp46mrna(表達(dá)為載體組的百分比)。處理后的平均gp46mrna水平顯示劑量依賴反應(yīng)并將曲線擬合成s形劑量反應(yīng)曲線。計(jì)算得ed50值為0.79mg/kg。圖6顯示了使用大鼠dmnc模型的體內(nèi)測(cè)量結(jié)果。減去從首次用于實(shí)驗(yàn)的組確定的背景gp46mrna水平之后，將所有測(cè)試組的值標(biāo)準(zhǔn)化至載體組的平均gp46mrna(表達(dá)為載體組的百分比)。通過(guò)定量rt-pcr測(cè)驗(yàn)確定mrpl19mrna水平。將gp46的mrna水平標(biāo)準(zhǔn)化至mrpl19水平。(***表示p<0.02。)圖7顯示了使用大鼠肺博來(lái)霉素模型的體內(nèi)測(cè)量結(jié)果。條形圖總結(jié)了各組的azan-染色的肺部分的纖維化(t.ashcroft)得分。使用prism5軟件的單因素anova、bonferroni多對(duì)比測(cè)試進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。圖8通過(guò)裝飾添加va-偶聯(lián)物至脂質(zhì)體增強(qiáng)了sirna的活性。圖9通過(guò)共溶(co-solubilization)添加va-偶聯(lián)物至脂質(zhì)體增強(qiáng)了sirna的活性。圖10通過(guò)共溶添加va-偶聯(lián)物至脂質(zhì)體增強(qiáng)了sirna的活性。圖11通過(guò)共溶添加va-偶聯(lián)物至脂復(fù)合物增強(qiáng)了sirna的活性。圖12通過(guò)共溶添加va-偶聯(lián)物至脂復(fù)合物與通過(guò)裝飾比。圖13小鼠ccl4模型的體內(nèi)功效。圖14裝飾的與共溶的類(lèi)視黃醇偶聯(lián)物的體內(nèi)功效相比。圖15體外功效(phsc)，脂質(zhì)體制劑中的類(lèi)視黃醇偶聯(lián)物的作用。圖16顯示了類(lèi)視黃醇偶聯(lián)物含量(mol％)與體內(nèi)(大鼠dmnq)功效的關(guān)系。用包含0.75mg/kg的sirna劑量的0、0.25、0.5、1、和2％的diva的制劑或pbs(載體)靜脈注射的雄性sprague-dawley大鼠，在最后一次注射dmn后一個(gè)小時(shí)。具體實(shí)施方式式i的化合物在本發(fā)明的范圍內(nèi)其中r1和r2獨(dú)立地選自c10至c18的烷基、c12至c18的烯基、和油基；其中r3和r4獨(dú)立地選自c1至c6烷基、和c2至c6鏈烷醇；其中x選自-ch2-、-s-、和-o-、或不存在；其中y選自-(ch2)n、-s(ch2)n、-o(ch2)n-、噻吩、-so2(ch2)n-、和酯，其中n＝1-4；其中a＝1-4；其中b＝1-4；其中c＝1-4；其中z是抗衡離子。本發(fā)明的化合物在本文中也指在已知為“陽(yáng)離子脂質(zhì)”的化合物的類(lèi)別中。陽(yáng)離子脂質(zhì)是包含至少一個(gè)脂質(zhì)結(jié)構(gòu)部分和與抗衡離子聯(lián)結(jié)的帶正電的氮的化合物?！爸|(zhì)”在本領(lǐng)域理解為由疏水性烷基或烯基結(jié)構(gòu)部分和羧酸或酯結(jié)構(gòu)部分組成。在此以前，據(jù)發(fā)現(xiàn)式i的化合物的氨基-烷基-羥基(-n-烷基-oh)結(jié)構(gòu)部分給予本發(fā)明的制劑之前用先前報(bào)道的陽(yáng)離子脂質(zhì)沒(méi)有見(jiàn)到的性質(zhì)。與不包含式i的化合物的制劑相比，包含式i的化合物的本發(fā)明的制劑產(chǎn)生優(yōu)異的蛋白表達(dá)減少。特別令人驚奇的是包含式i的化合物的本發(fā)明的制劑減少hsp47表達(dá)的能力。本發(fā)明的優(yōu)選的化合物包括其中r1和r2各自獨(dú)立地是c10-c30烷基的那些。在更優(yōu)選的實(shí)施方式中，r1和r2各自獨(dú)立地是c10-c20烷基。在甚至更優(yōu)選的實(shí)施方式中，r1和r2各自獨(dú)立地是c12-c18烷基。特別優(yōu)選的實(shí)施方式包括其中r1和r2各自獨(dú)立地是c13-c17烷基的那些。最優(yōu)選的是其中r1和r2各為c13烷基的那些化合物。在其它實(shí)施方式中，r1和r2各自獨(dú)立地是c10-c30烯基。在更優(yōu)選的實(shí)施方式中，r1和r2各自獨(dú)立地是c10-c20烯基。在仍另一實(shí)施方式中，r1和r2各自獨(dú)立地是c12-c18烯基。在還另一實(shí)施方式中，r1和r2各自獨(dú)立地是c13-c17烯基。本發(fā)明最優(yōu)選地化合物包括其中r1和r2各為c17烯基的那些。也對(duì)于式i的化合物，r3和r4獨(dú)立地選自c1至c6烷基。在優(yōu)選的實(shí)施方式中，r3和r4各自獨(dú)立地是c1-c3烷基。最優(yōu)選地，r3和r4各為甲基。在其它實(shí)施方式中，r3和r4中的至少一個(gè)是–ch2ch2oh。最優(yōu)選地是其中a＝b＝c＝1的那些式i的化合物。z可以是任何氮抗衡離子，如該術(shù)語(yǔ)在本領(lǐng)域易于理解地。優(yōu)選的氮抗衡離子包括鹵離子和甲磺酸根(so3ch3-)，氯離子和溴離子是特別優(yōu)選的。與其它前述的其中陽(yáng)離子脂質(zhì)的作用依賴于抗衡離子的陽(yáng)離子脂質(zhì)相比，令人驚奇地式i的化合物的效果表現(xiàn)出不與所選的抗衡離子相關(guān)聯(lián)。示例性的式i的化合物包括：本發(fā)明的范圍內(nèi)是促進(jìn)藥物輸送至靶細(xì)胞的化合物，其包含結(jié)構(gòu)(定向分子)m-接頭-(定向分子)n，其中定向分子類(lèi)視黃醇或脂溶性維生素，其在靶細(xì)胞上具有特異性受體或活化/結(jié)合位點(diǎn)；其中m和n獨(dú)立地是0、1、2、或3；其中接頭包含聚乙二醇(peg)分子或類(lèi)peg分子，并標(biāo)示為“式a”。本發(fā)明也提供促進(jìn)藥物輸送至靶細(xì)胞的化合物，其包含結(jié)構(gòu)(脂質(zhì))m-接頭-(定向分子)n，其中定向分子是類(lèi)視黃醇或脂溶性維生素，其在靶細(xì)胞上具有特異性受體或活化/結(jié)合位點(diǎn)；其中m和n獨(dú)立地是0、1、2、或3；其中接頭包含聚乙二醇(peg)分子、類(lèi)peg分子，并被標(biāo)示為“式b”。此前聚發(fā)現(xiàn)式a或式b的化合物給予本發(fā)明的制劑先前未見(jiàn)的性質(zhì)。包含式a或式b的化合物的本發(fā)明的制劑，與不含這些化合物的制劑相比，產(chǎn)生優(yōu)異的基因表達(dá)減少。特別令人驚奇的是包含式a的化合物的本發(fā)明的制劑能夠減少hsp47的表達(dá)。在某些優(yōu)選的實(shí)施方式中，類(lèi)視黃醇選自維生素a、維甲酸(retinoicacid)、維a酸(tretinoin)、阿達(dá)帕林、4-羥基(苯基)視黃酰胺(4-hpr)、棕櫚酸視黃酯、視黃醇、飽和維甲酸、和飽和的去甲基化的維甲酸。優(yōu)選的實(shí)施方式包含化合物，其中接頭選自雙酰胺-peg、三酰胺-peg、四酰胺-peg、lys-雙酰胺-peglys、lys-三酰胺-peg-lys、lys-四酰胺-peg-lys、lys-peg-lys、peg2000、peg1250、peg1000、peg750、peg550、peg-glu、glu、c6、gly3、和glunh。在其它實(shí)施方式中，peg是單分散的。另一實(shí)施方式提供化合物，其中式a選自類(lèi)視黃醇-peg-類(lèi)視黃醇、(類(lèi)視黃醇)2-peg-(類(lèi)視黃醇)2、va-peg2000-va、(類(lèi)視黃醇)2-雙酰胺-peg-(類(lèi)視黃醇)2、(類(lèi)視黃醇)2-lys-雙酰胺-peg-lys-(類(lèi)視黃醇)2。在另一優(yōu)選的實(shí)施方式中，該化合物是結(jié)構(gòu)式其中q、r、和s各自獨(dú)立地是1、2、3、4、5、6、7、8、9、或10。在其它優(yōu)選的實(shí)施方式中，化合物的結(jié)構(gòu)式包含本發(fā)明的其它實(shí)施方式包含示于表1中的結(jié)構(gòu)表1包含結(jié)構(gòu)式i中的至少一種化合物和脂質(zhì)體的本發(fā)明的組合物還可包含一種或多種類(lèi)視黃醇偶聯(lián)物。在本發(fā)明優(yōu)選的實(shí)施方式中，基于組合物或制劑的總重量，類(lèi)視黃醇偶聯(lián)物將以約0.3至約30重量％的濃度存在，這相當(dāng)于約0.1至約10摩爾％，其相當(dāng)于約0.1至約10的摩爾比例。優(yōu)選地，類(lèi)視黃醇偶聯(lián)物是類(lèi)視黃醇-接頭-脂質(zhì)分子或類(lèi)視黃醇-接頭-類(lèi)視黃醇分子。類(lèi)視黃醇偶聯(lián)物的實(shí)例包括式ii的化合物的那些：其中q、r、和s各自獨(dú)立地是1、2、3、4、5、6、7、8、9、或10，及其對(duì)映異構(gòu)體或非對(duì)映異構(gòu)體。優(yōu)選的式ii的化合物包括其中q、r、和s各自獨(dú)立地是1、2、3、4、5、6，或7的那些。更優(yōu)選的是的其中q、r、和s各自獨(dú)立地是3、4、或5那些式ii的化合物。最優(yōu)選的是其中q是3、r是5、和s是3的那些式ii的化合物。式ii的化合物的一個(gè)實(shí)例是diva-peg-diva包含立構(gòu)中心，并且所有對(duì)映異構(gòu)體和非對(duì)映異構(gòu)體被認(rèn)為是在本發(fā)明的范圍之內(nèi)的。在本發(fā)明的組合物中(包括那些式i的陽(yáng)離子脂質(zhì)的)陽(yáng)離子脂質(zhì)的濃度，基于脂質(zhì)組合物的總重量，可從1至約80重量％。更優(yōu)選地，濃度是從1至約75重量％。甚至更優(yōu)選地，濃度是從約30至約75重量％。從約30至約75重量％的濃度對(duì)應(yīng)于至約30至60摩爾％和約30-60的摩爾比例。最優(yōu)選的是具有陽(yáng)離子脂質(zhì)濃度為約50重量％的那些組合物。含有可離子化陽(yáng)離子脂質(zhì)和季胺陽(yáng)離子脂質(zhì)的混合物的制劑中，優(yōu)選的mol％是從5％至45mol％，甚至更優(yōu)選的是大約20摩爾％的可離子化陽(yáng)離子脂質(zhì)和20摩爾％的式i的季胺陽(yáng)離子脂質(zhì)的混合物。此類(lèi)組合物也可包含水介質(zhì)。在這些實(shí)施方式中，包括式i的那些的陽(yáng)離子脂質(zhì)可以封裝的脂質(zhì)體中，并可能不易接近所述水介質(zhì)。另外，包括式i的那些的陽(yáng)離子脂質(zhì)可定位在脂質(zhì)體的外表面并易于接近水介質(zhì).包含至少一種結(jié)構(gòu)式i的化合物和脂質(zhì)體遺跡任選地例如結(jié)構(gòu)式ii的化合物的類(lèi)視黃醇偶聯(lián)物的本發(fā)明的組合物也可包含sirna。包含結(jié)構(gòu)式a或b化合物的至少一種和sirna的制劑也在本發(fā)明的范圍之內(nèi)。據(jù)想象，任何sirna分子可用在本發(fā)明的范圍之內(nèi)。所述sirna可包含編碼人hsp47的序列的mrna的反義序列，所述人hsp47的序列由seqidno:1示例，其顯示如下。例如，正義(5'->3')ggacaggccucuacaacuatt(seq.id.no.2)反義(3'->5')ttccuguccggagauguugau(seq.id.no.3).此類(lèi)組合物也可包含水介質(zhì)。優(yōu)選地，此類(lèi)組合物基本上由至少一種在電荷復(fù)合物中的結(jié)構(gòu)式i的化合物與sirna組成。包含結(jié)構(gòu)式i的化合物和sirna的此類(lèi)組合物可進(jìn)一步包含液體介質(zhì)。在一個(gè)實(shí)施方式中，所述液體介質(zhì)適用于注射進(jìn)入活的有機(jī)體。在本發(fā)明任何描述的實(shí)施方式的范圍之內(nèi)的液體介質(zhì)可以是水性的，即完全由水溶劑組成，并包含鹽、緩沖液和/或其它藥物賦形劑。在另一個(gè)實(shí)施方式中，該液體介質(zhì)可由水溶劑與例如有機(jī)溶劑的另一液體溶劑組合組成。在本發(fā)明任何描述的實(shí)施方式的范圍之內(nèi)的液體介質(zhì)也可包含至少一種有機(jī)溶劑。有機(jī)溶劑本質(zhì)上是本領(lǐng)域熟知的，并包括c1至c4醇、二甲基亞砜(“dmso”)等。包含水合至少一種有機(jī)溶劑的混合物的那些液體介質(zhì)也在在本發(fā)明任何描述的實(shí)施方式的范圍之內(nèi)。包含至少一種結(jié)構(gòu)式i的化合物和脂質(zhì)體的組合物也在本發(fā)明的范圍之內(nèi)。一些實(shí)施方式可包含式i的化合物和脂質(zhì)體的混合物。其它實(shí)施方式除了不在結(jié)構(gòu)式i的范圍內(nèi)的陽(yáng)離子脂質(zhì)可包含脂質(zhì)體和一種或多種式i的化合物。在一些實(shí)施方式中，將由脂質(zhì)體封裝sirna使得該sirna不易于接近水介質(zhì)。在其它實(shí)施方式中，將不用脂質(zhì)體封裝sirna。在此類(lèi)實(shí)施方式中，sirna可復(fù)合(complex)在脂質(zhì)體的外表面上。在這些實(shí)施方式中，sirna易于接近水介質(zhì)。其它實(shí)施方式包含星形細(xì)胞特異性藥物載體，其包括脂質(zhì)體合成物。所述脂質(zhì)體合成物包含脂質(zhì)分子雙層的脂質(zhì)囊泡。在某些實(shí)施方式中，在藥物載體到達(dá)星形細(xì)胞之前，優(yōu)選類(lèi)視黃醇分子至少部分地暴露于藥物載體的外部。本發(fā)明的某些實(shí)施方式提供脂質(zhì)分子，其包括一種或多種選自hedc、dodc、hedodc、dspe、dope、和dc-6-14的脂質(zhì)。在其它實(shí)施方式中，脂質(zhì)分子可進(jìn)一步包括s104。在一些實(shí)施方式中，將由脂質(zhì)體封裝sirna使得該sirna不易于接近水介質(zhì)。在其它實(shí)施方式中，將不用脂質(zhì)體封裝sirna。在此類(lèi)實(shí)施方式中，sirna可配位在脂質(zhì)體的外表面上。在這些實(shí)施方式中，sirna易于接近水介質(zhì)。其它實(shí)施方式包含星形細(xì)胞特異性藥物載體，其包括脂質(zhì)體合成物。所述脂質(zhì)體合成物包含脂質(zhì)分子雙層的脂質(zhì)囊泡。在其它實(shí)施方式中，在藥物載體到達(dá)星形細(xì)胞之前，類(lèi)視黃醇分子至少部分地暴露于藥物載體的外部。在某些優(yōu)選的實(shí)施方式中，類(lèi)視黃醇是脂質(zhì)分子的0.1摩爾％至20摩爾％。前述組合物也可包含本質(zhì)上是本領(lǐng)域熟知的peg-偶聯(lián)的脂質(zhì)，其包括peg-磷脂和peg-神經(jīng)酰胺，包括選自下列的一種或多種：peg2000-dspe、peg2000-dppe、peg2000-dmpe、peg2000-dope、peg1000-dspe、peg1000-dppe、peg1000-dmpe、peg1000-dope、peg550-dspe、peg550-dppe、peg-550dmpe、peg-1000dope、peg-膽固醇、peg2000-神經(jīng)酰胺、peg1000-神經(jīng)酰胺、peg750-神經(jīng)酰胺、和peg550-神經(jīng)酰胺。前述本發(fā)明的組合物可包含一種或多種磷脂，例如，1,2-二硬脂酰-sn-甘油基-3-磷酸膽堿(“dspc”)、二棕櫚酰卵磷脂(“dppc”)、1,2-二棕櫚酰-sn-甘油基-3-磷酸乙醇胺(“dppe”)、和1,2-二油?；?sn-甘油基-3-磷酸乙醇胺(“dope”)。優(yōu)選地，有益的磷脂是dope。例如，使用各種peg-脂質(zhì)制備在本發(fā)明的范圍內(nèi)的脂質(zhì)體，所述peg-脂質(zhì)使用本文描述的共溶方法加入。這些制劑包含陽(yáng)離子脂質(zhì)：dope:膽固醇:diva-peg-diva:peg-脂質(zhì)(50:10:38:5:2的摩爾比例)，并且各制劑在本文描述的使用200nm的濃度的人/大鼠hsp-47-csirna的phsc體外檢驗(yàn)中進(jìn)行測(cè)試。下表中顯示結(jié)果：peg-脂質(zhì)gp46基因敲除(％)標(biāo)準(zhǔn)方差未處理的05.6rnaimax對(duì)照50.07.9peg-bml95.51.7peg1000-dmpe93.20.8peg1000-dppe92.81.3peg1000-dspe93.50.8peg1000-dope90.72.5peg2000-神經(jīng)酰胺91.81.0peg2000-dmpe93.73.4peg2000-dppe91.11.4peg2000-dspe89.41.7前述本發(fā)明的組合物可包含一種或多種磷脂，例如，1,2-二硬脂酰-sn-甘油基-3-磷酸膽堿(“dspc”)、二棕櫚酰卵磷脂(“dppc”)、1,2-二棕櫚酰-sn-甘油基-3-磷酸乙醇胺(“dppe”)、和1,2-二油?；?sn-甘油基-3-磷酸乙醇胺(“dope”)。優(yōu)選地，有益脂質(zhì)是dope。除了式i的陽(yáng)離子脂質(zhì)，其它脂質(zhì)也可能有用。這些包括可離子化的陽(yáng)離子脂質(zhì)，其包括以下示出的s104。輸送制劑可由與可離子化的陽(yáng)離子脂質(zhì)組合的式i的陽(yáng)離子脂質(zhì)組成。可離子化的陽(yáng)離子脂質(zhì)可包含例如s104?？呻x子化的陽(yáng)離子脂質(zhì)可以0至45摩爾％的濃度存在，包括選自5、10、15、20、25、30、35、40、和45摩爾％的濃度。除了藥學(xué)上可接受的載體和稀釋劑外包含任何前述組合物的藥物制劑也在本發(fā)明的范圍之內(nèi)。本發(fā)明的藥物制劑包含至少一種治療劑。優(yōu)選地，該治療劑是sirna。據(jù)想象，在本發(fā)明的范圍之內(nèi)可使用任何sirna分子。除了藥學(xué)上可接受的載體和稀釋劑外包含任何前述組合物的藥物制劑也在本發(fā)明的范圍之內(nèi)。本發(fā)明的藥物制劑包含至少一種治療劑。優(yōu)選地，該治療劑是sirna。據(jù)想象，在本發(fā)明的范圍之內(nèi)可使用任何sirna分子。如前文描述地，sirna包括如seqidno:1、seqidno:2、seqidno:3、和seqidno:4所示的序列。在優(yōu)選的包含sirna的本發(fā)明的制劑中，sirna由脂質(zhì)體封裝。在其它實(shí)施方式中，所述sirna可在脂質(zhì)體之外。在那些實(shí)施方式中，sirna可定位于脂質(zhì)體的外部。陽(yáng)離子脂質(zhì):sirna(脂質(zhì)的氮比sirna的磷酸的比例，“n:p”)的有用范圍是0.2至5.0。對(duì)于本發(fā)明的組合物和制劑，n:p特別優(yōu)選的范圍是1.5至2.5。優(yōu)選的本發(fā)明的制劑包括包含如下的那些：hedc:s104:dope:膽固醇:peg-dmpe:diva-peg-diva(20:20:30:25:5:2的摩爾比例)和hedc:s104:dope:膽固醇:peg-dmpe:diva-peg-diva(20:20:30:25:5:2的摩爾比例)，其中diva-peg-diva是共溶的。dodc:dope:膽固醇:peg-脂質(zhì):diva-peg-diva(50:10:38:2:5的摩爾比例)和dodc:dope:膽固醇:peg-脂質(zhì):diva-peg-diva制劑，其中diva-peg-diva是共溶的。本發(fā)明的其它制劑包括包含hedodc:dope:膽固醇-peg-脂質(zhì):diva-peg-diva(50:10:38:2:5的摩爾比例)和hedodc:dope:膽固醇-peg-脂質(zhì):diva-peg-diva的那些制劑，其中diva-peg-diva是共溶的。其它優(yōu)選的本發(fā)明的制劑包括包含dc-6-14:dope:膽固醇:diva-peg-diva(40:30:30:5,摩爾比例)和dc-6-14:dope:膽固醇:diva-peg-diva的那些，其中diva-peg-diva是共溶的。輸送治療劑至患者的方法也在本發(fā)明的范圍之內(nèi)。這些方法包括提供包含任何前述組合物的藥物制劑和藥學(xué)上可接受的載體或稀釋劑；并將該藥物制劑給藥至患者。定義本文中使用的“烷基”指直鏈或支鏈的完全飽和的(沒(méi)有雙鍵或三鍵)烴基，例如，具有通式-cnh2n+1的基團(tuán)。所述烷基可具有1至50個(gè)碳原子(每當(dāng)其在本文中出現(xiàn)，例如“1至50”的數(shù)值范圍指在給定的范圍內(nèi)的各整數(shù)；例如，“1至50個(gè)碳原子”指該烷基可包含1個(gè)碳原子、2個(gè)碳原子、3個(gè)碳原子等，多至并包括50個(gè)碳原子，雖然該定義也涵蓋沒(méi)有標(biāo)明數(shù)值范圍的術(shù)語(yǔ)“烷基”)。所述烷基也可以是具有1至30個(gè)碳原子的中等尺寸的烷基。所述烷基也可以是具有1至5個(gè)碳原子的低級(jí)烷基。該化合物的烷基可標(biāo)示為“c1-c4烷基”或類(lèi)似的標(biāo)示。只是為了舉例，“c1-c4烷基”指烷基鏈中有1至4個(gè)碳原子，即該烷基鏈選自甲基、乙基、丙基、異丙基、正丁基、異丁基、仲丁基、和叔丁基。典型的烷基包括但不以任何方式限制為甲基、乙基、丙基、異丙基、丁基、異丁基、叔丁基、戊基、己基等。本文中使用的“烯基”指在直鏈或支鏈的烴鏈中含有一個(gè)或多個(gè)雙鍵的烷基。烯基可以是未取代的或取代的。當(dāng)取代時(shí)，除非另外指明，取代基可選自關(guān)于烷基取代上文公開(kāi)的相同的基團(tuán)。本文中使用的“炔基”指在直鏈或支鏈的烴鏈中含有一個(gè)或多個(gè)三鍵的烷基。炔基可以是未取代的或取代的。當(dāng)取代時(shí)，除非另外指明，取代基可選自關(guān)于烷基取代上文公開(kāi)的相同的基團(tuán)。本文中使用的“鹵”指f、cl、br、和i。本文中使用的“甲磺酸鹽”指–oso2ch3。本文中使用的術(shù)語(yǔ)“藥物制劑”指本文公開(kāi)的組合物與一種或多種其它化學(xué)成分的混合物，所述其它化學(xué)成分例如是稀釋劑或其它藥物載體。該藥物制劑促進(jìn)該組合物至有機(jī)體的給藥。本領(lǐng)域存在多種將藥物制劑給藥的技術(shù)，其包括但不限于注射和胃腸外給藥。本文中使用的術(shù)語(yǔ)“藥物載體”指促進(jìn)化合物進(jìn)入細(xì)胞或組織的化學(xué)化合物。例如二甲基亞砜(dmso)是普遍使用的載體，因?yàn)槠浯龠M(jìn)有機(jī)體的細(xì)胞或組織攝入許多有機(jī)化合物。本文中使用的術(shù)語(yǔ)“稀釋劑”指在將溶解目標(biāo)制劑(例如，可包含化合物、類(lèi)視黃醇、第二脂質(zhì)、穩(wěn)定劑、和/或治療劑的制劑)的水中稀釋的并使得該制劑的生活活性形式穩(wěn)定化的化學(xué)化合物。本領(lǐng)域?qū)⑷芙庥诰彌_溶液的鹽作為稀釋劑。普遍使用的一種緩沖溶液是磷酸鹽緩沖液，因?yàn)樗７铝巳搜旱柠}濃度。因?yàn)榫彌_鹽可以在低濃度控制溶液的ph，緩沖的稀釋劑很少改變制劑的生物活性。本文中使用的“賦形劑”指加入制劑中以非限制地給組合物提供體積、稠度、穩(wěn)定性、結(jié)合能力、潤(rùn)滑、分解能力等的惰性物質(zhì)。“稀釋劑”是一種賦形劑。本文中使用的“治療劑”指當(dāng)以治療有效量給藥至哺乳動(dòng)物時(shí)，對(duì)哺乳動(dòng)物提供益處的化合物。本文中的治療劑可指藥物。本領(lǐng)域技術(shù)人員將理解，術(shù)語(yǔ)“治療劑”不限于是獲得監(jiān)管機(jī)構(gòu)批準(zhǔn)的藥物。“治療劑”可與本文描述的化合物(類(lèi)視黃醇)和/或第二脂質(zhì)起作用地相關(guān)聯(lián)。例如，本文中描述的第二脂質(zhì)可形成脂質(zhì)體，例如如本文中描述地，治療劑可與脂質(zhì)體起作用地相關(guān)聯(lián)。本文中使用的“脂復(fù)合物制劑”指那些制劑，其中sirna在脂質(zhì)體之外。在優(yōu)選的脂復(fù)合物制劑中，sirna與脂質(zhì)體的外表面復(fù)合。其它優(yōu)選的脂復(fù)合物制劑包括其中sirna易于接近存在于脂質(zhì)體外的任何介質(zhì)的那些。本文中使用的“脂質(zhì)體制劑”其中將sirna封裝在脂質(zhì)體內(nèi)的那些制劑。在優(yōu)選的脂質(zhì)體制劑中，sirna不易于接近存在于脂質(zhì)體外的任何介質(zhì)。本文中使用的術(shù)語(yǔ)“共溶”指在形成空的囊泡之前，向陽(yáng)離子脂質(zhì)混合物中添加成分。本文中使用的術(shù)語(yǔ)“裝飾”指在囊泡形成之后添加成分。本文中使用的“dc-6-14”指以下陽(yáng)離子脂質(zhì)化合物：本文中使用的“dodc”指以下陽(yáng)離子脂質(zhì)化合物：本文中使用的“hedodc”指以下陽(yáng)離子脂質(zhì)化合物：本文中使用的“類(lèi)視黃醇”由四個(gè)以頭尾的方式相接的類(lèi)異戊二烯單元組成的化合物類(lèi)別的成員，參見(jiàn)g.p.moss,“biochemicalnomenclatureandrelateddocuments,”第二版，portlandpress，第247-251頁(yè)(1992)。對(duì)于展示出有質(zhì)量的視黃醇生物活性的類(lèi)視黃醇，“維生素a”是通用的描述。本文中使用的類(lèi)視黃醇指天然的或合成的類(lèi)視黃醇，其包括第一代、第二代、和第三代類(lèi)視黃醇。天然存在的類(lèi)視黃醇的實(shí)例包括但不限于(1)11-順視黃醇、(2)全反式視黃醇、(3)棕櫚酸視黃酯、(4)全反式維甲酸、和(5)13-順維甲酸。此外，術(shù)語(yǔ)“類(lèi)視黃醇”包括視黃醇、視黃醛、維甲酸、rexinoid、去甲基化的和/或飽和的維甲酸、及其衍生物。本文中使用的“類(lèi)視黃醇偶聯(lián)物”指包含至少一個(gè)類(lèi)視黃醇結(jié)構(gòu)部分的分子。本文中使用的“類(lèi)視黃醇-接頭-脂質(zhì)分子”指包含至少一個(gè)類(lèi)視黃醇結(jié)構(gòu)部分的分子，所述類(lèi)視黃醇結(jié)構(gòu)部分通過(guò)至少一個(gè)接頭(例如peg結(jié)構(gòu)部分)連接至至少一個(gè)脂質(zhì)結(jié)構(gòu)部分。本文中使用的“類(lèi)視黃醇接頭-類(lèi)視黃醇分子”指包含至少一個(gè)類(lèi)視黃醇結(jié)構(gòu)部分的分子，所述類(lèi)視黃醇結(jié)構(gòu)部分通過(guò)至少一個(gè)接頭(例如peg結(jié)構(gòu)部分)連接至至少一個(gè)(可以相同或不同的)其它類(lèi)視黃醇結(jié)構(gòu)部分。本文中使用的“維生素d”具有抗佝僂病活性的維生素的通用的描述。維生素d組包含：維生素d2(鈣化醇)、維生素d3(輻照的22-二氫麥角甾醇)、維生素d4(輻照的脫氫谷甾醇)和維生素d5(輻照的脫氫谷甾醇)。本文中使用的“維生素e”具有抗氧化劑活性的分子組的通用的描述。維生素e家族包含α-生育酚、β-生育酚、γ-生育酚和δ-生育酚，α-生育酚是最普遍的。(brigelius-floheandtraber,thefasebjournal.1999；13:1145-1155)。本文中使用的“維生素k”是止血因子的通用的描述，并包含維生素k1(植物胨二酮(phytonodione))、維生素k2(甲基萘醌類(lèi))、維生素k3、維生素k4和維生素k5。維生素k1和k2是天然的，但k3-5是合成的。本文中使用的“類(lèi)視黃醇-接頭-脂質(zhì)分子”指包含至少一個(gè)類(lèi)視黃醇結(jié)構(gòu)部分的分子，所述類(lèi)視黃醇結(jié)構(gòu)部分通過(guò)至少一個(gè)接頭(例如peg結(jié)構(gòu)部分)連接至至少一個(gè)脂質(zhì)結(jié)構(gòu)部分。本文中使用的“類(lèi)視黃醇接頭-類(lèi)視黃醇分子”指包含至少一個(gè)類(lèi)視黃醇結(jié)構(gòu)部分的分子，所述類(lèi)視黃醇結(jié)構(gòu)部分通過(guò)至少一個(gè)接頭(例如peg結(jié)構(gòu)部分)連接至至少一個(gè)(可相同或不同的)其它類(lèi)視黃醇結(jié)構(gòu)部分。本文中使用的術(shù)語(yǔ)“脂質(zhì)”和“親脂的”以本領(lǐng)域技術(shù)人員理解的其通常含義用在本文中。脂質(zhì)和親脂基團(tuán)的非限制性實(shí)例包括脂肪酸、固醇、c2-c50烷基、c2-c50雜烷基、c2-c50烯基、c2-c50雜烯基、c5-c50芳基、c5-c50雜芳基、c2-c50炔基、c2-c50雜炔基、c2-c50羧基烯基、和c2-c50羧基雜烯基。脂肪酸是飽和的或不飽和的長(zhǎng)鏈單羧酸，其包含例如，12至24個(gè)碳原子。脂質(zhì)的特征是基本上可水溶的，在水中的溶解性小于約0.01％(重量基礎(chǔ))。本文中使用的術(shù)語(yǔ)“脂質(zhì)結(jié)構(gòu)部分”和“親脂的結(jié)構(gòu)部分”指已連接至另一基團(tuán)的脂質(zhì)或其部分。例如，脂質(zhì)基團(tuán)可能通過(guò)脂質(zhì)的官能團(tuán)(例如羧酸基團(tuán))與單體的合適的官能團(tuán)之間的化學(xué)反應(yīng)而連至另一化合物(例如單體)。本文中使用的“sirna”指小的干擾rna，在本領(lǐng)域也已知為短的干擾rna或沉默rna。sirna是一類(lèi)雙鏈rna分子，在本領(lǐng)域已知其具有各種作用，最顯著的是干擾特定基因的表達(dá)和蛋白表達(dá)。本文中使用的“由脂質(zhì)體封裝”指成分基本上或全部在脂質(zhì)體結(jié)構(gòu)中。本文中使用的“易于接近水介質(zhì)”指能夠與水介質(zhì)接觸的成分。本文中使用的“不易于接近水介質(zhì)”指不能夠與水介質(zhì)接觸的成分。本文中使用的“復(fù)合在脂質(zhì)體的外表面”指與脂質(zhì)體的外表面起作用地相關(guān)聯(lián)的成分。本文中使用的“定位于脂質(zhì)體的外表面”指在或接近脂質(zhì)體的外表面的成分。本文中使用的“電荷復(fù)合的”指靜電結(jié)合。本文中使用的術(shù)語(yǔ)“起作用地相關(guān)聯(lián)”指本文描述的化合物、治療劑、類(lèi)視黃醇、和/或第二脂質(zhì)之間的靜電相互作用。此類(lèi)相互作用可以是化學(xué)鍵的形式，包括但不限于共價(jià)鍵、極性共價(jià)鍵、離子鍵、靜電作用、配位共價(jià)鍵、芳香族鍵、氫鍵、偶極、或范德華相互作用。那些本領(lǐng)域普通技術(shù)人員能夠理解此類(lèi)相互作用的相對(duì)強(qiáng)度可能大范圍地不同。本文中以本領(lǐng)域技術(shù)人員理解的其通常含義使用術(shù)語(yǔ)“脂質(zhì)體”，并意指包含連接至極性的親水性基團(tuán)的脂質(zhì)的脂質(zhì)雙層結(jié)構(gòu)，所述極性的親水性基團(tuán)在水性介質(zhì)中形成基本上閉合的結(jié)構(gòu)。在一些實(shí)施方式中，脂質(zhì)體可與一種或多種化合物起作用地相關(guān)聯(lián)，所述化合物例如是治療劑和類(lèi)視黃醇或類(lèi)視黃醇偶聯(lián)物。脂質(zhì)體可能由單脂質(zhì)雙層(即，單層狀的)組成或其可由兩個(gè)或多個(gè)同一中心的脂質(zhì)雙層(即，多層狀的)組成。另外，脂質(zhì)體在形狀上可以大致是球形或橢圓體形。術(shù)語(yǔ)“促進(jìn)藥物輸送至靶細(xì)胞上”指本發(fā)明的類(lèi)視黃醇或脂溶性維生素化合物的增強(qiáng)的能力，以增強(qiáng)治療分子例如sirna至細(xì)胞的輸送。并不意在受理論限制，類(lèi)視黃醇或脂溶性維生素化合物以可測(cè)量的特異性與靶細(xì)胞上的特異性受體或(活化/結(jié)合位點(diǎn))相互作用。例如，當(dāng)結(jié)合親和性(ka)為106m-1或更大，優(yōu)選地是107m-1或更大，更優(yōu)選地108m-1或更大，和最優(yōu)選地109m-1或更大時(shí)，通?？紤]結(jié)合是特異性的。例如，通過(guò)斯卡查德分析(scatchard,ann.nyacad.sci.51:660,1949)，本領(lǐng)域普通技術(shù)人員可容易地確定抗體的結(jié)合親和性。核酸輸送系統(tǒng)可包括，例如，水性的和非水性的膠、乳油、復(fù)乳、微乳、脂質(zhì)體、軟膏、水性的和非水性的溶液、洗劑、氣溶膠、烴基和粉末，并可含有賦形劑，例如增溶劑、滲透增強(qiáng)劑(例如，脂肪酸、脂肪酸酯、脂肪醇和氨基酸)，和親水性聚合物(例如，卡波(polycarbophil)和聚乙烯吡咯烷酮)。除了結(jié)構(gòu)式i的陽(yáng)離子脂質(zhì)，其它脂質(zhì)可能是有用的。這些包括可離子化的陽(yáng)離子脂質(zhì)，其包括輸送制劑可由與可離子化的陽(yáng)離子脂質(zhì)組合的結(jié)構(gòu)式i的陽(yáng)離子脂質(zhì)組成?？呻x子化的陽(yáng)離子脂質(zhì)可包含例如s104?？呻x子化的陽(yáng)離子脂質(zhì)可以0至45摩爾％的濃度存在，包含選自5、10、15、20、25、30、35、40、和45摩爾％的濃度。偶聯(lián)至聚乙二醇(peg)分子的脂質(zhì)可存在于脂質(zhì)體顆粒中。peg-脂質(zhì)包括：1,2-二肉豆蔻油?；?二肉豆蔻油?；?-sn-甘油基-3-磷乙醇胺-n-peg(peg-dmpe)1,2-二棕櫚酰-sn-甘油基-3-磷乙醇胺-n-peg(peg-dppe)，1,2-二硬脂酰-sn-甘油基-3-磷乙醇胺-n-peg(peg-dspe)，或1,2-二油酰基-sn-甘油基-3-磷乙醇胺-n-peg(peg-dope)和/或peg-神經(jīng)酰胺。輸送制劑可由式i的陽(yáng)離子脂質(zhì)與peg-脂質(zhì)組合組成。peg-脂質(zhì)可以如下濃度存在：0至15摩爾％，優(yōu)選地1至10摩爾％，包括選自1、2、3、4、5、6、7、8、9和10摩爾％的濃度。非陽(yáng)離子脂質(zhì)的非限制性實(shí)例包括磷脂，例如卵磷脂、磷脂酰基乙醇胺、溶血卵磷脂、溶血磷脂?；掖及?、磷脂?；z氨酸、磷脂?；〈?、神經(jīng)磷脂、蛋神經(jīng)磷脂(esm)、腦磷脂、心磷脂、磷脂酸、腦苷脂、雙十六烷基磷酸酯、二硬脂酰卵磷脂(dspc)、二油酰基卵磷脂(dopc)、二棕櫚酰卵磷脂(dppc)、二油?；字；视?dopg)、二棕櫚酰磷脂?；视?dppg)、二油?；字；掖及?dope)、棕櫚酰基油?；?卵磷脂(popc)、棕櫚酰基油?；?磷脂酰基乙醇胺(pope)、棕櫚?；王；?磷脂?；视?popg)、二油?；字；掖及?-(n-馬來(lái)酰亞胺甲基)-環(huán)己烷-1-羧酸酯(dope-mal)、二棕櫚酰-磷脂酰基乙醇胺(dppe)、二肉豆蔻酰基-磷脂?；掖及?dmpe)、二硬脂酰-磷脂?；掖及?dspe)、單甲基-磷脂?；掖及?、二甲基-磷脂?；掖及?、二反油酸?；?磷脂?；掖及?depe)、硬脂?；王；?磷脂?；掖及?sope)、溶血磷脂?；憠A、二亞油酰基磷脂?；憠A、及其混合物。也可使用其它二?；蚜字投；字；掖及妨字?。在這些脂質(zhì)中的?；鶅?yōu)選地是衍生自具有c10-c24碳鏈的脂肪酸的?；?，例如，月桂?；⑷舛罐Ⅴ；?、棕櫚酰基、硬脂?；?、或油酰基。在某些實(shí)施方式中，磷脂在顆粒中存在的量包括從約0摩爾％至約55摩爾％，更具體地以選自5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、和55％的濃度。作為非限制性實(shí)例，所述磷脂是dope。非陽(yáng)離子脂質(zhì)的附加實(shí)例包括固醇，例如膽固醇及其衍生物例如膽甾烷酮、膽甾烯酮、糞甾醇、膽甾烯基-2'-羥乙基醚、膽甾烯基-4'-羥基丁基醚、及其混合物。在某些實(shí)施方式中，在顆粒中存在的膽固醇或膽固醇衍生物的量包括從約0摩爾％至約55摩爾％，更具體地是選自5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、和55摩爾％的濃度。作為非限制性實(shí)例，膽固醇存在于脂質(zhì)顆粒中。在某些其它實(shí)施方式中，存在于包含磷脂和膽固醇混合物的脂質(zhì)顆粒中的膽固醇構(gòu)成顆粒中存在的總脂質(zhì)的約30摩爾％至約40摩爾％、約30摩爾％至約35摩爾％、或從約35摩爾％至約40摩爾％。作為非限制性實(shí)例，包含磷脂和膽固醇的混合物的顆?？砂w粒中存在的總脂質(zhì)的約34摩爾％的膽固醇。在進(jìn)一步的實(shí)施方式中，存在于包含磷脂和膽固醇混合物的脂質(zhì)顆粒中的膽固醇構(gòu)成顆粒中存在的總脂質(zhì)的約10摩爾％至約30摩爾％、從約15摩爾％至約25摩爾％、或從約17摩爾％至約23摩爾％。作為非限制性實(shí)例，包含磷脂和膽固醇的混合物的顆?？砂w粒中存在的總脂質(zhì)的約20摩爾％的膽固醇。對(duì)于輸送核酸有用的類(lèi)視黃醇或類(lèi)視黃醇偶聯(lián)物處于該狀態(tài)：它溶解于可溶解或保留其的介質(zhì)中，或與該介質(zhì)混合。任何類(lèi)視黃醇或類(lèi)視黃醇偶聯(lián)物可用于本發(fā)明中，只要其是被星形細(xì)胞積極地積累的；類(lèi)視黃醇的實(shí)例包括但不限于維甲酸、阿達(dá)帕林、棕櫚酸視黃醇酯，和特別地維生素a、飽和的維生素a、維甲酸、和視黃醇。類(lèi)視黃醇-偶聯(lián)物的實(shí)例包括peg-類(lèi)視黃醇偶聯(lián)物。本發(fā)明利用星形細(xì)胞的性質(zhì)以積極地嵌入類(lèi)視黃醇和/或類(lèi)視黃醇偶聯(lián)物，和通過(guò)使用類(lèi)視黃醇和/或類(lèi)視黃醇偶聯(lián)物作為藥物載體或通過(guò)結(jié)合至或包含在另一藥物載體成分中，將所需的材料或體特異性地輸送至星形細(xì)胞。類(lèi)視黃醇是具有其中四個(gè)類(lèi)異戊二烯單元以頭尾方式相接的骨架的化合物類(lèi)別的成員。參見(jiàn)g.p.moss,“biochemicalnomenclatureandrelateddocuments”，第二版，portlandpress，第247-251頁(yè)(1992)。維生素a是有質(zhì)量地顯示視黃醇的生物活性的類(lèi)視黃醇的通用的描述。在本說(shuō)明書(shū)中的所述類(lèi)視黃醇促進(jìn)特定物質(zhì)至癌細(xì)胞和caf(即，所述物質(zhì)靶向這些細(xì)胞)的輸送。此種類(lèi)視黃醇不是具體限制的，其實(shí)例包括視黃醇、維生素a、飽和的維生素a、視黃醇、維甲酸、視黃醇和脂肪酸的酯、脂肪醇和維甲酸的酯、阿維a酯、維甲酸、異維甲酸、阿達(dá)帕林、阿維a(acitretine)、他扎羅汀、和棕櫚酸視黃醇酯，以及維生素a的類(lèi)似物，例如芬維a胺、和貝沙羅汀。類(lèi)視黃醇-偶聯(lián)物包括peg-偶聯(lián)物，例如，二va-peg-二va和va-peg-va。因此本發(fā)明的藥物載體可包含除了類(lèi)視黃醇和/或類(lèi)視黃醇-偶聯(lián)物之外的藥物載體成分。此類(lèi)成分不是特定限制的，可以使用醫(yī)藥和藥物領(lǐng)域已知的任何成分，但優(yōu)選其能夠包含類(lèi)視黃醇和/或類(lèi)視黃醇偶聯(lián)物。此外，本發(fā)明的藥物載體可包含改善進(jìn)入星形細(xì)胞的物質(zhì)，例如視黃醇-結(jié)合蛋白(rbp)。類(lèi)視黃醇和/或類(lèi)視黃醇偶聯(lián)物與本發(fā)明的藥物載體的結(jié)合或包含也可通過(guò)將類(lèi)視黃醇和/或類(lèi)視黃醇偶聯(lián)物與另一藥物載體成分通過(guò)化學(xué)和/或方法結(jié)合或包含來(lái)進(jìn)行?？蛇x地，類(lèi)視黃醇和/或類(lèi)視黃醇偶聯(lián)物與本發(fā)明的藥物載體的結(jié)合或包含也可通過(guò)在藥物載體制備期間，將具有形成親和性(formation-affinity)的類(lèi)視黃醇和/或類(lèi)視黃醇偶聯(lián)物混合入藥物載體成分來(lái)進(jìn)行。結(jié)合至本發(fā)明的藥物載體的或本發(fā)明的藥物載體中包含的類(lèi)視黃醇和/或類(lèi)視黃醇偶聯(lián)物的量，相對(duì)于藥物載體成分的重量比例可以是0.1摩爾％至20摩爾％，優(yōu)選地0.2％至10％，和更優(yōu)選地0.5％至5摩爾％，包括選自值0.25、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0、4.5和5.0摩爾％的濃度。在某些實(shí)施方式中，本發(fā)明提供通過(guò)在室內(nèi)混合來(lái)生產(chǎn)脂質(zhì)體。這包括方法：在第一貯藏庫(kù)中提供包含核酸(例如干擾rna)的水性溶液、在第二貯藏庫(kù)中提供有機(jī)脂質(zhì)溶液、并將所述水性溶液和所述有機(jī)脂質(zhì)溶液混合，使得所述有機(jī)脂質(zhì)溶液與所述水性溶液混合以生產(chǎn)在有機(jī)溶劑梯度中封裝核酸(例如，sirna)的脂質(zhì)體。使用混合方法形成的脂質(zhì)體典型地具有從約40nm至約250nm、從約50nm至約150nm、從約60nm至約150nm的尺寸。由此形成的顆粒不聚集，并任選地控制尺寸以實(shí)現(xiàn)均一的粒度。本發(fā)明的藥物載體可以是任何形式，只要可將所需的材料或體運(yùn)送至靶星形細(xì)胞，形式的實(shí)例包括但不限于聚合物膠束、脂質(zhì)體、乳液、微球體和納米球體。此外，本發(fā)明的藥物載體可在其內(nèi)部包含待輸送的物質(zhì)、連接至待輸送的物質(zhì)外表、或與待輸送的物質(zhì)混合，只要在該制劑最后到達(dá)星形細(xì)胞之前，其中包含的類(lèi)視黃醇和/或類(lèi)視黃醇偶聯(lián)物至少是部分地暴露于制劑的外表。本發(fā)明的藥物載體特異性地定向星形細(xì)胞并產(chǎn)生令人期待的效果，例如，通過(guò)有效運(yùn)輸至星形細(xì)胞所需材料或體(例如控制星形細(xì)胞的活性或生長(zhǎng)的藥物)，展現(xiàn)出最大效果以及最小副作用的對(duì)纖維化的抑制或預(yù)防。本發(fā)明的藥物載體輸送的材料或體不是特別地限制的，但它優(yōu)選地使得能夠在活體內(nèi)進(jìn)行從給藥位置到星形細(xì)胞存在的肝、胰等的物理運(yùn)動(dòng)的尺寸。因此本發(fā)明的藥物載體不僅能運(yùn)送材料(例如原子、分子、化合物、蛋白、或核酸)而且能運(yùn)送體(例如載體、病毒顆粒、細(xì)胞、一種或多種元素構(gòu)成的藥物釋放系統(tǒng)、或微型裝置(micromachine))。材料或體優(yōu)選地具有在星形細(xì)胞上施加一些作用的性質(zhì)，其實(shí)例包括標(biāo)記星形細(xì)胞的一個(gè)實(shí)例和控制星形細(xì)胞的活性或生長(zhǎng)的一個(gè)實(shí)例。因此，在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方式中，它是控制星形細(xì)胞的活性或生長(zhǎng)的藥物載體輸送的藥物。這可以是直接或間接地抑制參與增進(jìn)纖維化的星形細(xì)胞的物理化學(xué)作用的任何藥物，其實(shí)例包括但不限于tgfβ活性抑制劑(例如截短的tgfβii類(lèi)受體和可溶的tgfβii類(lèi)受體)、生長(zhǎng)因子制劑(例如hgf及其表達(dá)載體)、mmp生產(chǎn)啟動(dòng)子(例如含mmp基因的腺病毒載體)、timp生產(chǎn)抑制劑(例如反義timp核酸)、pparγ配體、細(xì)胞活化抑制劑和/或細(xì)胞生長(zhǎng)抑制劑例如血管緊張素活性抑制劑、apdgf活性抑制劑、鈉通道抑制劑，和程序性細(xì)胞死亡誘導(dǎo)劑例如化合物861和膠霉素、脂連蛋白和具有rho激酶抑制活性的化合物例如(+)-順-4-(1-氨基乙基)-1-(4-吡啶基氨甲酰基)環(huán)己烷。此外，在本說(shuō)明書(shū)中用于控制星形細(xì)胞的活性或生長(zhǎng)的藥物可以是直接或間接地促進(jìn)(直接或間接地參與抑制纖維化的)星形細(xì)胞的物理化學(xué)作用的任何藥物，其實(shí)例包括但不限于促進(jìn)膠原降解系統(tǒng)的藥物，例如mmp生產(chǎn)促進(jìn)劑、例如mmp表達(dá)載體、hgf、和具有類(lèi)hgf活性的藥物(例如hgf類(lèi)似物和表達(dá)其的載體)。本說(shuō)明書(shū)中控制星形細(xì)胞的活性或生長(zhǎng)的藥物的其它實(shí)例包括用于控制例如膠原的細(xì)胞外基質(zhì)的新陳代謝的藥物，例如具有抑制目標(biāo)分子(例如sirna、核酶、和反義核酸(包括rna、dna、pna、及其復(fù)合物))表達(dá)作用的物質(zhì)，具有突出的副作用的物質(zhì)，以及表達(dá)相同物質(zhì)的載體，所述藥物定向例如由星形細(xì)胞生產(chǎn)的細(xì)胞外基質(zhì)要素分子或定向一種或多種具有生產(chǎn)或分泌細(xì)胞外基質(zhì)要素分子功能的分子。本發(fā)明也涉及治療星形細(xì)胞相關(guān)的病癥的藥物，所述藥物包含藥物載體和控制星形細(xì)胞的活性或生長(zhǎng)的藥物，還涉及藥物載體在生產(chǎn)治療星形細(xì)胞相關(guān)的病癥的藥物組合物中的用途。所述星形細(xì)胞相關(guān)的病癥在本文中指其中星形細(xì)胞直接或間接地參與病癥的過(guò)程的病癥，即病癥的發(fā)生、加劇、改善、減輕、康復(fù)等，其實(shí)例包括肝病癥，例如肝炎，特別是慢性肝炎、肝纖維化、肝硬化、和肝癌，和胰病癥，例如胰腺炎、特別是慢性胰腺炎、胰纖維化、和胰腺癌。在本發(fā)明的藥中，藥物載體可在其內(nèi)部包含藥物、可連接至含藥物物質(zhì)的外表面、或與藥物混合，只要在該制劑最后到達(dá)星形細(xì)胞之前，包含在藥物載體中的類(lèi)視黃醇和/或類(lèi)視黃醇偶聯(lián)物至少是部分地暴露于制劑的外表。因此，基于藥物釋放的給藥途徑或方式，可將藥物用適合的材料(例如隨時(shí)間崩解的腸溶衣或材料)覆蓋或?qū)⑺幬锛尤牒线m的藥物釋放系統(tǒng)中。因此本發(fā)明包含藥物載體和藥物制劑試劑盒，所述試劑盒包含一個(gè)或多個(gè)容器，所述容器包含藥物載體成分、類(lèi)視黃醇和/或類(lèi)視黃醇偶聯(lián)物、/或藥物中的一種或多種，并且包含以此試劑盒中的形式提供的藥物載體或藥物的必需成分。除了上述的那些，本發(fā)明的試劑盒可包含說(shuō)明書(shū)等，其中描述了制備方法或藥物載體和本發(fā)明的藥物的給藥。此外，本發(fā)明的試劑盒可包含完善本發(fā)明的藥物載體或藥物的所有成分，但無(wú)需必要包含所有成分。因此，本發(fā)明的試劑盒不需要包含在醫(yī)療場(chǎng)所通?？傻玫脑噭┗蛉軇?、實(shí)驗(yàn)器材等，例如，無(wú)菌水、鹽水或葡萄糖溶液。本發(fā)明還涉及治療星形細(xì)胞相關(guān)的病癥的方法，所述方法包括將有效量的藥物給藥至需要其的治療對(duì)象。這里有效量指抑制目標(biāo)病癥開(kāi)始、減輕其癥狀、或預(yù)防其發(fā)展的量，并優(yōu)選地是預(yù)防目標(biāo)病癥開(kāi)始或治愈目標(biāo)病癥的量。也優(yōu)選地不會(huì)引起超過(guò)給藥益處的不利效果的量。這個(gè)量可以如下恰當(dāng)?shù)卮_定：通過(guò)使用培養(yǎng)的細(xì)胞等的試管內(nèi)測(cè)試，或提供動(dòng)物模型(例如小鼠、大鼠、狗或豬)中的測(cè)試，并且此類(lèi)測(cè)試方法是本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的。在本發(fā)明的方法中，術(shù)語(yǔ)“治療對(duì)象”指任何活的個(gè)體，優(yōu)選地是動(dòng)物，更優(yōu)選地是哺乳動(dòng)物，和仍更優(yōu)選地是人個(gè)體。在本說(shuō)明書(shū)中，治療對(duì)象可以是健康的或受一些病癥影響的，在治療所意向的病癥的情況下，治療對(duì)象典型地指受該病癥影響的或有風(fēng)險(xiǎn)被影響的治療對(duì)象。此外，術(shù)語(yǔ)“治療”包括為治愈、暫時(shí)緩解、預(yù)防病癥等目的的所有類(lèi)型的醫(yī)學(xué)科接受的預(yù)防的和/或治療性干預(yù)。例如，當(dāng)所述病癥是肝纖維化時(shí)，術(shù)語(yǔ)“治療”包括為包括延遲或停止纖維化發(fā)展、損傷的消退或消失、預(yù)防纖維化的發(fā)生、或預(yù)防復(fù)發(fā)的各種目的，醫(yī)學(xué)可接受的干預(yù)。本說(shuō)明書(shū)也涉及使用藥物載體輸送藥物至星形細(xì)胞的方法。這個(gè)方法包括但不限于將待輸送的物質(zhì)支撐在藥物載體上的步驟，和將載有待輸送的所述物質(zhì)的藥物載體施用或加至含星形細(xì)胞的活體或培養(yǎng)基，例如，培養(yǎng)基。根據(jù)任何已知方法、本說(shuō)明書(shū)中描述的方法等，可恰當(dāng)?shù)赝瓿蛇@些步驟。這個(gè)輸送方法可與另一輸送方法組合，所述另一輸送方法例如，在其中星形細(xì)胞存在的器官是目標(biāo)的輸送方法等?？筛脑旌怂岱肿右詥为?dú)地或與其它療法組合，用于預(yù)防或治療纖維化(例如，肝、腎、腹膜、和肺)疾病、性狀、情況和/或病癥，和/或與細(xì)胞或組織中的hsp47水平關(guān)聯(lián)的或?qū)ζ溆蟹磻?yīng)的任何其它性狀、疾病、病癥或情況。核酸分子可包含用于給藥至受治療者的輸送載體(包括脂質(zhì)體)，載體(carrier)和稀釋劑及它們的鹽，和/或可以藥學(xué)上可接受的制劑存在。本發(fā)明的核酸分子可包含表3中顯示的序列。此類(lèi)核酸分子的實(shí)例基本上由表3中提供的序列組成。核酸分子可通過(guò)肺輸送給藥，例如通過(guò)吸入氣溶膠或由吸入裝置或霧化吸入器給藥的噴霧干燥的制劑，所述肺輸送提供快速局部吸收核酸分子進(jìn)入相關(guān)的肺組織中?？赏ㄟ^(guò)磨碎干的或凍干的核酸組合物，然后將微米化的組合物通過(guò)例如，400目篩以破碎或分離出大的結(jié)塊來(lái)制備包含可呼吸的微米化的核酸組合物干顆粒的固體微粒組合物。包含本發(fā)明的核酸組合物的固體微粒組合物任選地包含用以加速氣溶膠以及其它治療性化合物的形成的分散劑。合適的分散劑是乳糖，其可以任何合適的比例(例如1比1的重量比例)與核酸混合。液體顆粒的氣溶膠可包含本文公開(kāi)的核酸分子，其可通過(guò)任何合適的方法生產(chǎn)，例如用霧化吸入器(見(jiàn)例如，美國(guó)專(zhuān)利no.4,501,729)。霧化吸入器是可商購(gòu)的裝置，其通過(guò)加快壓縮的氣體(典型地空氣或氧氣)通過(guò)窄文丘里室口的方法或通過(guò)超聲振動(dòng)的方法將活性成分的溶液或懸浮液轉(zhuǎn)變?yōu)橹委熜詺馊苣z霧。用在霧化吸入器中的合適的制劑包含不高于制劑的40％重量比，優(yōu)選地低于20％重量比的量的液體載體中的活性成分。所述載體典型地是水或稀釋的含水乙醇溶液，優(yōu)選地通過(guò)加入例如氯化鈉或其它合適的鹽制成與體液等張。如果不是無(wú)菌地制備制劑，任選的添加劑包括防腐劑，例如，甲基羥基苯甲酸鹽、抗氧化劑、風(fēng)味劑、揮發(fā)油、緩沖劑和乳化劑和其它制劑表面活性劑。包含活性組合物和表面活性劑的固體顆粒的氣溶膠同樣地可用任何固體微粒氣溶膠生成器產(chǎn)生。用于將固體微粒治療劑給藥至受治療者的氣溶膠生成器產(chǎn)生如上解釋的可呼吸的顆粒，并產(chǎn)生以適合給藥人類(lèi)的速率的、包含預(yù)定測(cè)量劑量的治療性組合物的氣溶膠體積。固體微粒氣溶膠生成器的一個(gè)說(shuō)明性類(lèi)型是吹藥器。通過(guò)吹入法給藥的合適的制劑包括可通過(guò)吹藥器輸送的細(xì)細(xì)粉碎的粉末。在吹藥器中，將粉末(例如，其定量可有效實(shí)施本文的治療)裝在典型地由凝膠或塑料制成的膠囊或灌流器中，所述凝膠或塑料會(huì)刺破或原位打開(kāi)，粉末在吸入時(shí)或通過(guò)手動(dòng)操作的泵由吸通過(guò)裝置的空氣輸送。在吹藥器中使用的粉末單單由活性成分組成或由包含活性成分、合適的粉末稀釋劑(例如乳糖)、和任選的表面活性劑的粉末混合物組成。活性成分典型地包含0.1至100重量比的制劑。第二種氣溶膠生成器包含定量吸入器。定量吸入器是加壓的氣溶膠分配器，典型地在液化的推進(jìn)物中其包含活性成分的懸浮液或溶液。在使用期間，這些裝置通過(guò)改造以輸送定量體積的閥釋放制劑.以生產(chǎn)含有活性成分的細(xì)粒噴霧。適合的推進(jìn)物包括某些氯氟烴化合物，例如，二氯二氟甲烷、三氯氟甲烷、二氯四氟乙烷及其混合物。所述制劑可另外包含一種或多種共溶劑，例如，乙醇、乳化劑和氣體制劑表面活性劑，例如油酸或脫水山梨糖醇三油酸酯、抗氧化物和適合的調(diào)味劑。肺輸送的其它方法描述在例如，us20040037780、us6592904、us6582728、和us6565885中。wo08132723總地涉及氣溶膠輸送寡核苷酸，和具體地sirna，至呼吸系統(tǒng)。核酸分子可給藥至中樞神經(jīng)系統(tǒng)(cns)或外周神經(jīng)系統(tǒng)(pns)。實(shí)驗(yàn)證明neuron可有效體內(nèi)吸收核酸。參見(jiàn)例如，sommer等人，1998,antisensenuc.aciddrugdev.,8:75；epa等人，2000,antisensenuc.aciddrugdev.,10:469；broaddus等人，1998,j.neurosurg.,88:734；karle等人，1997,eur.j.pharmocol.,340:153；bannai等人，1998,brainresearch,784:304；rajakumar等人，1997,synapse,26:199；wu-pong等人，1999,biopharm,12:32；bannai等人，1998,brainres.protoc.,3:83；andsimantov等人，1996,neuroscience,74:39。因此核酸分子適合于輸送至在cns和/或pns中的細(xì)胞或被其吸收。由多種不同策略輸送核酸分子到cns?？墒褂玫闹羉ns的輸送的傳統(tǒng)方法包括但不限于鞘內(nèi)的和腦心室內(nèi)的(intracerebroventricular)給藥、導(dǎo)管和泵的植入、在受傷或損傷位置直接注射或灌注、注射入腦動(dòng)脈系統(tǒng)，或通過(guò)化學(xué)或滲透打開(kāi)血-腦屏障。其它方法可包括使用各種傳輸和載體系統(tǒng)，例如通過(guò)使用偶聯(lián)物和可生物降解的聚合物。此外，基因治療方法，例如描述在kaplitt等人，美國(guó)專(zhuān)利no.6,180,613和davidson，wo04/013280中，可用于在cns中表達(dá)核酸分子。核酸分子可與聚乙烯亞胺(例如，直鏈或支鏈的pei)和/或聚乙烯亞胺衍生物一起制劑或復(fù)合，包括例如接枝的pei，例如半乳糖pei、膽固醇pei、抗體衍生的pei、和聚乙二醇(peg)pei(peg-pei)及其衍生物(參見(jiàn)例如ogris等人，2001,aapapharmsci,3,1-11；furgeson等人，2003,bioconjugatechem.,14,840-847；kunath等人，2002,pharmres19:810-17；choi等人，2001,bull.koreanchem.soc.,22:46-52；bettinger等人，1999,bioconjugatechem.,10:558-561；peterson等人，2002,bioconjugatechem.13:845-54；erbacher等人，1999,jgenemed1:1-18；godbey等人，1999.,pnas,96:5177-81；godbey等人，1999,jcontrolledrelease,60:149-60；diebold等人，1999,jbiolchem,274:19087-94；thomas等人，2002,pnas,99,14640-45；和sagara，美國(guó)專(zhuān)利no.6,586,524)。核酸分子可包含生物聯(lián)接劑，例如如在vargeese等人，美國(guó)序號(hào)no.10/427,160；美國(guó)專(zhuān)利no.6,528,631；美國(guó)專(zhuān)利no.6,335,434；美國(guó)專(zhuān)利no.6,235,886；美國(guó)專(zhuān)利no.6,153,737；美國(guó)專(zhuān)利no.5,214,136；美國(guó)專(zhuān)利no.5,138,045中描述的核酸偶聯(lián)物。本文公開(kāi)的組合物、方法和試劑盒可包含表達(dá)載體，其包含以允許核酸分子表達(dá)的方式包含編碼至少一種本發(fā)明的核酸分子的核酸序列。將核酸分子或一種或多種能夠表達(dá)dsrna鏈的載體引進(jìn)細(xì)胞環(huán)境的方法將依賴于細(xì)胞類(lèi)型和其環(huán)境的補(bǔ)償。核酸分子或載體構(gòu)造可直接加進(jìn)細(xì)胞中(即，細(xì)胞內(nèi)地)；或胞外引入腔、胞間隙、引進(jìn)有機(jī)體的循環(huán)、口服引入或可通過(guò)將有機(jī)體或細(xì)胞在含dsrna的溶液中洗浴來(lái)加入。所述細(xì)胞優(yōu)選地是哺乳動(dòng)物細(xì)胞；更優(yōu)選地是人細(xì)胞。表達(dá)載體的核酸分子可包含正義區(qū)域和反義區(qū)域。反義區(qū)域可包含與編碼hsp47的rna或dna序列互補(bǔ)的序列，正義區(qū)域可包含與反義區(qū)域互補(bǔ)的序列。核酸分子可含有具有互補(bǔ)的正義和反義區(qū)域的兩個(gè)完全不同的鏈。所述核酸分子可包含具有互補(bǔ)的正義和反義區(qū)域的單鏈。與目標(biāo)rna分子相互作用的核酸分子和編碼目標(biāo)rna(例如，目標(biāo)rna分子在本文中提供genbank登錄號(hào)提及)的下調(diào)基因可從插入dna或rna載體的翻譯單元表達(dá)。重組載體可以是dna質(zhì)粒或病毒載體。表達(dá)核酸分子的病毒質(zhì)粒可以基于但不限于腺伴隨病毒、反轉(zhuǎn)錄病毒、腺病毒、或甲病毒屬構(gòu)造?？扇缟鲜龅剌斔湍軌虮磉_(dá)核酸分子的重組載體，并繼續(xù)留存在靶細(xì)胞上?？蛇x地，可使用病毒載體以提供核酸分子的瞬時(shí)表達(dá)。如必需此類(lèi)載體可以重復(fù)給藥。一旦表達(dá)，通過(guò)rna干擾(rnai)核酸分子結(jié)合并下調(diào)基因功能或表達(dá)。核酸分子表達(dá)載體的輸送可以是全身的，例如通過(guò)靜脈或肌下給藥，通過(guò)給藥至從受治療者外植而后重新引入該受治療者的靶細(xì)胞上，或通過(guò)任何將允許進(jìn)入所需的靶細(xì)胞上的其它方法。另一方面，本公開(kāi)涉及藥物制劑，其包含一種或多種生理上可接受的表面活性劑、藥物載體、稀釋劑、賦形劑、和懸浮劑、或其組合；以及本文公開(kāi)的制劑(例如，該制劑可包含化合物、類(lèi)視黃醇、第二脂質(zhì)、穩(wěn)定劑、和/或治療劑)。可接受的其它治療用的藥物載體或稀釋劑在制藥領(lǐng)域是眾所周知的，并描述在例如remington'spharmaceuticalsciences，第18版，mackpublishingco.,easton,pa(1990)中，將其全部?jī)?nèi)容通過(guò)援引插入于此。防腐劑、穩(wěn)定劑、染料等可提供在藥物制劑中。例如，苯甲酸鈉、抗壞血酸和對(duì)羥基苯甲酸酯可加作防腐劑。另外可使用抗氧化劑和懸浮劑。在各種實(shí)施方式中，乙醇、酯、硫酸化脂肪醇等可用作表面活性劑；蔗糖、葡萄糖、乳糖、淀粉、結(jié)晶的纖維素、甘露醇、輕質(zhì)無(wú)水硅酸鹽、鋁酸鎂、鋁酸正硅酸鎂、合成硅酸鋁、碳酸鈣、碳酸氫鈉、磷酸氫鈣、羧基甲基纖維素鈣等可用作賦形劑；椰子油、橄欖油、芝麻油、花生油、大豆可用作懸浮劑或潤(rùn)滑劑；作為例如纖維素或蔗糖的碳水化合物的衍生物的鄰苯二甲酸乙酸纖維素、或乙酸甲酯-甲基丙烯酸酯共聚物作為聚乙烯的衍生物可用作懸浮劑；和增塑劑例如鄰苯二甲酸酯等可以用作懸浮劑?？蓪⒈疚拿枋龅乃幬镏苿┙o藥至人患者本身，或在藥物制劑中，其中它們與其它活性成分(如在組合療法中)、或合適的藥物載體或賦形劑混合。本申請(qǐng)的化合物的制劑和給藥技術(shù)可在“remington’spharmaceuticalsciences,”mackpublishingco.,easton,pa，第18版，1990中找到。合適的給藥途徑可包括，例如胃腸外輸送，例如肌內(nèi)的、皮下的、靜脈的、髓內(nèi)注射，以及鞘內(nèi)的、直接心室內(nèi)的、腹膜的、鼻內(nèi)的、或眼內(nèi)注射。也可以緩釋或控釋劑型給藥所述制劑(例如，該制劑可包含化合物、類(lèi)視黃醇、第二脂質(zhì)、穩(wěn)定劑、和/或治療劑)達(dá)到以預(yù)定速率持久地和/或定時(shí)地、脈沖地給藥，所述緩釋或控釋劑型包括長(zhǎng)效注射劑、滲透泵等。此外，給藥途徑可以是局部或全身的。藥物制劑可以其自身已知的方式生產(chǎn)，例如，通過(guò)常規(guī)混合、溶解、造粒、制丸、研磨、乳化、膠封、包埋或壓片過(guò)程?？梢匀魏纬Ｒ?guī)方式配置藥物制劑，使用一種或多種生理上可接受的藥物載體，其包含促進(jìn)加工活性化合物成可制藥使用的制劑的賦形劑和助劑。合適的制劑依賴于選擇的給藥途徑。若合適和按本領(lǐng)域所理解的(例如在上述的remington’spharmaceuticalsciences中)可使用任何熟知的技術(shù)、藥物載體、和賦形劑?？蓪⒖勺⑸湮镏苽錇槌Ｒ?guī)形式，作為液體溶液或懸浮液、適于液體中的溶液或懸浮液的注射前的固體形式、或作為乳劑。合適的賦形劑是例如，水、鹽水、蔗糖、葡萄糖、葡萄糖(dextrose)、甘露醇、乳糖、卵磷脂、清蛋白、谷氨酸鈉、半胱氨酸鹽酸物等。另外，若需要，可注射的藥物制劑可包含少量無(wú)毒的輔助物質(zhì)，例如潤(rùn)濕劑、ph緩沖劑等。生理相容的緩沖液包括但不限于hanks’s溶液、ringer’s溶液、或生理鹽水。若需要，可使用增強(qiáng)吸收的制劑。胃腸外給藥(例如通過(guò)大丸注射(bolusinjection)或持續(xù)輸液)的藥物制劑，包括水溶形式的活性制劑(例如，該制劑可包含化合物、類(lèi)視黃醇、第二脂質(zhì)、穩(wěn)定劑、和/或治療劑)的水溶液。此外，活性化合物的混懸劑可制備為恰當(dāng)?shù)挠蜖钭⑸浠鞈覄?。水相注射懸浮液可包含增大懸浮液粘度的物質(zhì)，例如羧基甲基纖維素鈉、山梨醇、或葡聚糖。任選地，所述懸浮液也可包含合適的穩(wěn)定劑或增大化合物溶解度的藥劑使得能夠制備高濃縮的溶液。注射用制劑可以具有添加的防腐劑的單位劑型呈現(xiàn)，例如，在安瓿中或在多劑量容器中。制劑可使用此類(lèi)形式：在油相或水相載體中的混懸劑、溶液或乳劑，并可包含配方試劑(例如懸浮劑、穩(wěn)定劑和/或分散劑)?？蛇x地，活性成分在用前可以是用以與合適的載體(載體，例如，無(wú)菌的無(wú)致熱源的水)組合的粉末形式。除了前述的制劑，所述制劑也可配置成長(zhǎng)效制劑。此類(lèi)長(zhǎng)效制劑可通過(guò)肌下注射給藥。因此制劑(例如，可包含化合物、類(lèi)視黃醇、第二脂質(zhì)、穩(wěn)定劑、和/或治療劑的制劑)可與合適的聚合的或疏水的材料(例如在可接受的油中的乳劑)或離子交換樹(shù)脂一起配制，或作為微溶的衍生物，例如，微溶的鹽。本文的一些實(shí)施方式涉及輸送治療劑至細(xì)胞的方法。例如，一些實(shí)施方式涉及輸送例如sirna的治療劑至細(xì)胞的方法。根據(jù)本文描述的方法適合使用的細(xì)胞包括原核細(xì)胞、酵母或較高級(jí)的真核細(xì)胞，包括植物和動(dòng)物細(xì)胞(例如，哺乳動(dòng)物細(xì)胞)。在一些實(shí)施方式中，細(xì)胞可以是人纖維肉瘤細(xì)胞(例如，ht1080細(xì)胞系)。在其它實(shí)施方式中，細(xì)胞可以是癌細(xì)胞?？墒褂檬前┠Ｐ拖到y(tǒng)的細(xì)胞系，包括但不限于乳腺癌(mcf-7，mda-mb-438細(xì)胞系)、u87成膠質(zhì)細(xì)胞瘤細(xì)胞系、b16f0細(xì)胞(黑素瘤)、hela細(xì)胞(宮頸癌)、a549細(xì)胞(肺癌)，和大鼠腫瘤細(xì)胞系gh3和9l。在這些實(shí)施方式中，本文描述的制劑可用于轉(zhuǎn)染細(xì)胞。這些實(shí)施方式可包括讓細(xì)胞與包含治療劑的本文描述的制劑接觸，因而輸送治療劑至細(xì)胞。本文公開(kāi)的是治療由異常纖維化刻畫(huà)的情況的方法，其可包括將治療有效量的本文描述的制劑給藥。由異常纖維化刻畫(huà)的情況可包括癌癥和/或纖維性疾病?？捎杀疚拿枋龅闹苿┲委熁蚋纳频陌┌Y類(lèi)型包括但不限于肺癌、胰腺癌、乳腺癌、肝癌、胃癌、和結(jié)腸癌。在一個(gè)實(shí)施方式中，可治療或改善的癌癥是胰腺癌。在另一個(gè)實(shí)施方式中，可治療或改善的癌癥是肺癌。可由本文描述的制劑治療或改善的纖維性疾病的類(lèi)型包括但不限于肝纖維化、肝硬化、胰腺炎、胰纖維化、囊性纖維化、聲帶瘢痕、聲帶粘膜纖維化、喉纖維化、肺纖維化、特發(fā)性肺纖維化、囊性纖維化、骨髓纖維化、腹膜后纖維化、和生腎系統(tǒng)纖維化。在一個(gè)實(shí)施方式中，可以治療或改善的狀況是肝纖維化。本文描述的制劑或藥物組合物可以適合的方式給藥至受治療者。在其它中，給藥方法的非限制性實(shí)例包括(a)通過(guò)皮下地、腹膜內(nèi)地、靜脈內(nèi)地、肌內(nèi)地、皮內(nèi)地、眼眶內(nèi)地、囊內(nèi)地、脊柱內(nèi)地、胸骨內(nèi)地等注射給藥，包括輸液泵輸送；(b)局部給藥例如通過(guò)直接注射進(jìn)腎或心臟部位，例如長(zhǎng)效制劑植入；以及本領(lǐng)域技術(shù)人員認(rèn)為合適的以讓活性化合物與活組織接觸。適用于給藥的藥物組合物包括制劑(例如，該制劑可包含化合物、類(lèi)視黃醇、第二脂質(zhì)、穩(wěn)定劑、和/或治療劑)，其中包含有效達(dá)到預(yù)期目的的量的活性成分。要求作為劑量的本文中公開(kāi)的化合物的治療有效量將依賴于給藥途徑、動(dòng)物類(lèi)型(包括被治療的人)、和考慮中的特定動(dòng)物的物理特征?？芍贫▌┝恳赃_(dá)到合意的效果，但其將取決于本領(lǐng)域技術(shù)人員將認(rèn)識(shí)到的例如體重、飲食、同時(shí)進(jìn)行的藥物治療因素和其它因素。更具體地，治療有效量指有效預(yù)防、減輕或改善疾病癥狀或延長(zhǎng)被治療的受治療者存活的組合物的量。治療有效量的確定完全在本領(lǐng)域技術(shù)人員的能力范圍內(nèi)，特別是根據(jù)本文提供的詳細(xì)公開(kāi)內(nèi)容。如對(duì)本領(lǐng)域技術(shù)人員顯而易見(jiàn)地，給藥的有用的體內(nèi)劑量和給藥的具體模式將依賴于被治療的哺乳動(dòng)物物種的年齡、體重、所用的具體化合物、和使用這些化合物的具體用途而變化。由本領(lǐng)域技術(shù)人員使用常規(guī)藥理學(xué)方法來(lái)實(shí)現(xiàn)有效劑量水平的確定，即必需以達(dá)到合意的效果的劑量水平。典型地，產(chǎn)品的臨床應(yīng)用從低劑量水平開(kāi)始，劑量水平增大直到達(dá)到合意的效果。可選地，使用已有的藥理學(xué)方法，可接受的體外研究可用于確立有用的劑量和通過(guò)本發(fā)明的方法確定的組合物的給藥途徑。在非人動(dòng)物研究中，潛在產(chǎn)品的應(yīng)用從較高的劑量開(kāi)始，劑量水平降低直到不在達(dá)到合意的效果或不利副作用消失。根據(jù)所需的效果和治療的指征，劑量可廣泛地變化。典型地，劑量是約10微克/kg至約100mg/kg體重，優(yōu)選地約100微克/kg至約10mg/kg體重。可選地，如本領(lǐng)域技術(shù)人員理解地，劑量可以基于患者的表面積并計(jì)算。個(gè)體內(nèi)科醫(yī)生可考慮患者的情況選擇藥物組合物的確切制劑、給藥途徑和劑量。(參見(jiàn)例如，fingl等，1975,in“thepharmacologicalbasisoftherapeutics”，將其全部?jī)?nèi)容通過(guò)援引在此合并入本文，特別地引用第一章第1頁(yè))。典型地，給藥至患者的組合物的劑量范圍可以是患者體重的從約0.5至約1000mg/kg。按患者需要，在一天或多天的過(guò)程中，劑量可以是單一的或系列(兩個(gè)或更多個(gè))。在已在至少一些條件下確立的化合物的人劑量的情況下，劑量將大致相同，或劑量是已確立的人劑量的約0.1％至約500％，更優(yōu)選地約25％至約250％。當(dāng)未確立人劑量時(shí)，如新開(kāi)發(fā)的藥物組合物的情況下，合適的人劑量可從ed50或id50值、或體外或體內(nèi)研究所得的由動(dòng)物毒性研究和功效研究限定的其它適當(dāng)?shù)闹祦?lái)推斷。需注意因?yàn)槎拘曰蚱鞴俟δ苷系K主治醫(yī)師會(huì)知道如何和何時(shí)終止、中斷或調(diào)整給藥。相反地，如果臨床反應(yīng)不足夠，主治醫(yī)師也將知道調(diào)整治療到更高的水平(排除毒性)。在感興趣的病癥的管理的給藥劑量的大小將與要治療的病癥的嚴(yán)重程度和給藥途徑而有所不同。例如可通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)的預(yù)后評(píng)價(jià)方法部分地評(píng)價(jià)情況的嚴(yán)重程度。此外，根據(jù)個(gè)體患者的年齡、體重和反應(yīng)，劑量和可能劑量頻率也將變化。與上文討論的類(lèi)似的程序可能用于獸藥。雖然是在每一藥物的基礎(chǔ)上確定確切的劑量，但是在大多數(shù)情況下可作出關(guān)于劑量的泛化。對(duì)于成人患者每日的劑量方案可以是，例如，約0.1mg至2000mg各活性成分的劑量，優(yōu)選地約1mg至約500mg，例如5至200mg。在其它實(shí)施方式中，使用各活性成分的靜脈內(nèi)的、皮下的，或肌肉內(nèi)的劑量是約0.01mg至約100mg，優(yōu)選地約0.1mg至約60mg，例如約1至約40mg。在給藥藥學(xué)上可接受的鹽的情況下，可以按游離基(freebase)計(jì)算劑量。在一些實(shí)施方式中，每天給藥制劑1至4次?？蛇x地可通過(guò)持續(xù)的靜脈滴注給藥所述制劑，優(yōu)選地以各活性成分高至約1000mg每天的劑量。如本領(lǐng)域技術(shù)人員將理解的，在一些情況下有必要將本文公開(kāi)的制劑以超過(guò)或甚至遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過(guò)上述的優(yōu)選的劑量范圍給藥，以有效地和強(qiáng)勁地治療特別侵襲性的疾病和感染。在一些實(shí)施方式中，在一段持續(xù)治療時(shí)間(例如一周或更長(zhǎng)，或幾個(gè)月或幾年)里給藥所述制劑?？蓡为?dú)調(diào)整劑量和間期以提供活性結(jié)構(gòu)部分的足以維持調(diào)節(jié)作用的血漿水平，或最低有效濃度(mec)。對(duì)于各化合物mec將變化，但可從體外數(shù)據(jù)估計(jì)。要實(shí)現(xiàn)mec的劑量將取決于個(gè)體特征和給藥途徑。但是，hplc測(cè)驗(yàn)或生物測(cè)驗(yàn)可用于確定血漿濃度。劑量間期也可使用mec值確定。應(yīng)使用在10-90％，優(yōu)選地在30-90％之間和最優(yōu)選地在50-90％之間的時(shí)間里維持血漿水平高于mec的方案給藥組合物。在局部給藥或選擇性吸收的情況下，藥物的有效局部濃度可能與血漿濃度無(wú)關(guān)聯(lián)。給藥的制劑量可以取決于被治療的受治療者、治療者的重量、疾病的嚴(yán)重程度、給藥方式、以及處方醫(yī)生的判斷?？墒褂靡阎椒ㄔu(píng)價(jià)本文公開(kāi)的制劑(例如，該制劑可包含化合物、類(lèi)視黃醇、第二脂質(zhì)、穩(wěn)定劑、和/或治療劑)的功效和毒性。例如，通過(guò)測(cè)定對(duì)細(xì)胞系(例如哺乳動(dòng)物和優(yōu)選地人的細(xì)胞系)的體外毒性來(lái)確立具體化合物或該化合物的共享某些化學(xué)結(jié)構(gòu)部分的子集的毒理學(xué)。此類(lèi)研究的結(jié)果經(jīng)常預(yù)測(cè)動(dòng)物(例如哺乳動(dòng)物，或更具體地人)中的毒性?？蛇x地，可使用已知方法確定在動(dòng)物模型(例如小鼠、大鼠、兔或猴)中具體化合物的毒性?？墒褂脦追N公認(rèn)的方法確定具體化合物的功效，所述方法例如體外方法、動(dòng)物模型、或人的臨床試驗(yàn)。公認(rèn)的體外模型存在于幾乎每一類(lèi)別的情況中，包括但不限于癌癥、心血管疾病和各種免疫功能障礙。類(lèi)似地，可接受的動(dòng)物模型可用于確定化學(xué)品治療此類(lèi)情況的功效。當(dāng)選擇模型以確定功效時(shí)，本領(lǐng)域技術(shù)人員可由本領(lǐng)域的技術(shù)狀態(tài)引導(dǎo)區(qū)選擇合適的模型、劑量和給藥途徑，以及方案。的人人的臨床試驗(yàn)也可用于確定化合物在人體內(nèi)的功效。如果需要，所述制劑可以包裝或分配裝置呈現(xiàn)，其可含有一個(gè)或多個(gè)含有活性成分的單位劑型。所述包裝可例如包含金屬或塑料薄片，例如吸塑包裝。所述包裝或分配裝置可能帶有給藥說(shuō)明書(shū)。所述包裝或分配裝置也可能以規(guī)范制造、使用或銷(xiāo)售藥品的政府機(jī)構(gòu)規(guī)定的形式含有與容器有關(guān)的注意書(shū)，該注意書(shū)是經(jīng)過(guò)用于人和動(dòng)物給藥的藥物形式的機(jī)構(gòu)批準(zhǔn)的反映。此類(lèi)注意書(shū)，例如，可以是處方藥獲得美國(guó)食品和藥物管理局批準(zhǔn)的標(biāo)簽，或批準(zhǔn)的產(chǎn)品插頁(yè)。也可制備包含配制在相容的藥物載體中的化合物的組合物，置于適宜的容器中，并標(biāo)記用于所指示情況的治療。需理解，在本文描述的任何具有一個(gè)或多個(gè)立構(gòu)中心的化合物中，如果沒(méi)有明確地指明絕對(duì)的立體化學(xué)，則每個(gè)中心可以獨(dú)立地為r-構(gòu)型或s-構(gòu)型或其混合物。因此，本文提供的化合物可以是對(duì)映體純的或是立體異構(gòu)混合物。另外，需理解在任何具有產(chǎn)生(定義為e或z的)幾何異構(gòu)體的一個(gè)或多個(gè)雙鍵的化合物中，各雙鍵可以獨(dú)立地是e或z或其混合物。同樣地，也意在包括所有互變異構(gòu)形式。通過(guò)參考以下實(shí)施例進(jìn)一步示范本發(fā)明。這些實(shí)施例僅僅是用作說(shuō)明的，并不意在限制本發(fā)明。實(shí)施例實(shí)施例1：制備2-(雙(2-(十四酰氧基)乙基)氨基)-n-(2-羥乙基)-n,n-二甲基-2-氧代乙胺鎓溴化物(hedc)制備中間體1：2,2'-(叔丁氧基羰基氮烷二基)雙(乙烷-2,1-二基)雙十四烷酸酯(hedc-boc-in)將n-boc-二乙醇胺(194g，0.946mol)、三乙胺(201g，2.03mol)和二氨基吡啶(23.1g，0.19mol)在dcm(1750ml)中的溶液冷卻至0℃。在0-10℃，50分鐘的時(shí)間里加入肉豆蔻酰氯(491g，1.99mol)在dcm(440ml)中的溶液，讓該混合物溫?zé)嶂镰h(huán)境溫度。在20-24℃和1.5小時(shí)之后tlc顯示完全轉(zhuǎn)化。加入水(1750ml)并由ph計(jì)測(cè)量出ph8.3。分離有機(jī)相、用(1)6％的nahco3(500ml)、(2)0.3mhcl(1700ml)、(3)12.5％氯化鈉(1700ml)清洗并用無(wú)水硫酸鎂(120g)干燥。在50℃和50mbar蒸發(fā)濾液獲得622g的2,2'-(叔丁氧基羰基氮烷二基)雙(乙烷-2,1-二基)雙十四烷酸酯(hedc-boc-in)。將靜置固化的該蒸餾殘余物用于下一步驟中。制備中間體2：2,2'-(叔丁氧基羰基氮烷二基)雙(乙烷-2,1-二基)雙十四烷酸酯(hedc-胺-in)tfa鹽在50℃的浴中短暫加熱將hedc-boc-in(620g，0.990mol)轉(zhuǎn)變?yōu)橐簯B(tài)，然后冷卻至低于25℃。在30分鐘時(shí)間內(nèi)將tfa(940ml，1.39kg，1.18mol)加入該液體中，使用適度的冷卻使得溫度保持在不高于25℃。加入三分之二量的tfa時(shí)，觀察到顯著的氣體釋放。在環(huán)境溫度下過(guò)夜攪拌該反應(yīng)混合物。tlc顯示痕量hedc-boc-in。將該反應(yīng)混合物加熱以在減壓(125-60mbar)下從50-55℃的水浴蒸餾tfa。并持續(xù)蒸餾直至其變得很慢。在具有10％氫氧化鈉的滌氣器中將tfa煙霧吸收。加入庚烷(2000ml)、攪拌、并減壓下蒸餾。將庚烷(2000ml)加入部分固化的殘余物中，并將該混合物加熱至45℃，在該溫度形成稍顯混濁的溶液。冷卻該溶液、在40℃接種，并在40-36℃攪拌25分鐘的時(shí)間形成沉淀。冷卻并在室溫?cái)嚢?0分鐘的時(shí)間后，通過(guò)過(guò)濾隔離大量結(jié)晶(heavycrystals)沉淀，并用庚烷(1000ml)清洗濾餅。在環(huán)境溫度和減壓(<1mbar)下過(guò)夜干燥濕的濾餅(914g)以獲得作為白色晶體的635g(100％)的2,2'-(叔丁氧基羰基氮烷二基)雙(乙烷-2,1-二基)雙十四烷酸酯(hedc-胺-in)tfa鹽。制備中間體3:2,2'-(2-(二甲基氨基)乙?；槎?雙(乙烷-2,1-二基)雙十四烷酸酯(hedc-dimegly-in)將n,n-二甲基甘氨酸(56.6g，548毫摩爾)，hobt水合物(83.9g，548毫摩爾)和edc鹽酸鹽(105g，548毫摩爾)加至dmf(3.5l)，并將該混合物在環(huán)境溫度下攪拌一小時(shí)的時(shí)間。形成澄清溶液。將hedc-胺-intfa鹽(270g，442毫摩爾)與dcm(1.15l)和6％碳酸氫鈉(1.15l)混合。將帶有游離胺的分離的有機(jī)相加至dmf中的偶聯(lián)混合物中，觀察到沉淀以及大約9℃的溫度上升。加入三乙胺(47.0g，464毫摩爾)，在25-30℃攪拌該反應(yīng)混合物5小時(shí)的時(shí)間。tlc顯示不完全轉(zhuǎn)化，加入額外的edc鹽酸鹽(29.5g，154毫摩爾)。在環(huán)境溫度下過(guò)夜攪拌后，觀察到澄清溶液，并且此時(shí)tlc顯示完全轉(zhuǎn)化。將該反應(yīng)混合物與dcm(2.3l)以及2％碳酸氫鈉(7l)混合。用1.25％氯化鈉(各5l)清洗有機(jī)相兩次并用無(wú)水硫酸鎂(186g)干燥。在50℃和30mbar蒸發(fā)濾液以獲得253g粗油。將該粗材料裝入填充了2.6kg硅膠60(40-63μ)的柱子中。用甲苯:乙酸乙酯(8:2)(4l)，隨后用乙酸乙酯:甲醇(1:1)(5l)洗脫該產(chǎn)品。蒸發(fā)含產(chǎn)品的級(jí)分(3.5-8l)(50℃/250-20mbar)以獲得油狀的208g(66％)的2,2'-(2-(二甲基氨基)乙酰基氮烷二基)雙(乙烷-2,1-二基)雙十四烷酸酯(hedc-dimegly-in)。hedc的制備：2-(雙(2-(十四酰氧基)乙基)氨基)-n-(2-羥乙基)-n,n-二甲基-2-氧代乙胺鎓溴化物將hedc-dimegly-in(206g，337毫摩爾)和2-溴乙醇(274g，2.19mol)的混合物在80℃攪拌2小時(shí)的時(shí)間。hplc顯示有8.1％未反應(yīng)的二甲基甘氨酸中間體。在80℃和額外的40分鐘之后，hplc顯示有7.8％未反應(yīng)的二甲基甘氨酸中間體。加入溫?zé)岬?65℃)乙酸乙酯(2l)。用熱的乙酸乙酯(0.5l)清洗熱溶液的空濾(blankfiltration)。將組合的濾液冷卻至0℃，通過(guò)接種引發(fā)結(jié)晶。將產(chǎn)品的懸浮液緩慢冷卻并在-16至-18℃攪拌40分鐘的時(shí)間。過(guò)濾分離沉淀，并用冷的乙酸乙酯(200ml)清洗濾餅。過(guò)夜干燥(20℃/<1mbar)獲得211g粗材料。然后從乙酸乙酯(2.1l)和乙醇(105ml)的混合物通過(guò)加熱至35℃并在25℃接種重結(jié)晶該材料。在10℃分離沉淀，用冷乙酸乙酯(300ml)清洗并過(guò)夜干燥(20℃/<1mbar)以獲得161g的(66％)2-(雙(2-(十四酰氧基)乙基)氨基)-n-(2-羥乙基)-n,n-二甲基-2-氧代乙胺鎓溴化物(hedc)。hplc顯示為99.5％的純度。qtofmsesi+:m/z655.6(m+h)。實(shí)施例2：制備2-(雙(3-(十四酰氧基)丙基)氨基)-n-(2-羥乙基)-n,n-二甲基-2-氧代-乙胺鎓溴化物(pr-hedc)制備中間體1：3,3'-氮烷二基雙(丙-1-醇)將3-氨基-1-丙醇(14.5ml，19.0毫摩爾)，1-氯-3-羥基丙烷(8ml，95.6毫摩爾)和h2o(～50ml)的混合物回流超過(guò)24小時(shí)。然后加入氫氧化鉀(5.40g)。溶解后，將全部h2o蒸發(fā)以留下黏性油和大量氯化鉀。過(guò)濾這些并用無(wú)水丙酮和二氯甲烷清洗。na2so4上干燥有機(jī)相、過(guò)濾并濃縮。然后通過(guò)具有dcm/meoh梯度的硅膠色譜純化產(chǎn)品以獲得12.5g3,3'-氮烷二基雙(丙-1-醇)。制備中間體2：叔丁基雙(3-羥丙基)氨基甲酸酯將3,3'-氮烷二基雙(丙-1-醇)(12.5g，95.4mmol)稀釋在dcm(25ml)中。在ar氣層下攪拌時(shí)緩慢加入二-叔丁基碳酸氫酯(26g，119.25mmol)在dcm(25ml)中的溶液。讓反應(yīng)攪拌過(guò)夜。濃縮反應(yīng)混合物。通過(guò)具有dcm/meoh梯度的硅膠色譜純化獲得叔丁基雙(3-羥丙基)氨基甲酸酯。制備中間體3：((叔丁氧基羰基)氮烷二基)雙(丙烷-3,1-二基)雙十四烷酸酯將叔丁基雙(3-羥丙基)氨基甲酸酯(4.00g，17.3毫摩爾)，三乙胺(4.80ml，34.6毫摩爾)和4-二甲基氨基吡啶(529mg，4.33毫摩爾)溶解在氯仿(50ml)中。當(dāng)在冰浴中攪拌時(shí)，在～15分鐘內(nèi)加入肉豆蔻酰氯溶液。添加以這樣的方式進(jìn)行：反應(yīng)溫度不超過(guò)30℃。讓反應(yīng)在室溫下攪拌過(guò)夜。第二天，加入meoh(50ml)和0.9％的鹽溶液(50ml)以淬滅該反應(yīng)。分離有機(jī)層并用1m的nahco3清洗。用na2so4干燥溶劑、過(guò)濾并真空濃縮以獲得油狀的((叔丁氧基羰基)氮烷二基)雙(丙烷-3,1-二基)雙十四烷酸酯。制備中間體4：氮烷二基雙(丙烷-3,1-二基)雙十四烷酸酯tfa鹽將((叔丁氧基羰基)氮烷二基)雙(丙烷-3,1-二基)雙十四烷酸酯(11.3g，17.3毫摩爾)溶解在tfa/chcl3(1:1，20ml)中，并讓該混合物在室溫下攪拌15分鐘。然后將該混合物真空濃縮。重復(fù)其一次。然后將殘余物溶解在dcm中并用h2o清洗，用na2so4干燥，并真空濃縮。通過(guò)具有dcm/meoh梯度的硅膠色譜純化獲得作為tfa鹽的氮烷二基雙(丙烷-3,1-二基)雙十四烷酸酯(750mg)。制備中間體5：((2-(二甲基氨基)乙?；?氮烷二基)雙(丙烷-3,1-二基)雙十四烷酸酯用dcm(5ml)稀釋氮烷二基雙(丙烷-3,1-二基)雙十四烷酸酯tfa鹽(750mg，1.35毫摩爾)并加至預(yù)活化的n,n-二甲基甘氨酸(154mg，1.49mmol)、hatu(616mg，1.62mmol)和diea(495ul，2.84mmol)在dcm(5ml)中的混合物中。用氬氣沖洗產(chǎn)品并在室溫下過(guò)夜攪拌，然后濃縮。通過(guò)具有dcm/meoh梯度的硅膠色譜純化獲得465mg((2-(二甲基氨基)乙?；?氮烷二基)雙(丙烷-3,1-二基)雙十四烷酸酯。制備pr-hedc：2-(雙(3-(十四酰氧基)丙基)氨基)-n-(2-羥乙基)-n,n-二甲基-2-氧代乙胺鎓溴化物在密封系統(tǒng)中，將((2-(二甲基氨基)乙?；?氮烷二基)雙(丙烷-3,1-二基)雙十四烷酸酯(246mg，0.385毫摩爾)溶解在acn(10ml)中，并加入2-溴乙醇(500ul)。用惰性氣體沖洗該反應(yīng)小管然后密封。將該混合物加熱至80℃，過(guò)夜攪拌，然后冷卻并真空濃縮。通過(guò)具有dcm/meoh梯度的硅膠色譜純化獲得99mg的2-(雙(3-(十四酰氧基)丙基)氨基)-n-(2-羥乙基)-n,n-二甲基-2-氧代乙胺鎓溴化物。qtofmsesi+：m/z683.6(m+h)。實(shí)施例3：制備2-(雙(3-(油?；趸?丙基)氨基)-n-(2-羥乙基)-n,n-二甲基-2-氧代乙胺鎓溴化物(pr-he-dodc)制備中間體1：(z)-((叔丁氧基羰基)氮烷二基)雙(丙烷-3,1-二基)二油酸酯將叔丁基雙(3-羥丙基)氨基甲酸酯(前述合成)、三乙胺和dmap溶解在氯仿中。當(dāng)在冰浴中攪拌時(shí)，15分鐘內(nèi)加入油酰氯溶液。添加以這樣的方式進(jìn)行：反應(yīng)溫度不超過(guò)30℃。讓反應(yīng)在室溫下攪拌過(guò)夜。第二天，加入meoh(50ml)和0.9％的鹽溶液(50ml)以淬滅該反應(yīng)。分離有機(jī)層并用1m的nahco3清洗。用na2so4干燥溶劑、過(guò)濾并真空濃縮以獲得油。就這樣不經(jīng)進(jìn)一步純化使用(z)-((叔丁氧基羰基)氮烷二基)雙(丙烷-3,1-二基)二油酸酯。制備中間體2：(z)-氮烷二基雙(丙烷-3,1-二基)二油酸酯tfa鹽將(z)-((叔丁氧基羰基)氮烷二基)雙(丙烷-3,1-二基)二油酸酯(13.2g，17.3毫摩爾)溶解在在tfa/chcl3(1:1，20ml)中，并讓該混合物在室溫下攪拌15分鐘。然后真空濃縮該混合物。重復(fù)其一次。然后將殘余物溶解在dcm中并用h2o清洗，用na2so4干燥，并濃縮。通過(guò)具有dcm/meoh梯度的硅膠色譜純化獲得(z)-氮烷二基雙(丙烷-3,1-二基)二油酸酯tfa鹽(750mg)。制備中間體3：(z)-((2-(二甲基氨基)乙?；?氮烷二基)雙(丙烷-3,1-二基)二油酸酯用dcm(5ml)稀釋(z)-氮烷二基雙(丙烷-3,1-二基)二油酸酯tfa鹽(750mg，1.13毫摩爾)并加至預(yù)活化的n,n-二甲基甘氨酸(128mg，1.24毫摩爾)、hatu(517mg，1.36毫摩爾)和diea(413ul，2.37毫摩爾)在dcm(5ml)中的混合物中。用氬氣沖洗燒瓶并在室溫下過(guò)夜攪拌。濃縮該反應(yīng)混合物并進(jìn)行具有dcm/meoh梯度的硅膠色譜獲得(z)-((2-(二甲基氨基)乙酰基)氮烷二基)雙(丙烷-3,1-二基)二油酸酯。制備pr-he-dodc：2-(雙(3-(油酰基氧基)丙基)氨基)-n-(2-羥乙基)-n,n-二甲基-2-氧代乙胺鎓溴化物在密封系統(tǒng)中，將(z)-((2-(二甲基氨基)乙?；?氮烷二基)雙(丙烷-3,1-二基)二油酸酯(269mg，0.360毫摩爾)溶解在acn(10ml)中并加入2-溴乙醇(200ul)。用惰性氣體沖洗該反應(yīng)小管然后密封。將該反應(yīng)加熱至80℃，并讓其過(guò)夜攪拌。然后將該反應(yīng)混合物冷卻并濃縮。通過(guò)具有dcm/meoh梯度的硅膠色譜純化獲得2-(雙(3-(油?；趸?丙基)氨基)-n-(2-羥乙基)-n,n-二甲基-2-氧代乙胺鎓溴化物(129mg)。qtofmsesi+：m/z791.7(m+h)。實(shí)施例4：制備3-(雙(2-(十四酰氧基)乙基)氨基)-n-(2-羥乙基)-n,n-二甲基-3-氧代-丙-1-胺鎓溴化物(he-et-dc)制備中間體1：((3-(二甲基氨基)丙?；?氮烷二基)雙(乙烷-2,1-二基)雙十四烷酸酯合成前述的氮烷二基雙(乙烷-2,1-二基)雙十四烷酸酯tfa鹽。用dcm(10ml)稀釋氮烷二基雙(乙烷-2,1-二基)雙十四烷酸酯tfa鹽(1.5g，2.85毫摩爾)并加至3-(二甲基氨基)丙酸hcl鹽(482mg，3.14毫摩爾)、hatu(1.30g，3.42毫摩爾)和diea(1.04ml，5.98毫摩爾)在dcm(10ml)中的預(yù)活化的混合物中。用氬氣沖洗該圓底燒瓶并在室溫下讓該反應(yīng)混合物過(guò)夜攪拌。濃縮該反應(yīng)混合物。通過(guò)具有dcm/meoh梯度的硅膠色譜純化獲得((3-(二甲基氨基)丙?；?氮烷二基)雙(乙烷-2,1-二基)雙十四烷酸酯。制備he-et-dc：3-(雙(2-(十四酰氧基)乙基)氨基)-n-(2-羥乙基)-n,n-二甲基-3-氧代丙-1-胺鎓溴化物在密封系統(tǒng)中，將((3-(二甲基氨基)丙酰基)氮烷二基)雙(乙烷-2,1-二基)雙十四烷酸酯(606mg，0.970mmol)溶解在acn(10ml)中并加入2-溴乙醇(500ul)。用惰性氣體沖洗該反應(yīng)小管然后密封。將該反應(yīng)加熱至80℃，并過(guò)夜攪拌。然后冷卻并濃縮。通過(guò)具有dcm/meoh梯度的硅膠色譜純化獲得3-(雙(2-(十四酰氧基)乙基)氨基)-n-(2-羥乙基)-n,n-二甲基-3-氧代丙-1-胺鎓溴化物(80mg)。qtofmsesi+：m/z669.6(m+h)。實(shí)施例5：制備3-(雙(2-(油?；趸?乙基)氨基)-n-(2-羥乙基)-n,n-二甲基-3-氧代丙-1-胺鎓溴化物(he-et-dodc)制備中間體1：(z)-((叔丁氧基羰基)氮烷二基)雙(乙烷-2,1-二基)二油酸酯將n-boc二乙醇胺(aldrich15268，lot#0001406013，mw205.25；17.81g，0.087mole)、三乙胺(aldrich，mw101.19；24.4ml，0.176mole)和4-(二甲基氨基)吡啶(aldrich，mw122.17；2.76g，1.3g，0.023mole)溶解在350ml氯仿中。攪拌時(shí)，在10分鐘內(nèi)加入油酰氯(mw300.91；61.6g，0.174mole)在100ml氯仿中的溶液(可選地，加油酰氯時(shí)將n-boc二乙醇胺的氯仿溶液浸沒(méi)于冰/水浴中)。添加以這樣的方式進(jìn)行：反應(yīng)溫度不超過(guò)50℃。讓反應(yīng)在室溫下攪拌2小時(shí)。加入200ml甲醇(emdmx0485-5，lot50350)和200ml0.9％鹽溶液(氯化鈉，bdh，bdh8014，lot#92717)的混合物以淬滅該反應(yīng)。分離有機(jī)層并用2×100ml稀碳酸氫鈉(aldrichs6014，batch#095k0143)水溶液清洗。通過(guò)旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)去除溶劑以獲得59.5g如淺黃色油的粗產(chǎn)品(mw734.14；59.5g，0.081摩爾，產(chǎn)率100％)。不經(jīng)進(jìn)一步純化將該材料用于下一步驟中。1hnmr(400mhz,cdcl3)0.87(t,6h,ch3),1.20-1.40(m,40h,ch2),1.45(s,9h,tbuch3),1.59(m,4h,ch2ch2c(＝o)),2.00(m,8h,ch2ch＝ch),2.33(t,4h,ch2c(＝o)),3.48(m,4h,nch2ch2o),4.18(m,4h,nch2ch2o),5.33(m,4h,ch＝ch)。制備中間體2：(z)-氮烷二基雙(乙烷-2,1-二基)二油酸酯tfa鹽用100ml的三氟乙酸(alfaaesarstock#a12198，lot#d07w005，mw114.02；100ml，1.35摩爾)和100ml的氯仿(aldrich154733，lot#kbf5943v)處理(z)-((叔丁氧基羰基)氮烷二基)雙(乙烷-2,1-二基)二油酸酯(59.5g，0.081摩爾)兩次。各由室溫下攪拌10分鐘構(gòu)成，并在各次處理的最后通過(guò)旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)將溶劑去除。在第二次處理后，通過(guò)旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮該反應(yīng)混合物。將殘余物溶解在200ml二氯甲烷中，并用100ml水洗滌該混合物兩次。通過(guò)使用甲醇(emdmx0485-5，lot50350)和二氯甲烷(emddx0835-5，lot51090)作為洗脫劑的硅膠色譜純化殘余物以獲得44g(z)-氮烷二基雙(乙烷-2,1-二基)二油酸酯tfa鹽(44.0g)。1hnmr(400mhz,cdcl3)0.87(t,6h,ch3),1.20-1.40(m,40h,ch2),1.59(m,4h,ch2ch2c(＝o)),2.00(m,8h,ch2ch＝ch),2.33(t,4h,ch2c(＝o)),3.31(m,4h,nch2ch2o),4.38(m,4h,nch2ch2o),5.33(m,4h,ch＝ch)。制備中間體3：(((z)-((3-(二甲基氨基)丙酰基)氮烷二基)雙(乙烷-2,1-二基)二油酸酯用dcm(10ml)稀釋(z)-氮烷二基雙(乙烷-2,1-二基)二油酸酯tfa鹽(1.50g，2.37毫摩爾)并加至3-(二甲基氨基)丙酸hcl鹽(383mg，2.49毫摩爾)、hatu(1034mg，2.72毫摩爾)和diea(831ul，4.77毫摩爾)在dcm(10ml)中的預(yù)活化的混合物中。用氬氣沖洗該圓底燒瓶并在室溫下讓該反應(yīng)混合物過(guò)夜攪拌。濃縮該反應(yīng)混合物。通過(guò)具有dcm/meoh梯度的硅膠色譜純化獲得(z)-((3-(二甲基氨基)丙?；?氮烷二基)雙(乙烷-2,1-二基)二油酸酯。制備he-et-dodc：3-(雙(2-(油?；趸?乙基)氨基)-n-(2-羥乙基)-n,n-二甲基-3-氧代-丙-1-胺鎓溴化物在密封系統(tǒng)中，將(((z)-((3-(二甲基氨基)丙酰基)氮烷二基)雙(乙烷-2,1-二基)二油酸酯(588mg，0.802毫摩爾)溶解在acn(10ml)中并加入2-溴乙醇(200ul)。用惰性氣體沖洗該反應(yīng)小管然后密封。將該反應(yīng)加熱至80℃，并過(guò)夜攪拌，然后冷卻并真空濃縮。通過(guò)具有dcm/meoh梯度的硅膠色譜純化獲得3-(雙(2-(油?；趸?乙基)氨基)-n-(2-羥乙基)-n,n-二甲基-3-氧代丙-1-胺鎓溴化物(160mg)。qtofmsesi+：m/z764.3(m+h)。實(shí)施例6：制備4-(雙(2-(十四酰氧基)乙基)氨基)-n-(2-羥乙基)-n,n-二甲基-4-氧代丁-1-胺鎓溴化物(he-pr-dc)制備中間體1：((4-(二甲基氨基)丁?；?氮烷二基)雙(乙烷-2,1-二基)雙十四烷酸酯合成前述的氮烷二基雙(乙烷-2,1-二基)雙十四烷酸酯tfa鹽。用dcm(5ml)稀釋氮烷二基雙(乙烷-2,1-二基)雙十四烷酸酯tfa鹽(1.00g，1.90毫摩爾)并加至4-(二甲基氨基)丁酸hcl鹽(382mg，2.28毫摩爾)、hatu(867mg，2.28mmol)和diea(728ul，4.18毫摩爾)在dcm(5ml)中的預(yù)活化的混合物中。用氬氣沖洗該燒瓶并在室溫下讓該反應(yīng)混合物過(guò)夜攪拌，然后濃縮。通過(guò)具有dcm/meoh梯度的硅膠色譜純化獲得((4-(二甲基氨基)丁?；?氮烷二基)雙(乙烷-2,1-二基)雙十四烷酸酯。制備he-pr-dc：4-(雙(2-(十四酰氧基)乙基)氨基)-n-(2-羥乙基)-n,n-二甲基-4-氧代丁-1-胺鎓溴化物在密封系統(tǒng)中，將((4-(二甲基氨基)丁?；?氮烷二基)雙(乙烷-2,1-二基)雙十四烷酸酯(300mg，0.469毫摩爾)溶解在acn(5ml)中并加入2-溴乙醇(500ul)。用惰性氣體沖洗該反應(yīng)小管然后密封。將該反應(yīng)加熱至80℃，并過(guò)夜攪拌，然后濃縮。通過(guò)具有dcm/meoh梯度的硅膠色譜純化獲得4-(雙(2-(十四酰氧基)乙基)氨基)-n-(2-羥乙基)-n,n-二甲基-4-氧代丁-1-胺鎓溴化物(140mg).lcmsesi+：m/z684.4(m+h).實(shí)施例7：制備4-(雙(2-(油?；趸?乙基)氨基)-n-(2-羥乙基)-n,n-二甲基-4-氧代丁-1-胺鎓溴化物(he-pr-dodc)制備中間體1：(z)-((4-(二甲基氨基)丁酰基)氮烷二基)雙(乙烷-2,1-二基)二油酸酯合成前述的(z)-氮烷二基雙(乙烷-2,1-二基)二油酸酯tfa鹽。用dcm(5ml)稀釋(z)-氮烷二基雙(乙烷-2,1-二基)二油酸酯tfa鹽(1.00g，1.58毫摩爾)并加至4-(二甲基氨基)丁酸hcl鹽(317mg，1.89毫摩爾)、hatu(719mg，1.89毫摩爾)和diea(606ul，3.48毫摩爾)在dcm(5ml)中的預(yù)活化的混合物中。用氬氣沖洗該燒瓶并在室溫下讓該反應(yīng)混合物過(guò)夜攪拌，然后濃縮。通過(guò)具有dcm/meoh梯度的硅膠色譜純化獲得(z)-((4-(二甲基氨基)丁酰基)氮烷二基)雙(乙烷-2,1-二基)二油酸酯。制備he-pr-dodc：4-(雙(2-(油酰基氧基)乙基)氨基)-n-(2-羥乙基)-n,n-二甲基-4-氧代丁-1-胺鎓溴化物在密封系統(tǒng)中，將((4-(二甲基氨基)丁?；?氮烷二基)雙(乙烷-2,1-二基)雙十四烷酸酯(400mg，0.535毫摩爾)溶解在acn(5ml)中并加入2-溴乙醇(500ul)。用惰性氣體沖洗該反應(yīng)小管然后密封。將該反應(yīng)加熱至80℃，并過(guò)夜攪拌，然后濃縮。通過(guò)具有dcm/meoh梯度的硅膠色譜純化獲得4-(雙(2-(油?；趸?乙基)氨基)-n-(2-羥乙基)-n,n-二甲基-4-氧代丁-1-胺鎓溴化物(255mg).lcmsesi+：m/z792.5(m+h)。實(shí)施例8：制備2-(雙(2-(油酰基氧基)乙基)氨基)-n,n-雙(2-羥乙基)-n-甲基-2-氧代乙胺鎓溴化物(he2dodc)制備中間體1：(z)-((2-溴乙?；?氮烷二基)雙(乙烷-2,1-二基)二油酸酯合成前述的(z)-氮烷二基雙(乙烷-2,1-二基)二油酸酯tfa鹽。將(z)-氮烷二基雙(乙烷-2,1-二基)二油酸酯tfa鹽(1.50g，2.34毫摩爾)溶解在dcm(20ml)中并置于冰浴中。加入溴乙酰溴(214ul，2.46毫摩爾)再加入三乙胺(685ul，4.91毫摩爾)。移去冰浴并讓該反應(yīng)在室溫下惰性氣體中攪拌過(guò)夜，然后用dcm稀釋至100ml，并用1mhcl(75ml)、h2o(75ml)、飽和的nahco3溶液(75ml)和飽和的鹽水溶液(75ml)清洗。用dcm(25ml)重新萃取所有水洗液，用mgso4干燥有機(jī)物、過(guò)濾并真空濃縮。用乙酸乙酯的硅膠色譜進(jìn)行純化獲得(z)-((2-溴乙?；?氮烷二基)雙(乙烷-2,1-二基)二油酸酯(1.22g)。制備he2dodc：2-(雙(2-(油?；趸?乙基)氨基)-n,n-雙(2-羥乙基)-n-甲基-2-氧代乙胺鎓溴化物在密封系統(tǒng)中，加入與n-甲基二乙胺(1.58ml，13.8毫摩爾)組合的(z)-((2-溴乙?；?氮烷二基)雙(乙烷-2,1-二基)二油酸酯(2.08g，2.75毫摩爾)。用惰性氣體沖洗該反應(yīng)小管然后密封。將該反應(yīng)加熱至50℃，并過(guò)夜攪拌，然后濃縮。通過(guò)具有dcm/meoh梯度的硅膠色譜純化獲得2-(雙(2-(油?；趸?乙基)氨基)-n,n-雙(2-羥乙基)-n-甲基-2-氧代乙胺鎓溴化物(479mg)。lcmsesi+：m/z793.7(m+h)。實(shí)施例9：制備2-(雙(2-((9z,12z)-十八碳-9,12-二烯?；?dienoyl)氧基)乙基)氨基)-n-(2-羥乙基)-n,n-二甲基-2-氧代乙胺鎓溴化物(hedc-dlin)以和hedc相似的方式制備2-(雙(2-((9z,12z)-十八碳-9,12-二烯?；趸?乙基)氨基)-n-(2-羥乙基)-n,n-二甲基-2-氧代乙胺鎓溴化物，用(9z,12z)-十八碳-9,12-二烯酰氯替代肉豆蔻酰氯。實(shí)施例10：制備2-(雙(2-(十二酰氧基)乙基)氨基)-n-(2-羥乙基)-n,n-二甲基-2-氧代乙胺鎓溴化物(hedc-12)以和hedc類(lèi)似的方式制備2-(雙(2-(十二酰氧基)乙基)氨基)-n-(2-羥乙基)-n,n-二甲基-2-氧代乙胺鎓溴化物，將月桂基氯化物替換為肉豆蔻酰氯。實(shí)施例11：制備2-((2-(雙(2-(十四酰氧基)乙基)氨基)-2-氧代乙基)硫代)-n-(2-羥乙基)-n,n-二甲基乙胺鎓溴化物(hes104)制備中間體1：((2-((2-(二甲基氨基)乙基)硫代)乙?；?氮烷二基)雙(乙烷-2，1-二基)雙十四烷酸酯(s104).合成前述的氮烷二基雙(乙烷-2,1-二基)雙十四烷酸酯tfa鹽。0-5℃將氮烷二基雙(乙烷-2,1-二基)雙十四烷酸酯tfa鹽(152g，238毫摩爾)和dcm(2.3l)以及10％的碳酸氫鉀(1.15l)攪拌。分離有機(jī)相并用dcm(1.15l)進(jìn)一步萃取水相。合并的有機(jī)相與硫酸鎂水合物(236g)一起在0-5℃攪拌30分鐘，過(guò)濾并用dcm(1.15l)清洗。向合并的濾液中加入2-((2-(二甲基氨基)乙基)硫代)乙酸鹽酸鹽(57.0g，285毫摩爾)、edc鹽酸鹽(68.4g，357毫摩爾)和dmap(2.91g，23.8毫摩爾)，并在環(huán)境溫度下攪拌該懸浮液，在這段時(shí)間后，澄清溶液形成。加入mq-水(2.3l)和甲醇(460ml)，并在攪拌10分鐘的時(shí)間之后，分離澄清的有機(jī)相。用dcm(575ml)萃取混濁的水相(ph3.0)。濃縮合并的有機(jī)萃取液，獲得143g的作為鹽酸鹽的粗材料。將該粗材料(142.6g)轉(zhuǎn)移至有dcm(500ml)的蒸餾燒瓶中，并加入乙酸乙酯(1l)。在大氣壓下加熱該溶液至蒸餾，并持續(xù)蒸餾70分鐘的時(shí)間以獲得殘余物溫度為76℃。添加乙酸乙酯(800ml)獲得1.4l的總體積，并加入乙醇(70ml)。將50℃的澄清溶液冷卻至37℃，并加入晶種。在37-35℃和10分鐘的時(shí)間里觀察到開(kāi)始大量結(jié)晶，冷卻該懸浮液并在0℃過(guò)夜攪拌，通過(guò)過(guò)濾分離沉淀，用冷的乙酸乙酯(210ml)清洗。在環(huán)境溫度下和油泵真空里，一段4.5小時(shí)的時(shí)間干燥至恒重得到134g作為鹽酸鹽的重結(jié)晶材料，是白色結(jié)晶固體。將磷酸三鉀(85g，0.40mol)和磷酸氫二鉀(226g，1.30mol)加至純化水(1.7l)中，讓所形成的ph為10.9的溶液冷卻至18-20℃。加入dcm(1.3l)和重結(jié)晶的s104鹽酸鹽(133g，0.188mol)，并攪拌該混合物10分鐘的時(shí)間。以中等速度(在35分鐘的時(shí)間里)分離澄清的有機(jī)相，并用dcm(650ml)進(jìn)一步萃取混濁的水相。合并的有機(jī)相與無(wú)水硫酸鎂(65g)一起攪拌40分鐘的時(shí)間，過(guò)濾該混合物，并用dcm(200ml)清洗。在減壓(低至20mbar，在該壓力持續(xù)蒸發(fā)1小時(shí))下從50℃的水浴蒸發(fā)合并的濾液。在油泵真空從15-20℃水浴的額外蒸發(fā)導(dǎo)致126g部分固化的油。在-20℃的冷浴中的冷卻給予完全固化，在-20℃油泵真空下的干燥之后，本發(fā)明人獲得126g的((2-((2-(二甲基氨基)乙基)硫代)乙酰基)氮烷二基)雙(乙烷-2,1-二基)雙十四烷酸酯(s104)。hplc顯示98.1％的純度。制備hes104：2-((2-(雙(2-(十四酰氧基)乙基)氨基)-2-氧代乙基)硫代)-n-(2-羥乙基)-n,n-二甲基乙胺鎓溴化物在封閉系統(tǒng)中，加入與2-溴乙醇(687ul，9.69毫摩爾)組合的((2-((2-(二甲基氨基)乙基)硫代)乙?；?氮烷二基)雙(乙烷-2,1-二基)雙十四烷酸酯(1.00g，1.49毫摩爾)。用惰性氣體沖洗該反應(yīng)管然后密封。將反應(yīng)加熱至75℃并讓其攪拌過(guò)夜，然后冷卻，并在真空中濃縮。通過(guò)用dcm/meoh梯度的硅膠色譜的純化獲得2-((2-(雙(2-(十四酰氧基)乙基)氨基)-2-氧代乙基)硫代)-n-(2-羥乙基)-n,n-二甲基乙胺鎓溴化物(hes104)(790mg)。lcmsesi+：m/z715.7(m+h)。實(shí)施例12：制備2-((2-(雙(2-(油?；趸?乙基)氨基)-2-氧代乙基)硫代)-n-(2-羥乙基)-n,n-二甲基乙胺鎓溴化物(hes104-do)制備中間體1：(z)-((2-((2-(二甲基氨基)乙基)硫代)乙?；?氮烷二基)雙(乙烷-2,1-二基)二油酸酯合成前述的(z)-氮烷二基雙(乙烷-2,1-二基)二油酸酯tfa鹽。在0-5℃在dcm(60ml)和10％k2co3(30ml)中攪拌(z)-氮烷二基雙(乙烷-2,1-二基)二油酸酯tfa鹽(4.06g，6.41毫摩爾)。30分鐘后，分離有機(jī)相并用dcm(30ml)進(jìn)一步萃取水相。合并的有機(jī)相與無(wú)水硫酸鎂在0-5℃一起攪拌30分鐘的時(shí)間，過(guò)濾，并用dcm(30ml)清洗。向組合的濾液中加入2-((2-(二甲基氨基)乙基)硫代)乙酸(1.26g，7.70毫摩爾)、edc的hcl鹽(1.84g，9.62毫摩爾)、dmap(78.3mg，0.64毫摩爾)。在室溫下過(guò)夜攪拌該薄懸浮液；在一段時(shí)間之后，該溶液變得澄清。第二天，加入去離子水(60ml)和甲醇(30ml)。攪拌10分鐘后，分離該澄清有機(jī)層。用dcm萃取該混濁水相。濃縮合并的有機(jī)萃取物。通過(guò)硅質(zhì)塞過(guò)濾粗材料，并吸收到dcm(40ml)中，并加入pbs(ph＝11，50ml)。在室溫?cái)嚢柙摶旌衔?0分鐘。然后，分離有機(jī)相并用dcm(15ml)再萃取水相。合并的有機(jī)相與無(wú)水硫酸鎂一起攪拌30分鐘的時(shí)間。然后過(guò)濾該混合物，并用dcm清洗。真空濃縮該合并的濾液以獲得(z)-((2-((2-(二甲基氨基)乙基)硫代)乙?；?氮烷二基)雙(乙烷-2,1-二基)二油酸酯(3.44g)。制備hes104-do在密封系統(tǒng)中，加入與2-溴乙醇(319ul，4.50)組合的(z)-((2-((2-(二甲基氨基)乙基)硫代)乙酰基)氮烷二基)雙(乙烷-2,1-二基)二油酸酯(540mg，0.693mmol)。用惰性氣體沖洗該反應(yīng)小管然后密封。將該反應(yīng)加熱至75℃，并讓其過(guò)夜攪拌。第二天，冷卻并真空濃縮。通過(guò)具有dcm/meoh梯度的硅膠色譜純化獲得2-((2-(雙(2-(油?；趸?乙基)氨基)-2-氧代乙基)硫代)-n-(2-羥乙基)-n,n-二甲基乙胺鎓溴化物(324mg)。lcmsesi+：m/z823.8(m+h)。實(shí)施例13：制備2-((雙(2-(油?；趸?乙基)氨甲?；?硫代)-n-(2-羥乙基)-n,n-二甲基乙胺鎓溴化物(hetu104-do)制備中間體1：(z)-((((2-(二甲基氨基)乙基)硫代)羰基)氮烷二基)雙(乙烷-2,1-二基)二油酸酯合成前述的(z)-((叔丁氧基羰基)氮烷二基)雙(乙烷-2,1-二基)二油酸酯。將(z)-((叔丁氧基羰基)氮烷二基)雙(乙烷-2,1-二基)二油酸酯(4.2g，5.72毫摩爾)溶解在dcm(20ml)中并在冰浴中冷卻至0℃。加入tfa(20ml)并讓混合物在惰性氣體層下攪拌20分鐘。之后，在真空中濃縮混合物。在10％的k2co3(20ml)和dcm(20ml)之間分配殘余物。在冰浴中攪拌該混合物20分鐘。收集有機(jī)部分，并用dcm(2x10ml)萃取混濁的水層。合并的有機(jī)萃取物與無(wú)水mgso4一起加入并在0℃攪拌20分鐘。過(guò)濾該懸浮液并用dcm(10ml)清洗。將雙光氣(1.38ml，11.4毫摩爾)加至dcm中的(z)-氮烷二基雙(乙烷-2,1-二基)二油酸酯材料中并在室溫下惰性氣體層下攪拌。第二天，在真空中去除dcm和過(guò)量雙光氣。在dcm(50ml)和三乙胺(5.2ml，37.2毫摩爾)中吸收2-(二甲基氨基)乙硫醇hcl鹽(4.05g，28.6毫摩爾)，并將其加至(z)-((氯羰基)氮烷二基)雙(乙烷-2,1-二基)二油酸酯殘余物中。讓反應(yīng)混合物在室溫下過(guò)夜攪拌。第二天，用dcm稀釋該混合物并用0.3mhcl(75ml)、水(75ml)和10％的k2co3(75ml)清洗。用dcm(25ml)反萃取所有水相洗液。在無(wú)水mgso4上干燥有機(jī)相，過(guò)濾并在真空中濃縮。通過(guò)用dcm/meoh梯度的硅膠色譜純化獲得(z)-((((2-(二甲基氨基)乙基)硫代)羰基)氮烷二基)雙(乙烷-2,1-二基)二油酸酯(1.90g)。制備hetu104do在密封系統(tǒng)中，加入與2-溴乙醇(370ul，5.22毫摩爾)組合的(z)-((((2-(二甲基氨基)乙基)硫代)羰基)氮烷二基)雙(乙烷-2,1-二基)二油酸酯(615mg，0.804毫摩爾)。用惰性氣體沖洗該反應(yīng)小管然后密封。將該反應(yīng)加熱至75℃，并讓其過(guò)夜攪拌，然后冷卻并真空濃縮。通過(guò)具有dcm/meoh梯度的硅膠色譜純化獲得2-((雙(2-(油?；趸?乙基)氨甲?；?硫代)-n-(2-羥乙基)-n,n-二甲基乙胺鎓溴化物(473mg)。lcmsesi+：m/z809.8(m+h)。實(shí)施例14：合成dope-glu-va制備(z)-(2r)-3-(((2-(5-(((2e,4e,6e,8e)-3,7-二甲基-9-(2,6,6-三甲基環(huán)己-1-烯-1-基)九碳-2,4,6,8-四烯-1-基)氧基)-5-氧代戊氨基)乙氧基)(羥基)磷?；?氧基)丙烷-1，2-二基二油酸酯(dope-glu-va)制備中間體1：5-(((2e,4e,6e,8e)-3,7-二甲基-9-(2,6,6-三甲基環(huán)己-1-烯-1-基)九碳-2,4,6,8-四烯-1-基)氧基)-5-氧代戊酸在琥珀色的小瓶中，將戊二酸酐(220mg，1.93毫摩爾)和視黃醇(500mg，1.75毫摩爾)溶解在二氯甲烷(5ml)中。加入三乙胺(513ul，3.68毫摩爾)并用氬氣沖洗該小管。讓反應(yīng)混合物在室溫下攪拌4小時(shí)。濃縮該材料并通過(guò)用二氯甲烷/甲醇梯度的硅膠色譜純化。集中級(jí)分并濃縮以獲得淡黃色油(700mg)。通過(guò)nmr核實(shí)產(chǎn)品。制備dope-glu-va：(z)-(2r)-3-(((2-(5-(((2e,4e,6e,8e)-3,7-二甲基-9-(2,6,6-三甲基環(huán)己-1-烯-1-基)九碳-2,4,6,8-四烯-1-基)氧基)-5-氧代戊酰氨基)乙氧基)(羥基)磷?；?氧基)丙烷-1,2-二基二油酸酯在用氬氣沖洗的琥珀色的小管中將1,2-二油酰基-sn-甘油基-3-磷酸乙醇胺(500mg，0.672毫摩爾)，n,n,n’,n’-四甲基-o-(7-氮雜苯并三唑-1-基)脲六氟磷酸鹽(306.5mg，0.806毫摩爾)和5-(((2e,4e,6e,8e)-3,7-二甲基-9-(2,6,6-三甲基環(huán)己-1-烯-1-基)九碳-2,4,6,8-四烯-1-基)氧基)-5-氧代戊酸(269mg，0.672毫摩爾)溶解在氯仿/dmf(10ml，1:1的混合物)中并加入n,n-二異丙基乙胺(300ul，1.68毫摩爾)。讓反應(yīng)混合物在室溫下過(guò)夜攪拌。濃縮該反應(yīng)混合物，然后通過(guò)用二氯甲烷/甲醇梯度的硅膠色譜純化。收集級(jí)分并濃縮以獲得淡黃色油(460mg，61％)。通過(guò)nmr核實(shí)產(chǎn)品。1hnmr(400mhz),δh：8.6(d,1h),8.27(d,1h),6.57-6.61(dd,1h),6.08-6.25(m,4h),5.57(t,1h),5.30-5.34(m,4h),5.18(m,1h),4.68-4.70(d,2h),4.28-4.35(m,1h),4.05-4.15(m,1h),3.81-3.97(m,4h),3.52-3.62(m,1h),3.35-3.45(m,2h),2.95-3.05(m,1h),2.33-2.35(t,3h),2.2-2.3(m,7h),1.9-2.05(m,17h),1.85(s,3h),1.69(s,3h),1.5-1.65(m,6h),1.4-1.5(m,2h),1.18-1.38(m,～40h),1.01(s,3h),0.84-0.88(m,12h).實(shí)施例15：dope-glu-nh-va制備(z)-(2r)-3-(((2-(4-((2e,4e,6e,8e)-3,7-二甲基-9-(2,6,6-三甲基環(huán)己-1-烯-1-基)九碳-2,4,6,8-四烯酰氨基)丁酰氨基)乙氧基)(羥基)磷?；?氧基)丙烷-1,2-二基二油酸酯(dope-glu-nh-va)制備中間體1：(z)-(2r)-3-(((2-(4-氨基丁酰氨基)乙氧基)(羥基)磷酰基)氧基)丙烷-1,2-二基二油酸酯將1,2-二油?；?sn-甘油基-3-磷酸乙醇胺(2500mg，3.36毫摩爾)，boc-gaba-oh(751mg，3.70毫摩爾)和n,n,n’,n’-四甲基-o-(7-氮雜苯并三唑-1-基)脲六氟磷酸鹽(1531mg，4.03毫摩爾)溶解在dmf/氯仿(25ml，1:1的混合物)中。加入n,n-二異丙基乙胺(880ul，5.05毫摩爾)并讓該混合物在室溫氬氣層下過(guò)夜。用～200ml水稀釋反應(yīng)混合物，并用二氯甲烷(3x100ml)萃取產(chǎn)物。用～75ml的ph4.0的pbs緩沖液清洗產(chǎn)物，用硫酸鈉干燥有機(jī)物，過(guò)濾并濃縮。然后通過(guò)用二氯甲烷/甲醇梯度的硅膠色譜純化材料，并濃縮獲得無(wú)色油(2.01g，64％)。通過(guò)nmr核實(shí)產(chǎn)品。然后在30ml的2mhcl/二乙醚中吸收該材料。讓反應(yīng)在室溫下水浴中攪拌。2小時(shí)后，濃縮該溶液以獲得(z)-(2r)-3-(((2-(4-氨基丁酰氨基)乙氧基)(羥基)磷?；?氧基)丙烷-1,2-二基二油酸酯。制備dope-glu-nh-va：(z)-(2r)-3-(((2-(4-((2e,4e,6e,8e)-3,7-二甲基-9-(2,6,6-三甲基環(huán)己-1-烯-1-基)九碳-2,4,6,8-四烯酰氨基)丁酰氨基)乙氧基)(羥基)磷?；?氧基)丙烷-1,2-二基二油酸酯將(z)-(2r)-3-(((2-(4-氨基丁酰氨基)乙氧基)(羥基)磷?；?氧基)丙烷-1,2-二基二油酸酯(1200mg，1.45毫摩爾)、維甲酸(500mg，1.66毫摩爾)和n,n,n’,n’-四甲基-o-(7-氮雜苯并三唑-1-基)脲六氟磷酸鹽(689mg，1.81毫摩爾)懸浮在dmf/氯仿(10ml，1:1的混合物)中。加入n,n-二異丙基乙胺(758ul，4.35毫摩爾)。用氬氣沖洗圓底燒瓶并覆蓋鋁箔。在室溫下攪拌反應(yīng)混合物4小時(shí)，在二氯甲烷(75ml)和h2o(75ml)中分配，用二氯甲烷萃取，干燥(硫酸鈉)，過(guò)濾并濃縮。通過(guò)使用二氯甲烷/甲醇梯度的硅膠色譜純化獲得(z)-(2r)-3-(((2-(4-((2e,4e,6e,8e)-3,7-二甲基-9-(2,6,6-三甲基環(huán)己-1-烯-1-基)九碳-2,4,6,8-四烯酰氨基)丁酰氨基)乙氧基)(羥基)磷?；?氧基)丙烷-1,2-二基二油酸酯(292mg，18％)。通過(guò)lcms&nmr表征該產(chǎn)品。1hnmr(400mhz),δh：8.55(s,1h),8.2(d,1h),7.3(s,1h),6.6(dd,1h),6.10-6.27(m,5h),5.5(t,1h),5.31(s,4h),5.1-5.2(m,2h),4.68(d,2h),4.3(d,2h),4.1(m,2h),3.9(m,8h),3.58(q,4h),3.4(s,4h),3.0(q,4h),2.33-2.35(t,3h),2.2-2.3(m,7h),1.9-2.05(m,17h),1.85(s,3h),1.69(s,3h),1.5-1.65(m,6h),1.4-1.5(m,2h),1.18-1.38(m,～40h),1.01(s,3h),0.84-0.88(m,12h).ms：m/z1112.44(m+h+).實(shí)施例16：dspe-peg550-va制備(2r)-3-(((((45e,47e,49e,51e)-46,50-二甲基-4,44-二氧代-52-(2,6,6-三甲基環(huán)己-1-烯-1-基)-7,10,13,16,19,22,25,28,31,34,37,40-十二氧雜-3,43-二氮雜五十二烷-45,47,49,51-四烯-1-基)氧基)(羥基)磷酰基)氧基)丙烷-1,2-二基二硬脂酸酯(dspe-peg550-va)制備中間體1：(2r)-3-((((2,2-二甲基-4,44-二氧代-3,8,11,14,17,20,23,26,29,32,35,38,41-十三氧雜-5,45-二氮雜庚四十烷-47-基)氧基)(羥基)磷?；?氧基)丙烷-1,2-二基二硬脂酸酯在用氬氣沖洗的20ml的閃爍管中，將1,2-二硬脂酰-sn-甘油基-3-磷酸乙醇胺(200mg，0.267毫摩爾)，t-boc-n-酰氨基-dpeg12-酸(211mg，0.294毫摩爾)和n,n,n’,n’-四甲基-o-(7-氮雜苯并三唑-1-基)脲六氟磷酸鹽(122mg，0.320毫摩爾)溶解在氯仿/甲醇/h2o(6ml，65:35:8)中。加入n,n-二異丙基乙胺(116ul，0.668毫摩爾)。讓反應(yīng)在25℃攪拌4小時(shí)并濃縮。然后用二氯甲烷/甲醇梯度的硅膠色譜純化材料以獲得作為油(252mg，65％)的(2r)-3-((((2,2-二甲基-4,44-二氧代-3,8,11,14,17,20,23,26,29,32,35,38,41-十三氧雜-5,45-二氮雜庚四十烷-47-基)氧基)(羥基)磷酰基)氧基)丙烷-1,2-二基二硬脂酸酯。制備dspe-peg550-va：(2r)-3-(((((45e,47e,49e,51e)-46,50-二甲基-4,44-二氧代-52-(2,6,6-三甲基環(huán)己-1-烯-1-基)-7,10,13,16,19,22,25,28,31,34,37,40-十二氧雜-3,43-二氮雜五十二烷-45,47,49,51-四烯-1-基)氧基)(羥基)磷酰基)氧基)丙烷-1,2-二基二硬脂酸酯將(2r)-3-((((2,2-二甲基-4,44-二氧代-3,8,11,14,17,20,23,26,29,32,35,38,41-十三氧雜-5,45-二氮雜庚四十烷-47-基)氧基)(羥基)磷?；?氧基)丙烷-1,2-二基二硬脂酸酯(252mg，0.174毫摩爾)溶解在二乙醚(5ml)中。將反應(yīng)置于室溫下的水浴中。加入2mhcl/二乙醚(2ml，4毫摩爾)并讓混合物攪拌約1小時(shí)。然后，在真空中去除溶劑和過(guò)量hcl。在用氬氣沖洗的圓底燒瓶中的2ml的n,n-二甲基甲酰胺中懸浮該材料。加入維甲酸(57.5mg，0.191毫摩爾)、n,n,n’,n’-四甲基-o-(7-氮雜苯并三唑-1-基)脲六氟磷酸鹽(79mg，0.209毫摩爾)和n,n-二異丙基乙胺(106ul，0.609毫摩爾)。材料沒(méi)有完全溶解，所以加入更多的氯仿/甲醇/h2o(1ml，體積比為65:35:8的混合物)以獲得反應(yīng)均一性。3.5小時(shí)之后，濃縮反應(yīng)混合物。然后通過(guò)用二氯甲烷/甲醇梯度的硅膠色譜純化材料以獲得作為褐色固體(210mg，74％)的(2r)-3-(((((45e,47e,49e,51e)-46,50-二甲基-4,44-二氧代-52-(2,6,6-三甲基環(huán)己-1-烯-1-基)-7,10,13,16,19,22,25,28,31,34,37,40-十二氧雜-3,43-二氮雜五十二烷-45,47,49,51-四烯-1-基)氧基)(羥基)磷?；?氧基)丙烷-1,2-二基二硬脂酸酯。通過(guò)nmr&lcms核實(shí)產(chǎn)物。1hnmr(400mhz),δh：8.6(s,1h),8.25(d,1h),6.8-6.9(dd,1h),6.3-6.4(m,1h),6.12-6.25(dd,5h),5.71(s,1h),5.18(m,2h),4.33(dd,2h),4.13(m,2h),3.95(m,2h),3.74(m,8h),3.63(s,～48h),3.0(q,2h),2.5(t,3h),2.35(s,3h),2.25(t,8h),1.97(m,7h),1.7(3,3h),1.5(m,2h),1.36(m,12h),1.23(m,～56h),1.01(s,6h),0.86(t,12h).ms：m/z1630.28(m+h+)。實(shí)施例17：dspe-peg2000-glu-va制備dspe-peg2000-glu-va制備中間體1：5-(((2e,4e,6e,8e)-3,7-二甲基-9-(2,6,6-三甲基環(huán)己-1-烯-1-基)九碳-2,4,6,8-四烯-1-基)氧基)-5-氧代戊酸在琥珀色小管中，將戊二酸酐(115mg，1.01毫摩爾)和視黃醇(240mg，0.838毫摩爾)溶解在二氯甲烷(3ml)中。加入三乙胺(257ul，1.84毫摩爾)并用氬氣沖洗該小管。讓反應(yīng)在室溫下攪拌過(guò)夜。濃縮反應(yīng)混合物，然后通過(guò)用二氯甲烷/甲醇梯度的硅膠色譜純化獲得作為淡黃色油(700mg，78％)的5-(((2e,4e,6e,8e)-3,7-二甲基-9-(2,6,6-三甲基環(huán)己-1-烯-1-基)九碳-2,4,6,8-四烯-1-基)氧基)-5-氧代戊酸。用nmr表征該材料。制備dspe-peg2000-glu-va在用氬氣沖洗的琥珀色閃爍管中，將5-(((2e,4e,6e,8e)-3,7-二甲基-9-(2,6,6-三甲基環(huán)己-1-烯-1-基)九碳-2,4,6,8-四烯-1-基)氧基)-5-氧代戊酸(43mg，0.108毫摩爾)，dspe-peg2000-nh2(250mg，0.090毫摩爾)和n,n,n’,n’-四甲基-o-(7-氮雜苯并三唑-1-基)脲六氟磷酸鹽(45mg，0.117毫摩爾)溶解在n,n-二甲基甲酰胺(2ml)中。加入n,n-二異丙基乙胺(47ul，0.270毫摩爾)，讓反應(yīng)在室溫下攪拌過(guò)夜，然后通過(guò)用二氯甲烷/甲醇梯度的硅膠色譜純化以獲得淡黃色油(59mg，20.7％)。通過(guò)nmr核實(shí)產(chǎn)物。1hnmr(400mhz),δh：706(m,1h),6.59-6.66(dd,1h),6.06-6.30(m5h),5.56-5.60(t,1h),5.17-5.23(m,2h),4.35-4.42(dd,2h),4.12-4.25(m,5h),3.96-3.97(m,6h),3.79-3.81(t,1h),3.66(m,～180h),3.51-3.58(m,2h),3.4-3.48(m,4h),3.3-3.38(m,2h),2.25-2.45(m,14h),1.5-2.0(m,15h),1.23-1.32(m,～56h),1.01(s,3h),0.85-0.88(t,12h)。實(shí)施例18：dope-gly3-va制備(z)-(2r)-3-(((((14e,16e,18e,20e)-15,19-二甲基-4,7,10,13-四氧代-21-(2,6,6-三甲基環(huán)己-1-烯-1-基)-3,6,9,12-四氮雜二十一碳-14,16,18,20-四烯-1-基)氧基)(羥基)磷酰基)氧基)丙烷-1,2-二基二油酸酯(dope-gly3-va)制備中間體1：(z)-(2r)-3-(((2-(2-(2-(2-氨基乙酰氨基)乙酰氨基)乙酰氨基)乙氧基)(羥基)磷?；?氧基)丙烷-1,2-二基二油酸酯將boc-gly-gly-gly-oh(382mg，1.34毫摩爾)和n,n,n’,n’-四甲基-o-(7-氮雜苯并三唑-1-基)脲六氟磷酸鹽(532mg，1.4毫摩爾)溶解在dmf(5ml)中。加入n,n-二異丙基乙胺(488ul，2.8毫摩爾)并讓該混合物在室溫下攪拌10-15分鐘。然后加入1,2-二油?；?sn-甘油基-3-磷酸乙醇胺(833mg，1.12毫摩爾)在氯仿(5ml)中的溶液并用氬氣沖洗該反應(yīng)管。室溫下16小時(shí)候，濃縮反應(yīng)混合物并在二氯甲烷(50ml)和h2o(50ml)之間分配，用二氯甲烷(3x50ml)萃取，用硫酸鈉干燥，過(guò)濾并濃縮。通過(guò)用二氯甲烷/甲醇梯度的硅膠色譜純化該材料獲得無(wú)色油狀殘余物。向其中加入2mhcl/二乙醚(5ml)，讓該反應(yīng)婚外在水浴中攪拌約2小時(shí)。濃縮該反應(yīng)混合物，用二氯甲烷(75ml)吸收殘余物，用飽和的碳酸氫鈉溶液(75ml)清洗，用二氯甲烷(3x75ml)萃取產(chǎn)品，用硫酸鈉干燥，過(guò)濾并濃縮以獲得作為半固體的(765mg，90％)(z)-(2r)-3-(((2-(2-(2-(2-氨基乙酰氨基)乙酰氨基)乙酰氨基)乙氧基)(羥基)磷酰基)氧基)丙烷-1,2-二基二油酸酯。通過(guò)nmr核實(shí)。制備dope-gly3-va：(z)-(2r)-3-(((((14e,16e,18e,20e)-15,19-二甲基-4,7,10,13-四氧代-21-(2,6,6-三甲基環(huán)己-1-烯-1-基)-3,6,9,12-四氮雜二十一碳-14,16,18,20-四烯-1-基)氧基)(羥基)磷酰基)氧基)丙烷-1,2-二基二油酸酯將(z)-(2r)-3-(((2-(2-(2-(2-氨基乙酰氨基)乙酰氨基)乙酰氨基)乙氧基)(羥基)磷?；?氧基)丙烷-1,2-二基二油酸酯(765mg，0.836毫摩爾)、維甲酸(301mg，1.00毫摩爾)、和n,n,n’,n’-四甲基-o-(7-氮雜苯并三唑-1-基)脲六氟磷酸鹽(413mg，1.09毫摩爾)懸浮在n,n-二甲基甲酰胺(5ml)中。加入n,n-二異丙基乙胺(437ul，2.51毫摩爾)，并用氬氣沖洗該反應(yīng)小管。在材料溶劑化中將氯仿(5ml)加入酸中。在覆蓋了鋁箔的圓底燒瓶中讓反應(yīng)在室溫下攪拌～4小時(shí)。在h2o(100ml)和二氯甲烷(100ml)之間分配材料。用二氯甲烷(3x100ml)萃取，用硫酸鈉干燥，過(guò)濾并濃縮。然后通過(guò)用二氯甲烷/甲醇梯度的硅膠色譜純化材料獲得作為橙色油(704mg，70％)的(z)-(2r)-3-(((((14e,16e,18e,20e)-15,19-二甲基-4,7,10,13-四氧代-21-(2,6,6-三甲基環(huán)己-1-烯-1-基)-3,6,9,12-四氮雜二十一碳-14,16,18,20-四烯-1-基)氧基)(羥基)磷?；?氧基)丙烷-1,2-二基二油酸酯。通過(guò)lcms&nmr核實(shí)產(chǎn)品。1hnmr(400mhz),δh：6.90(t,1h),6.21(q,2h),6.08-6.12(d,2h),5.83(s,1h),5.31(s,4h),5.30(s,2h),4.37(d,1h),4.15(m,1h),3.91(m,8h),3.59(m,2h),3.29(m,2h),3.01(m,2h),2.28(m,6h),1.95-1.98(m,12h),1.44(s,3h),1.5-1.6(m,2h),1.44(m,6h),1.24(m,～48h),1.00(s,6h),0.86(t,3h)。ms：m/z1198.42(m+h+)。實(shí)施例19：va-peg-va制備n1,n19-雙((16e,18e,20e,22e)-17,21-二甲基-15-氧代-23-(2,6,6-三甲基環(huán)己-1-烯-1-基)-4,7,10-三氧雜-14-氮雜二十三碳-16,18,20,22-四烯-1-基)-4,7,10,13,16-五氧雜十九烷-1,19-二酰胺(va-peg-va)制備va-peg-va：n1,n19-雙((16e,18e,20e,22e)-17,21-二甲基-15-氧代-23-(2,6,6-三甲基環(huán)己-1-烯-1-基)-4,7,10-三氧雜-14-氮雜二十三碳-16,18,20,22-四烯-1-基)-4,7,10,13,16-五氧雜十九烷-1,19-二酰胺將維甲酸(2913mg，9.70毫摩爾)、n,n,n’,n’-四甲基-o-(7-氮雜苯并三唑-1-基)脲六氟磷酸鹽(3992mg，10.50毫摩爾)和二酰氨基-dpeg11-二胺(3000mg，4.04毫摩爾)懸浮在n,n-二甲基甲酰胺(10ml)中。加入n,n-二異丙基乙胺(4222μl，24.24毫摩爾)，并用氬氣沖洗該小管。在覆蓋了鋁箔的圓底燒瓶中讓反應(yīng)在室溫下攪拌過(guò)夜。第二天，在乙酸乙酯(125ml)和水(125ml)之間分配材料。用乙酸乙酯(3x125ml)萃取，用硫酸鈉干燥，過(guò)濾并濃縮。然后通過(guò)用二氯甲烷/甲醇梯度的硅膠色譜純化材料。收集級(jí)分并濃縮獲得黃色油(2900mg，54.9％)。通過(guò)lcms&nmr核實(shí)產(chǎn)品。1hnmr(400mhz),δh：7.1(s,2h),6.87(t,2h),6.51(t,2h),6.12-6.20(dd,8h),5.66(s,2h),3.6-3.8(m,～44h),3.4(q,4h),3.3(q,4h),2.46(t,4h),2.32(s,6h),1.9-2.05(m,10h),1.7-1.85(m,15h),1.6(m,4h),1.3-1,5(m,6h),1.01(s,12h)。qtofms：m/z1306(m+h+)。實(shí)施例20：va-peg2000-va制備(2e,2'e,4e,4'e,6e,6'e,8e,8'e)-n,n'-(3,6,9,12,15,18,21,24,27,30,33,36,39,42,45,48,51,54,57,60,63,66,69,72,75,78,81,84,87,90,93,96,99,102,105,108,111,114,117,120,123,126,129,132,135,138-六四十氧雜四十碳庚烷(hectane)-1,140-二基)雙(3,7-二甲基-9-(2,6,6-三甲基環(huán)己-1-烯-1-基)九碳-2,4,6,8-四烯酰氨基)(va-peg2000-va)制備va-peg2000-va：(2e,2'e,4e,4'e,6e,6'e,8e,8'e)-n,n'-(3,6,9,12,15,18,21,24,27,30,33,36,39,42,45,48,51,54,57,60,63,66,69,72,75,78,81,84,87,90,93,96,99,102,105,108,111,114,117,120,123,126,129,132,135,138-六四十碳氧雜四十庚烷(hectane)-1,140-二基)雙(3,7-二甲基-9-(2,6,6-三甲基環(huán)己-1-烯-1-基)九碳-2,4,6,8-四烯酰氨基)將維甲酸(109mg，0.362毫摩爾)，n,n,n’,n’-四甲基-o-(7-氮雜苯并三唑-1-基)脲六氟磷酸鹽(149mg，0.392毫摩爾)和胺-peg2k-胺(333mg，0.151毫摩爾)懸浮在n,n-二甲基甲酰胺(3ml)中。加入n,n-二異丙基乙胺(158μl，0.906毫摩爾)，并用氬氣沖洗該管。在覆蓋了鋁箔的圓底燒瓶中讓反應(yīng)在室溫下攪拌過(guò)夜。第二天，在乙酸乙酯(30ml)和水(30ml)之間分配材料。用乙酸乙酯(3x125ml)萃取，用硫酸鈉干燥，過(guò)濾并濃縮。然后通過(guò)用二氯甲烷/甲醇梯度的硅膠色譜純化材料。收集級(jí)分并濃縮獲得作為黃色油(97mg，23％)的(2e,2'e,4e,4'e,6e,6'e,8e,8'e)-n,n'-(3,6,9,12,15,18,21,24,27,30,33,36,39,42,45,48,51,54,57,60,63,66,69,72,75,78,81,84,87,90,93,96,99,102,105,108,111,114,117,120,123,126,129,132,135,138-六四十碳氧雜四十碳庚烷(hectane)-1,140-二基)雙(3,7-二甲基-9-(2,6,6-三甲基環(huán)己-1-烯-1-基)九碳-2,4,6,8-四烯酰氨基)。通過(guò)lcms&nmr核實(shí)產(chǎn)物。1hnmr(400mhz),δh：6.85-6.92(t,2h),6.20-6.32(m,6h),6.08-6.12(d,4h),5.72(s,2h),3.55-3.70(m,～180h),3.4-3.5(m,4h),2.79(m,4h),2.78(s,6h),2.33(s,6h),2.05(m,4h),1.97(s,6h),1.80(m,2h),1.79(s,6h),1.69(s,6h),1.60(m,4h),1.45(m,4h),1.01(s,12h)。qtofms：m/z2651(m+h+)。實(shí)施例21：dspe-peg2000-va制備dspe-peg2000-va將dspe-peg2000-nh2(250mg，0.090毫摩爾)、維甲酸(33mg，0.108毫摩爾)和n,n,n’,n’-四甲基-o-(7-氮雜苯并三唑-1-基)脲六氟磷酸鹽(45mg，0.117毫摩爾)溶解在n,n-二甲基甲酰胺中。將n,n-二異丙基乙胺(47μl，0.270毫摩爾)加入混合物中。用氬氣沖洗該琥珀色的閃爍管，并讓其在室溫下攪拌3天。然后通過(guò)用二氯甲烷/甲醇梯度的硅膠色譜純化材料。收集級(jí)分并濃縮以獲得作為黃色油(245mg，89％)的dspe-peg2000-va。通過(guò)nmr核實(shí)產(chǎn)物。1hnmr(400mhz),δh：6.86(dd,1h),6.25(m,1h),6.09-6.21(dd,4h),5.71(s,1h),5.1-5.2(m,1h),4.3-4.4(d,1h),4.1-4.2(m,3h),3.85-4.0(m,4h),3.8(t,1h),3.5-3.75(m,～180h),3.4-3.5(m,8h),3.3(m,2h),2.35(s,3h),2.26(m,4h),1.70(s,3h),1.55-1.65(m,6h),1.47(m,2h),1.23(s,～60h),1.01(s,6h),0.85(t,6h)。實(shí)施例22：diva-peg-diva，也已知為“diva”制備n1,n19-雙((s,23e,25e,27e,29e)-16-((2e,4e,6e,8e)-3,7-二甲基-9-(2,6,6-三甲基環(huán)-己-1-烯-1-基)九碳-2,4,6,8-四烯酰氨基(四烯酰氨基))-24,28-二甲基-15,22-二氧代-30-(2,6,6-三甲基環(huán)己-1-烯-1-基)-4,7,10-三氧雜-14,21-二氮雜三十碳-23,25,27,29-四烯-1-基)-4,7,10,13,16-五氧雜十九烷-1,19-二酰胺(diva)制備中間體1：四芐基((5s,57s)-6,22,40,56-四氧代-11,14,17,25,28,31,34,37,45,48,51-十一氧雜-7,21,41,55-四氮雜六十烷(tetraazahenhexacontance)-1,5,57,61-四基)四氨基甲酸酯，也已知為z-diva-peg-diva-in用氮?dú)獯祾呃鋮s至5-10℃的1l的反應(yīng)燒瓶，并填充二氯甲烷(300ml)、d-peg-11-二胺(量批次(quantalot)ek1-a-1100-010，50.0g，0.067mol)、z-(l)-lys(z)-oh(61.5g，0.15mol)、和hobt水合物(22.5g，0.15mol)。將4-甲基嗎啉(4-mmp)(15.0g，0.15mol)加入該懸浮液中，觀察到稍放熱的反應(yīng)。在30分鐘時(shí)間里將edc鹽酸鹽(43.5g，0.23mol)和4-mmp(20.0g，0.20mol)在二氯甲烷(150ml)中的懸浮液加入，并需要適度冷卻以保持溫度在20-23℃。在環(huán)境溫度下過(guò)夜攪拌稍混濁的溶液，hplc顯示反應(yīng)完全。加入去離子水(300ml)，在攪拌10分鐘之后，觀察到快速的相分離。用二氯甲烷(150ml)萃取水相–具有稍微較慢的相分離。用6％碳酸氫鈉(300ml)清洗合并的有機(jī)萃取物，并用硫酸鎂(24g)干燥。減壓下從40-45℃的水浴蒸發(fā)得到132g粗產(chǎn)物。將粗產(chǎn)物(131g)在8％甲醇的乙酸乙酯中的溶液裝至硅膠60柱(40-63μ)，其裝填有8％甲醇的乙酸乙酯。用8％甲醇的乙酸乙酯(7.5l)洗脫該柱。減壓下將充分含有純產(chǎn)物的級(jí)分(5.00-7.25l)從45℃的水浴蒸發(fā)，83.6g純化的產(chǎn)物。將純化的產(chǎn)物(83.6g)在二氯甲烷(200ml)中的溶液裝至已用二氯甲烷(250ml)沖洗的dowex650c柱(h+)(200g)。用二氯甲烷(200ml)洗脫該柱。用硫酸鎂(14g)干燥含有級(jí)分的合并的產(chǎn)物(300-400ml)，并在減壓下從45℃的水浴蒸發(fā)以獲得四芐基((5s,57s)-6,22,40,56-四氧代-11,14,17,25,28,31,34,37,45,48,51-十一氧雜-7,21,41,55-四氮雜六十烷(tetraazahenhexacontance)-1,5,57,61-四基)四氨基甲酸酯，也已知為z-diva-peg-diva-in(77.9g，hplc純度94.1％)。制備中間體2：n1,n19-雙((s)-16,20-二氨基-15-氧代-4,7,10-三氧雜-14-氮雜二十基)-4,7,10,13,16-五氧雜十九烷-1,19-二酰胺，也稱(chēng)為diva-peg-diva-in用氮?dú)獯祾?l的反應(yīng)燒瓶，并裝入甲醇(600ml)和z-diva-peg-diva-in(92.9,60.5毫摩爾)。在氮?dú)庀聰嚢柙摶旌衔镏敝莲@得溶液。加入催化劑10％pd/c/50％水(aldrich，10g)。將混合物排出，然后用氮?dú)饩鈮毫?。將混合物排出，然后用氫氣均衡壓力。確保在反應(yīng)混合物上有穩(wěn)定的低氫氣流，開(kāi)始攪拌。在氫氣流中持續(xù)氫化一小時(shí)。然后關(guān)閉該系統(tǒng)，并在～0.1bar持續(xù)氫化1小時(shí)。將混合物排出，然后用氫氣再加壓至～0.1bar。在另一小時(shí)的氫化之后，排出混合物，然后用氫氣再加壓至0.1bar。繼續(xù)在氫氣下的攪拌15小時(shí)，此后通過(guò)hplc不能檢測(cè)到任何原材料。將混合物排出，然后用氮?dú)饩鈮毫?。將混合物排出，然后用氫氣均衡壓力。然后在硅藻?45墊上過(guò)濾反應(yīng)混合物。用甲醇(100ml)清洗濾餅。最后在45℃和低于50mbar的壓力濃縮合并的濾液。加入甲苯(100ml)，最后在45℃和低于40mbar的壓力再次濃縮所得的混合物以獲得n1,n19-雙((s)-16,20-二氨基-15-氧代-4,7,10-三氧雜-14-氮雜二十基)-4,7,10,13,16-五氧雜十九烷-1,19-二酰胺，也已知為diva-peg-diva-in(63.4g)，其作為靜置將固化的油。制備diva-peg-diva：n1,n19-雙((s,23e,25e,27e,29e)-16-((2e,4e,6e,8e)-3,7-二甲基-9-(2,6,6-三甲基環(huán)己-1-烯-1-基)九碳-2,4,6,8-四烯酰氨基)-24,28-二甲基-15,22-二氧代-30-(2,6,6-三甲基環(huán)己-1-烯-1-基)-4,7,10-三氧雜-14,21-二氮雜三十碳-23,25,27,29-四烯-1-基)-4,7,10,13,16-五氧雜十九烷-1,19-二酰胺將2l的反應(yīng)器填充氬氣，并加入二氯甲烷(500ml)、diva-peg-diva-in(52.3g，52.3毫摩爾)、維甲酸(70.6g，235毫摩爾)和4-n,n-二甲基氨基吡啶(2.6g，21.3毫摩爾)。在氬氣下攪拌該混合物直至溶解(～20分鐘)。將反應(yīng)溫度保持在10-20℃，在10-15分鐘的時(shí)間里分次加入1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亞胺)(edci)(70.6g，369毫摩爾)(在前30-60分鐘該反應(yīng)稍微放熱)。用鋁箔覆蓋該反應(yīng)器，并讓混合物在18-21℃攪拌15-20小時(shí)。加入丁基化的羥基甲苯(bht)(25mg)，然后在該混合物上保持氬氣氛圍的同時(shí)將該反應(yīng)混合物倒至6％的碳酸氫鈉水溶液(500ml)。分離有機(jī)相。用二氯甲烷(50ml)清洗水相。在惰性氛圍下并避光，用硫酸鎂(150g)干燥合并的有機(jī)相。過(guò)濾(優(yōu)選加壓過(guò)濾)去除干燥劑并用二氯甲烷(500ml)清洗濾餅。在減壓下用35-40℃水浴通過(guò)蒸發(fā)濃縮濾液。向油狀殘余物中加入甲苯(150ml)并再次蒸發(fā)以獲得210g半固體殘余物。將殘余物溶解在二氯甲烷(250ml)中并加至從硅膠60(1.6kg)和0.5％甲醇的二氯甲烷制備的柱子上(4l)。用二氯甲烷(7.2l)，2)，3％甲醇的二氯甲烷(13l)、5％甲醇的二氯甲烷(13l)、10％甲醇的二氯甲烷(18l)洗脫該柱子。取一個(gè)10l的級(jí)分，然后取2.5l的級(jí)分。對(duì)避光的級(jí)分進(jìn)行取樣、用氬氣沖洗然后密封。用tlc(10％甲醇的二氯甲烷，uv)分析所取的級(jí)分。包含diva-peg-diva的級(jí)分進(jìn)一步用hplc分析。以相同方式再純化純度<85％的5級(jí)分(給予32g蒸發(fā)殘余物)，只是用硅膠和溶劑的原始量的25％。合并通過(guò)hplc純度>85％的級(jí)分并在減壓下使用35-40℃的水浴蒸發(fā)。將蒸發(fā)殘余物(120g)再溶解在二氯甲烷(1.5l)中并緩慢(約1小時(shí))地通過(guò)從離子交換dowex650c，h+形式(107g)制備的柱子。然后用二氯甲烷(1l)沖洗柱子。將合并的洗脫物(3277.4g)混合均勻并蒸發(fā)一個(gè)樣品(25ml，33.33g)，最后在室溫和<0.1mbar的壓力下獲得0.83g的泡饃。因此從該圖可計(jì)算固體材料的總量產(chǎn)量為80.8g(72.5％)。將剩余的3.24kg溶液濃縮至423g。進(jìn)一步濃縮266g的該溶液以獲得漿料然后再溶解在無(wú)水乙醇(200ml)中。繼續(xù)在減壓下使用35-40℃水浴蒸發(fā)以獲得最終的94.8g的乙醇溶液，其含有50.8g(53.6％w/w)的n1,n19-雙((s,23e,25e,27e,29e)-16-((2e,4e,6e,8e)-3,7-二甲基-9-(2,6,6-三甲基環(huán)己-1-烯-1-基)九碳-2,4,6,8-四烯酰氨基)-24,28-二甲基-15,22-二氧代-30-(2,6,6-三甲基環(huán)己-1-烯-1-基)-4,7,10-三氧雜-14,21-二氮雜三十碳-23,25,27,29-四烯-1-基)-4,7,10,13,16-五氧雜十九烷-1,19-二酰胺，也已知為diva-peg-diva，也已知為“diva”。通過(guò)nmr&qtof表征。1hnmr(400mhz),δh：7.07(t,2h),7.01(t,2h),6.87-6.91(m,4.0h),6.20-6.24(m,10h),6.10-6.13(m,8h),5.79(s,2h),5.71(s,2h),4.4(q,2h),3.70(t,6h),3.55-3.65(m,～34h),3.59(t,6h),3.4(m,2h),3.25-3.33(m,10h),3.16(m,2h),2.44(t,4h),2.33(s,12h),1.97-2.01(m,12h),1.96(s,6h),1.7-1.9(m,12h),1.69(s,12h),1.5-1.65(m,12h),1.35-1.5(m,24h),1.01(s,24h)。qtofmsesi+：m/z2128(m+h+)。實(shí)施例23：dope-va制備(z)-(2r)-3-(((2-((2e,4e,6e,8e)-3,7-二甲基-9-(2,6,6-三甲基環(huán)己-1-烯-1-基)九碳-2,4,6,8-四烯酰氨基)乙氧基)(羥基)磷?；?氧基)丙烷-1,2-二基二油酸酯(dope-va)制備dope-va：(z)-(2r)-3-(((2-((2e,4e,6e,8e)-3,7-二甲基-9-(2,6,6-三甲基環(huán)己-1-烯-1-基)九碳-2,4,6,8-四烯酰氨基)乙氧基)(羥基)磷?；?氧基)丙烷-1,2-二基二油酸酯向在-78℃攪拌的維甲酸(250mg，0.83毫摩爾)在二乙基醚中的溶液(20ml)通過(guò)針筒加入(二乙基氨基)三氟化硫(130μl，0.90毫摩爾)在冷醚(20ml)中的溶液。將反應(yīng)混合物移出冷浴并在室溫下繼續(xù)攪拌2小時(shí)。最后，通過(guò)旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)去除溶劑。在固體na2co3(50mg)存在下將殘余物再溶解于氯仿(50ml)中。向該溶液中加入1,2-二油?；?sn-甘油基-3-磷酸乙醇胺(600mg，0.81毫摩爾)并在室溫下攪拌該反應(yīng)混合物另外24小時(shí)。通過(guò)旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)去除溶劑。通過(guò)用二氯甲烷/甲醇梯度的硅膠色譜純化殘余物獲得z)-(2r)-3-(((2-((2e,4e,6e,8e)-3,7-二甲基-9-(2,6,6-三甲基環(huán)己-1-烯-1-基)九碳-2,4,6,8-四烯酰氨基)乙氧基)(羥基)磷?；?氧基)丙烷-1,2-二基二油酸酯(240mg，28％)。1hnmr(400mhz,cdcl3)0.87(t,6h,ch3),1.01(s,6h,ch3)1.20-1.40(m,40h,ch2),1.40-1.60(m,8h,ch2),1.70(s,3h,ch3-c＝c),1.80-2.10(m,8h),2.32(m,4h,ch2c(＝o)),3.50(m,2h),3.92-4.18(m,5h),4.35(m,2h),5.20(m,1h,nhc(＝o)),5.31(m,4h,ch＝ch),5.80-6.90(m,6h,ch＝ch)。實(shí)施例24：dc-va制備(((2e,4e,6e,8e)-3,7-二甲基-9-(2,6,6-三甲基環(huán)己-1-烯-1-基)九碳-2,4,6,8-四烯酰基(tetraenoyl))氮烷二基)雙(乙烷-2,1-二基)雙十四烷酸酯(dc-va)制備dc-va：(((2e,4e,6e,8e)-3,7-二甲基-9-(2,6,6-三甲基環(huán)己-1-烯-1-基)九碳-2,4,6,8-四烯?；?氮烷二基)雙(乙烷-2,1-二基)雙十四烷酸酯向在-78℃攪拌的維甲酸(600mg，2.0毫摩爾)的二乙醚(25ml)溶液中通過(guò)針筒加入(二乙基氨基)三氟化硫(0.3ml，2.1毫摩爾)在5ml的冷醚中的溶液。將該反應(yīng)混合物移出冷浴，在室溫下繼續(xù)攪拌另外1小時(shí)。通過(guò)旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)將溶劑去除之后，在2固體na2co3(25mg)的存在下將殘余物再次溶解于二氯甲烷(20ml)中。向該溶液中加入氮烷二基雙(乙烷-2,1-二基)雙十四烷酸酯(1.05g，2.0毫摩爾)，并在室溫下攪拌該反應(yīng)混合物另外24小時(shí)。用二氯甲烷(50ml)稀釋反應(yīng)混合物并用mgso4干燥。通過(guò)旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)去除溶劑后，通過(guò)用二氯甲烷/甲醇梯度的硅膠色譜純化殘余物以獲得(((2e,4e,6e,8e)-3,7-二甲基-9-(2,6,6-三甲基環(huán)己-1-烯-1-基)九碳-2,4,6,8-四烯?；?氮烷二基)雙(乙烷-2,1-二基)雙十四烷酸酯(800mg，50％)。1hnmr(400mhz,cdcl3)0.87(t,6h,ch3),1.02(s,6h,ch3)1.20-1.40(m,40h,ch2),1.40-1.60(m,8h,ch2),1.70(s,3h,ch3-c＝c),1.97(s,3h,ch3-c＝c),2.05(m,2h,ch2),2.15(s,3h,ch3-c＝c),2.32(m,4h,ch2c(＝o)),3.67(m,4h,nch2ch2o),4.15-4.30(m,4h,nch2ch2o),5.80-6.90(m,6h,ch＝ch)。實(shí)施例25：dc-6-va制備((6-((2e,4e,6e,8e)-3,7-二甲基-9-(2,6,6-三甲基環(huán)己-1-烯-1-基)九碳-2,4,6,8-四烯酰氨基)己酰)氮烷二基)雙(乙烷-2,1-二基)雙十四烷酸酯(dc-6-va)制備中間體1：((6-氨基己酰)氮烷二基)雙(乙烷-2,1-二基)雙十四烷酸酯tfa鹽將氮烷二基雙(乙烷-2,1-二基)雙十四烷酸酯(2.5g，4.8毫摩爾)、boc-氨基己酸(1.3g，5.6毫摩爾)、n,n’-二環(huán)己基碳二亞胺(1.3g，6.3毫摩爾)和n,n-二異丙基乙胺(2.6ml，0.015毫摩爾)的混合物溶解在吡啶(40ml)中。在60℃過(guò)夜攪拌該溶液。用二氯甲烷(50ml)稀釋該混合物并用鹽水(3x50ml)清洗。用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮之后，用三氟乙酸/二氯甲烷(100ml,1:1)處理殘余物。濃縮混合物并再溶解于二氯甲烷(50ml)中，并用鹽水(3x50ml)清洗。分離有機(jī)層并濃縮以獲得((6-氨基己酰)氮烷二基)雙(乙烷-2,1-二基)雙十四烷酸酯tfa鹽(1.5g，33％)。制備dc-6-va：((6-((2e,4e,6e,8e)-3,7-二甲基-9-(2,6,6-三甲基環(huán)己-1-烯-1-基)九碳-2,4,6,8-四烯酰氨基)己酰)氮烷二基)雙(乙烷-2,1-二基)向在-78°攪拌的維甲酸(800mg，2.67毫摩爾)在二乙醚(40ml)的溶液中通過(guò)針筒加入(二乙基氨基)三氟化硫(0.4ml，22.80毫摩爾)在冷醚(7ml)中的溶液。將該反應(yīng)混合物移出冷浴，在室溫下繼續(xù)攪拌另外1小時(shí)。通過(guò)旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)將溶劑去除之后，在固體na2co3(40mg)的存在下將殘余物再次溶解于二氯甲烷(25ml)中。向該溶液中加入((6-氨基己酰)氮烷二基)雙(乙烷-2,1-二基)雙十四烷酸酯tfa鹽(1.5g，1.6毫摩爾)，并在室溫下攪拌該反應(yīng)混合物另外24小時(shí)。用二氯甲烷(50ml)稀釋反應(yīng)混合物并用mgso4干燥。通過(guò)旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)去除溶劑后，通過(guò)用5％甲醇/二氯甲烷作為洗脫劑的柱層析純化殘余物以獲得((6-((2e,4e,6e,8e)-3,7-二甲基-9-(2,6,6-三甲基環(huán)己-1-烯-1-基)九碳-2,4,6,8-四烯酰氨基)己酰)氮烷二基)雙(乙烷-2,1-二基)(360mg，24％)。1hnmr(400mhz,cdcl3)0.87(t,6h,ch3),1.02(s,6h,ch3)1.20-1.40(m,42h,ch2),1.40-1.60(m,12h,ch2),1.70(s,3h,ch3-c＝c),1.97(s,3h,ch3-c＝c),2.05(m,2h,ch2),2.15(s,3h,ch3-c＝c),2.32(m,6h,ch2c(＝o)),3.20(m,2h,ch2nhc(＝o)),3.56(m,4h,nch2ch2o),4.15-4.30(m,4h,nch2ch2o),5.10(m,1h),5.80-6.90(m,6h,ch＝ch)。實(shí)施例26：合成satdiva制備n1,n19-雙((16s)-16-(3,7-二甲基-9-(2,6,6-三甲基環(huán)己-1-烯-1-基)壬酰氨基)-24,28-二甲基-15,22-二氧代-30-(2,6,6-三甲基環(huán)己-1-烯-1-基)-4,7,10-三氧雜-14,21-二氮雜三十烷基)-4,7,10,13,16-五氧雜十九烷-1,19-二酰胺(satdiva).制備中間體1：3，7-二甲基-9-(2，6，6-三甲基環(huán)己-1-烯-1-基)壬酸將全反式維甲酸(2000mg，6.66毫摩爾)與超聲處理的酸(theaidofsonication)溶解在己烷/ipa(3:1，40ml)中。將材料放入帕爾搖動(dòng)瓶并用惰性氣體沖洗。加入10％的pd/c(200mg)并再次用惰性氣體沖洗該管。將材料放在parr-搖動(dòng)器上過(guò)夜，含有>70psi的氫氣。然后通過(guò)硅藻土墊過(guò)濾該反應(yīng)混合物并濃縮以獲得3,7-二甲基-9-(2,6,6-三甲基環(huán)己-1-烯-1-基)壬酸(2g)。制備satdiva：n1,n19-雙((16s)-16-(3,7-二甲基-9-(2,6,6-三甲基環(huán)己-1-烯-1-基)壬酰氨基)-24,28-二甲基-15,22-二氧代-30-(2,6,6-三甲基環(huán)己-1-烯-1-基)-4,7,10-三氧雜-14,21-二氮雜三十烷基)-4,7,10,13,16-五氧雜十九烷-1,19-二酰胺以與diva-peg-diva相似的方式從上述的n1,n19-雙((s)-16,20-二氨基-15-氧代-4,7,10-三氧雜-14-氮雜二十基)-4,7,10,13,16-五氧雜十九烷-1,19-二酰胺制備n1,n19-雙((16s)-16-(3,7-二甲基-9-(2,6,6-三甲基環(huán)己-1-烯-1-基)壬酰氨基)-24,28-二甲基-15,22-二氧代-30-(2,6,6-三甲基環(huán)己-1-烯-1-基)-4,7,10-三氧雜-14,21-二氮雜三十烷基)-4,7,10,13,16-五氧雜十九烷-1,19-二酰胺，也稱(chēng)作satdiva，用3,7-二甲基-9-(2,6,6-三甲基環(huán)己-1-烯-1-基)壬酸替換全反式維甲酸。qtofmsesi+：m/z2161,2163,2165&2167(m+h+)。實(shí)施例27：合成simdiva制備n1,n19-雙((s)-15,22-二氧代-30-(2,6,6-三甲基環(huán)己-1-烯-1-基)-16-(9-(2,6,6-三甲基環(huán)己-1-烯-1-基)壬酰氨基)-4,7,10-三氧雜-14,21-二氮雜三十烷基)-4,7,10,13,16-五氧雜十九烷-1,19-二酰胺(simdiva).制備中間體1：2，6，6-三甲基環(huán)己-1-烯-1-基三氟甲磺酸酯在氮?dú)庀?78℃向2,2,6-三甲基環(huán)己酮在thf中的溶液滴加2m二異丙酰胺鋰溶液。在-78℃攪拌該混合物3h。然后滴加n-苯基-雙(三氟甲磺酰亞胺)在thf中的溶液(在-78℃)。在干冰中包裹反應(yīng)燒瓶并過(guò)夜攪拌。在室溫下繼續(xù)攪拌3小時(shí)，在該時(shí)間下所有材料溶解。濃縮反應(yīng)混合物，并在劇烈攪拌下將殘余物緩慢加至己烷(350ml)。過(guò)濾去除固體材料并用己烷(2x50ml)清洗。濃縮濾液并加入更多己烷(150ml)。過(guò)濾去除固體材料并濃縮濾液。再重復(fù)所述沉淀一次，之后通過(guò)閃式色譜(硅膠，己烷)純化殘余物以獲得作為無(wú)色油(23.2g，60％產(chǎn)率)的2,6,6-三甲基環(huán)己-1-烯-1-基三氟甲磺酸酯。制備中間體2：9-(溴鋅)壬酸乙酯氮?dú)庀略诟煞磻?yīng)管中裝入鋅粉末(3.70g，56.6毫摩爾)、碘(479mg，1.89毫摩爾)和干dma(20ml)。在室溫下攪拌該混合物直至碘顏色消失。加入乙基9-溴壬酸酯，在80℃攪拌該混合物4小時(shí)，然后在室溫下過(guò)夜。(通過(guò)gcms分析已水解的反應(yīng)混合物確定鋅插入反應(yīng)完成)。不經(jīng)進(jìn)一步處理在隨后的步驟中使用該反應(yīng)混合物。gcmsm/z186[m]+(壬酸乙酯)。制備中間體3：9-(2,6,6-三甲基環(huán)己-1-烯-1-基)壬酸乙酯向反應(yīng)管中氮?dú)庀略诙谆阴０分械膭傊苽涞囊一?9-(溴鋅)壬酸酯(37.7毫摩爾)中加入2,6,6-三甲基環(huán)己-1-烯-1-基三氟甲磺酸酯(10.8g，39.6毫摩爾)，然后加入四(三氟化硫苯基膦)鈀(0)(872mg，0.754毫摩爾)。密封該管并在95℃攪拌該混合物2小時(shí)。讓反應(yīng)混合物冷卻然后倒入二乙醚(100ml)中。將上層到處，并用二乙醚(2x25ml)清洗下層兩次。用飽和的nh4cl和鹽水清洗合并的醚層，干燥(mgso4)并濃縮以獲得粗材料(～12g)。通過(guò)閃式色譜(硅膠，0至1.5％etoac在己烷中)純化該材料。在真空下攪拌所得的油8小時(shí)以去除大部分副產(chǎn)物壬酸乙酯，然后通過(guò)第二閃式色譜(硅膠，0至15％的甲苯在己烷中)純化。由lcms和gcms分析級(jí)分。收集最純的級(jí)分并在25℃以下的溫度下濃縮以獲得作為無(wú)色油(6.16g，兩步產(chǎn)率為53％)的乙基9-(2,6,6-三甲基環(huán)己-1-烯-1-基)壬酸酯。lcmsesi+m/z309[m+h]+；gcmsm/z308[m]+。制備中間體4：9-(2,6,6-三甲基環(huán)己-1-烯-1-基)壬酸向在乙醇(80ml)中的乙基9-(2,6,6-三甲基環(huán)己-1-烯-1-基)壬酸酯(13.2g，42.9毫摩爾)加入4mkoh(43ml)。在室溫下攪拌混合物1.5小時(shí)。加入水(350ml)并將溶液用叔丁基甲基醚(2x100ml)清洗。將水相simva冷卻，用4mhcl(～45ml)酸化，并用戊烷(3x100ml)萃取。用水(200ml)清洗合并的戊烷萃取液，干燥(mgso4)，過(guò)濾，濃縮并在高真空下干燥。將該材料再溶解于戊烷(100ml)中，濃縮并在高真空下再干燥一次以獲得作為無(wú)色油(11.1g，92％產(chǎn)率)的9-(2,6,6-三甲基環(huán)己-1-烯-1-基)壬酸。msesi-m/z279[m-h]-。制備simdiva：n1,n19-雙((s)-15,22-二氧代-30-(2,6,6-三甲基環(huán)己-1-烯-1-基)-16-(9-(2,6,6-三甲基環(huán)己-1-烯-1-基)壬酰氨基)-4,7,10-三氧雜-14,21-二氮雜三十烷基)-4,7,10,13,16-五氧雜十九烷-1,19-二酰胺。從前述的n1,n19-雙((s)-16,20-二氨基-15-氧代-4,7,10-三氧雜-14-氮雜二十基)-4,7,10,13,16-五氧雜十九烷-1,19-二酰胺可以與diva相似的方式制備simdiva，將全反式維甲酸替換為9-(2,6,6-三甲基環(huán)己-1-烯-1-基)壬酸。qtofmsesi+：m/z2050(m+h+)實(shí)施例28：合成diva-peg18制備(2e,2'e,2”e,4e,4'e,4”e,6e,6'e,6”e,8e,8'e,8”e)-n,n',n”-((5r,69r,76e,78e,80e,82e)-77,81-二甲基-6,68,75-三氧代-83-(2,6,6-三甲基環(huán)己-1-烯-1-基)-10,13,16,19,22,25,28,31,34,37,40,43,46,49,52,55,58,61,64-十九氧雜-7,67,74-三氮雜三氟化硫八十-76,78,80,82-四烯-1,5,69-三基)三(3,7-二甲基-9-(2,6,6-三甲基環(huán)己-1-烯-1-基)九碳-2,4,6,8-四烯酰氨基)(diva-peg18).以與diva類(lèi)似的方式制備(2e,2'e,2”e,4e,4'e,4”e,6e,6'e,6”e,8e,8'e,8”e)-n,n',n”-((5r,69r,76e,78e,80e,82e)-77,81-二甲基-6,68,75-三氧代-83-(2,6,6-三甲基環(huán)己-1-烯-1-基)-10,13,16,19,22,25,28,31,34,37,40,43,46,49,52,55,58,61,64-十九氧雜-7,67,74-三氮雜三氟化硫八十-76,78,80,82-四烯-1,5,69-三基)三(3,7-二甲基-9-(2,6,6-三甲基環(huán)己-1-烯-1-基)九碳-2,4,6,8-四烯酰氨基)，也已知為diva-peg18，將peg18二胺替換為二酰氨基-dpeg11-二胺。lcmsesi+：m/z2305(m+na)。實(shí)施例29：合成triva制備triva不能生成此結(jié)構(gòu)的名稱(chēng)制備中間體1：(s)-甲基-6-(((芐氧基)羰基)氨基)-2-((s)-2,6-雙(((芐氧基)羰基)氨基)己酰氨基)己酸酯用惰性氣體吹掃燒瓶，并將h-lys(z)-ome的hcl鹽(4g，12.1mmol)、hobt水合物(1.84g，13.6毫摩爾)、z-lys(z)-oh(5.64g，13.6mmol)懸浮在二氯甲烷(50ml)中。將nmm(1.5ml，13.6mmol)加至該懸浮液中，該溶液變得澄清。在10分鐘的時(shí)間里加入edchcl鹽(4.01g，20.9毫摩爾)和nmm(2.0ml，18.2毫摩爾)在二氯甲烷(50ml)中的懸浮液。室溫下過(guò)夜攪拌該反應(yīng)，然后用1mhcl(100ml)、h2o(100ml)、飽和的碳酸氫鹽溶液(100ml)和飽和的鹽溶液(100ml)清洗。用二氯甲烷(50ml)反萃取所有水相。用na2so4干燥有機(jī)物、過(guò)濾并濃縮。通過(guò)用二氯甲烷/甲醇梯度的硅膠色譜純化材料以獲得(s)-甲基6-(((芐氧基)羰基)氨基)-2-((s)-2,6-雙(((芐氧基)羰基)氨基)己酰氨基)己酸酯(6.91g)。制備中間體2：(s)-6-(((芐氧基)羰基)氨基)-2-((s)-2,6-雙(((芐氧基)羰基)氨基)己酰氨基)己酸將6-(((芐氧基)羰基)氨基)-2-((s)-2,6-雙(((芐氧基)羰基)氨基)己酰氨基)己酸酯(6.91g，10mmol)用甲醇(50ml)溶解。加入koh(2.24g，40mmol)并讓混合物在35℃攪拌。2小時(shí)后，通過(guò)加入h2o(200ml)淬滅反應(yīng)并用二乙醚(50ml)清洗混合物。然后，用1m的hcl酸調(diào)整ph至～2。用二氯甲烷(3x100ml)萃取產(chǎn)物，用na2so4干燥，過(guò)濾并濃縮以獲得(s)-6-(((芐氧基)羰基)氨基)-2-((s)-2,6-雙(((芐氧基)羰基)氨基)己酰氨基)己酸(4g)。制備中間體3：(cbz)6-保護(hù)的n1,n19-雙((16s,19s)-19,23-二氨基-16-(4-氨基丁基)-15,18-二氧代-4,7,10-三氧雜-14,17-二氮雜二十三烷基)-4,7,10,13,16-五氧雜十九烷-1,19-二酰胺用惰性氣體沖洗圓底燒瓶，并將二酰氨基-dpeg11-二胺(1g，1.35mmol)、(s)-6-(((芐氧基)羰基)氨基)-2-((s)-2,6-雙(((芐氧基)羰基)氨基)己酰氨基)己酸(2.05g，3.03毫摩爾)、hobt水合物(409mg，3.03mmol)懸浮在二氯甲烷(25ml)中。將nmm(333ul，3.03毫摩爾)加入懸浮液中，溶液變得澄清。在10分鐘的時(shí)間內(nèi)將edchcl鹽(893mg，4.66毫摩爾)和nmm(445ul，4.05毫摩爾)在二氯甲烷(25ml)中的懸浮液加入。讓反應(yīng)在室溫下過(guò)夜攪拌，然后用1mhcl(100ml)、h2o(100ml)、飽和的碳酸氫鹽溶液(100ml)和飽和的鹽溶液(100ml)清洗。將所有水相洗液用二氯甲烷(50ml)反萃取。用na2so4干燥有機(jī)物，過(guò)濾并濃縮。通過(guò)用二氯甲烷/甲醇梯度的硅膠色譜純化材料以獲得(cbz)6-保護(hù)的n1,n19-雙((16s,19s)-19,23-二氨基-16-(4-氨基丁基)-15,18-二氧代-4,7,10-三氧雜-14,17-二氮雜二十三烷基)-4,7,10,13,16-五氧雜十九烷-1,19-二酰胺(480mg)。制備中間體4：n1,n19-雙((16s,19s)-19,23-二氨基-16-(4-氨基丁基)-15,18-二氧代-4,7,10-三氧雜-14,17-二氮雜二十三烷基)-4,7,10,13,16-五氧雜十九烷-1,19-二酰胺在圓底燒瓶中將(cbz)6-保護(hù)的n1,n19-雙((16s,19s)-19,23-二氨基-16-(4-氨基丁基)-15,18-二氧代-4,7,10-三氧雜-14,17-二氮雜二十三烷基)-4,7,10,13,16-五氧雜十九烷-1,19-二酰胺溶解于甲醇(30ml)中并用惰性氣體沖洗。加入10％pd/c(135mg)并再次用惰性氣體沖洗該燒瓶，然后通過(guò)真空泵去除所有空氣。加上8”h2氣球，并讓反應(yīng)在室溫下攪拌。2小時(shí)后，由通過(guò)硅藻土用甲醇清洗的過(guò)濾移除pd/c，并濃縮以獲得n1,n19-雙((16s,19s)-19,23-二氨基-16-(4-氨基丁基)-15,18-二氧代-4,7,10-三氧雜-14,17-二氮雜二十三烷基)-4,7,10,13,16-五氧雜十九烷-1,19-二酰胺(823mg)。制備triva在二氯甲烷中攪拌n1,n19-雙((16s,19s)-19,23-二氨基-16-(4-氨基丁基)-15,18-二氧代-4,7,10-三氧雜-14,17-二氮雜二十三烷基)-4,7,10,13,16-五氧雜十九烷-1,19-二酰胺，并加入dmap和維甲酸。加入nmm并在室溫下和惰性氣體沖洗的鋁箔覆蓋的圓底燒瓶中攪拌該溶液。在10分鐘時(shí)間內(nèi)將edchcl鹽&nmm在二氯甲烷(20ml)中的懸浮液緩慢加入。在室溫下過(guò)夜攪拌反應(yīng)。第二天，用二氯甲烷稀釋至100ml。用h2o(100ml)、飽和的碳酸氫鹽溶液(100ml)和飽和的鹽溶液(100ml)清洗。將所有水相洗液用二氯甲烷(50ml)反萃取。用na2so4干燥有機(jī)物，過(guò)濾并濃縮。用二氯甲烷/乙醇梯度洗脫的堿性氧化鋁色譜純化材料以獲得triva(780mg)。lcmsesi+：m/z2972(m+na)。實(shí)施例30：合成4ttnpb制備n1,n19-雙((r)-1,8-二氧代-7-(4-((e)-2-(5,5,8,8-四甲基-5,6,7,8-四氫-萘-2-基)丙-1-烯-1-基)苯甲酰氨基)-1-(4-((e)-2-(5,5,8,8-四甲基-5,6,7,8-四氫萘-2-基)丙-1-烯-1-基)苯基)-13,16,19-三氧雜-2,9-二氮雜二十二烷-22-基)-4,7,10,13,16-五氧雜十九烷-1,19-二酰胺(4ttnpb).以與n1,n19-雙((s,23e,25e,27e,29e)-16-((2e,4e,6e,8e)-3,7-二甲基-9-(2,6,6-三甲基環(huán)-己-1-烯-1-基)九碳-2,4,6,8-四烯酰氨基)-24,28-二甲基-15,22-二氧代-30-(2,6,6-三甲基環(huán)己-1-烯-1-基)-4,7,10-三氧雜-14,21-二氮雜三十碳-23,25,27,29-四烯-1-基)-4,7,10,13,16-五氧雜十九烷-1,19-二酰胺(也稱(chēng)為diva)類(lèi)似的方式，從n1,n19-雙((s)-16,20-二氨基-15-氧代-4,7,10-三氧雜-14-氮雜二十基)-4,7,10,13,16-五氧雜十九烷-1,19-二酰胺制備n1,n19-雙((r)-1,8-二氧代-7-(4-((e)-2-(5,5,8,8-四甲基-5,6,7,8-四氫-萘-2-基)丙-1-烯-1-基)苯甲酰氨基)-1-(4-((e)-2-(5,5,8,8-四甲基-5,6,7,8-四氫萘-2-基)丙-1-烯-1-基)苯基)-13,16,19-三氧雜-2,9-二氮雜二十二烷-22-基)-4,7,10,13,16-五氧雜十九烷-1,19-二酰胺，也稱(chēng)作4ttnpb，用ttnpb替換全反式維甲酸。lcmsesi+：m/z2343(m+na)。實(shí)施例31：合成4myr制備n1,n19-雙((r)-15,22-二氧代-16-十四烷酰氨基-4,7,10-三氧雜-14,21-二氮雜五碳-三十烷基)-4,7,10,13,16-五氧雜十九烷-1,19-二酰胺(4myr).制備4myr：n1,n19-雙((r)-15,22-二氧代-16-十四烷酰氨基-4,7,10-三氧雜-14,21-二氮雜-五碳-三十烷基)-4,7,10,13,16-五氧雜十九烷-1,19-二酰胺將n1,n19-雙((s)-16,20-二氨基-15-氧代-4,7,10-三氧雜-14-氮雜二十基)-4,7,10,13,16-五碳氧雜十九烷-1,19-二酰胺(上述合成)溶解在二氯甲烷中并置于冰浴中。加入肉豆蔻酰氯而后三乙胺。移去冰浴并讓反應(yīng)在室溫下惰性氣體層下過(guò)夜攪拌。第二天，用二氯甲烷稀釋至100ml，并用1mhcl(75ml)、h2o(75ml)、飽和的碳酸氫鹽溶液(75ml)和飽和的鹽溶液(75ml)清洗。用二氯甲烷(25ml)反萃取所有的水相洗液。用mgso4干燥有機(jī)物，過(guò)濾并濃縮。通過(guò)用二氯甲烷/甲醇梯度的硅膠色譜的純化獲得n1,n19-雙((r)-15,22-二氧代-16-十四烷酰氨基-4,7,10-三氧雜-14,21-二氮雜-五碳-三十烷基)-4,7,10,13,16-五氧雜十九烷-1,19-二酰胺(410mg)。lcmsesi+：m/z1841(m+h)。實(shí)施例32：合成diva-242制備n1,n16-雙((r,18e,20e,22e,24e)-11-((2e,4e,6e,8e)-3,7-二甲基-9-(2,6,6-三甲基-環(huán)己-1-烯-1-基)九碳-2,4,6,8-四烯酰氨基)-19,23-二甲基-10,17-二氧代-25-(2,6,6-三甲基環(huán)己-1-烯-1-基)-3,6-二氧雜-9,16-二氮雜二十五碳-18,20,22,24-四烯-1-基)-4,7,10,13-四氧雜十六烷-1,16-二酰胺，也稱(chēng)為diva-242制備中間體1：二-叔丁基(10,25-二氧代-3,6,13,16,19,22,29,32-八氧雜-9,26-二氮雜三十四烷-1,34-二基)二氨基甲酸酯用惰性氣體沖洗含有二氯甲烷(25ml)的圓底燒瓶，并加入雙dpeg4酸(1000mg，3.40毫摩爾)、n-boc-3,6-二氧雜-1,8-辛烷二胺(1816ul，7.65毫摩爾)和hobt水合物(1034mg，7.65毫摩爾)。將nmm(841ul，7.65毫摩爾)加入懸浮液中，溶液變得澄清。加入edchcl鹽(2249mg，11.7毫摩爾)&nmm(1121ul，10.2毫摩爾)在二氯甲烷(25ml)中的溶液，而后dmap(62mg，0.51毫摩爾)。讓反應(yīng)在室溫下過(guò)夜攪拌。然后用二氯甲烷稀釋至100ml并用h2o(100ml)，10％k2co3(100ml)和飽和的鹽溶液(100ml)清洗，用二氯甲烷(30ml)反萃取所有水相洗液，用mgso4干燥，過(guò)濾并濃縮。通過(guò)用二氯甲烷/甲醇梯度的硅膠色譜純化獲得二-叔丁基(10,25-二氧代-3,6,13,16,19,22,29,32-八氧雜-9,26-二氮雜三十四烷-1,34-二基)二氨基甲酸酯(2.57g)。制備中間體2：n1,n16-雙(2-(2-(2-氨基乙氧基)乙氧基)乙基)-4,7,10,13-四氧雜十六烷-1,16-二酰胺tfa鹽將二-叔丁基(10,25-二氧代-3,6,13,16,19,22,29,32-八氧雜-9,26-二氮雜三十四烷-1,34-二基)二氨基甲酸酯溶解在二氯甲烷(15ml)中，并放入冰浴中。用惰性氣體沖洗該圓底燒瓶并加入tfa(15ml)。讓混合物攪拌20分鐘。然后濃縮該反應(yīng)混合物以獲得n1,n16-雙(2-(2-(2-氨基乙氧基)乙氧基)乙基)-4,7,10,13-四氧雜十六烷-1,16-二酰胺tfa鹽(1885mg)。制備diva-242：n1,n16-雙((r,18e,20e,22e,24e)-11-((2e,4e,6e,8e)-3,7-二甲基-9-(2,6,6-三甲基環(huán)己-1-烯-1-基)九碳-2,4,6,8-四烯酰氨基)-19,23-二甲基-10,17-二氧代-25-(2,6,6-三甲基環(huán)己-1-烯-1-基)-3,6-二氧雜-9,16-二氮雜二十五碳-18,20,22,24-四烯-1-基)-4,7,10,13-四氧雜十六烷-1,16-二酰胺以與diva相同的方案從n1,n16-雙(2-(2-(2-氨基乙氧基)乙氧基)乙基)-4,7,10,13-四氧雜十六烷-1,16-二酰胺tfa鹽合成n1,n16-雙((r,18e,20e,22e,24e)-11-((2e,4e,6e,8e)-3,7-二甲基-9-(2,6,6-三甲基環(huán)己-1-烯-1-基)九碳-2,4,6,8-四烯酰氨基)-19,23-二甲基-10,17-二氧代-25-(2,6,6-三甲基環(huán)己-1-烯-1-基)-3,6-二氧雜-9,16-二氮雜二十五碳-18,20,22,24-四烯-1-基)-4,7,10,13-四氧雜十六烷-1,16-二酰胺(diva-242)。lcmsesi+：m/z1940(m+h)。實(shí)施例33：核酸-脂質(zhì)顆粒的形成在配方方案中的sirna指具有定向hsp47/gp46的21-mer的雙鏈sirna序列，其中hsp47(小鼠)和gp46(大鼠)是同源的-不同物種的同一基因：用于體外測(cè)驗(yàn)的大鼠hsp47-c雙鏈sirna(大鼠phscs)正義(5'->3')ggacaggccucuacaacuatt(seq.idno.2)反義(3'->5')ttccuguccggagauguugau(seq.idno.3)用于體內(nèi)測(cè)驗(yàn)的制劑內(nèi)的小鼠hsp47-c雙鏈sirna(小鼠ccl4模型)正義(5'->3')ggacaggccuguacaacuatt(seq.idno.4)反義(3'->5')ttccuguccggacauguugau(seq.idno.5)陽(yáng)離子脂質(zhì)原液制備。通過(guò)將在乙醇中的濃度分別為6.0、5.1和2.7和2.4mg/ml的陽(yáng)離子脂質(zhì)、dope、膽固醇、和diva-peg-diva合并制備陽(yáng)離子脂質(zhì)貯存液。如果需要，將溶液溫?zé)嶂?0℃以促進(jìn)陽(yáng)離子脂質(zhì)溶解在溶液中。空脂質(zhì)體的制備。將陽(yáng)離子脂質(zhì)貯存液在35-40℃通過(guò)注射針在每注射口上以1.5ml/min注射入快速攪拌的水相混合物中。將陽(yáng)離子脂質(zhì)貯存液對(duì)水相溶液的比例(v/v)定在35:65?；旌蠒r(shí)，自然形成空的囊泡。然后在乙醇含量降至～12％之前讓所得的囊泡在35-40℃平衡10分鐘。然后將空的脂質(zhì)體對(duì)10x體積的水相緩沖液滲濾以去除乙醇。脂復(fù)合物的制備。用9％的蔗糖將根據(jù)上述方法制備的空的囊泡稀釋至使得陽(yáng)離子脂質(zhì)的濃度為1mm的終體積。向攪拌的溶液每ml稀釋的空囊泡中(“ev”)加入100μl在無(wú)rna酶水中的5％葡萄糖并混合均勻。然后一次加入150μl在無(wú)rna酶水中的10mg/ml的sirna溶液并混合均勻。然后用5％葡萄糖溶液稀釋混合物，每ml使用的ev用1.750ml。在室溫下以200rpm攪拌混合物10分鐘。在使用適當(dāng)選擇的蠕動(dòng)泵(例如midgeehoop，ufp-100-h24la)的交叉流超濾系統(tǒng)中使用具有～100000mwco的半滲透膜，將該混合物濃縮至初始體積(或所需體積)的約1/3，然后相對(duì)5倍于樣品體積的含有3％蔗糖和2.9％葡萄糖的水溶液進(jìn)行滲濾。然后將產(chǎn)物通過(guò)用前是無(wú)菌條件下的0.8/0.2微米孔徑的濾器的組合過(guò)濾。含非-divasirna的脂質(zhì)體的形成。以50:10:38:2的摩爾比例將陽(yáng)離子脂質(zhì)、dope、膽固醇、和peg-偶聯(lián)的脂質(zhì)溶解在無(wú)水乙醇(200標(biāo)準(zhǔn)強(qiáng)度)中。在50mm檸檬酸鹽緩沖液中溶解sirna并將溫度調(diào)至35-40℃。然后在攪拌時(shí)將乙醇/脂質(zhì)混合物加至含sirna的緩沖液中以自發(fā)形成裝載了sirna的脂質(zhì)體。將脂質(zhì)與sirna組合以達(dá)到最終脂質(zhì)比sirna的比例為15:1(重量：重量)。范圍可以是5:1至15:1，優(yōu)選地7:1至15:1。將裝載了sirna的脂質(zhì)體相對(duì)10x體積的pbs(ph7.2)滲濾以去除乙醇并交換緩沖液。將終產(chǎn)品過(guò)濾通過(guò)0.22μm無(wú)菌級(jí)別的pes濾器以減少生物負(fù)荷(bioburden)。該方法獲得具有平均粒徑為50-100nm的脂質(zhì)體，其具有pdi<0.2和>85％的包載效率。含sirna的與diva共溶的脂質(zhì)體的形成。使用上述方法制備sirna-diva-脂質(zhì)體制劑。在加至含sirna的緩沖液之前，將diva-peg-diva與其它脂質(zhì)(50:10:38:2比例的陽(yáng)離子脂質(zhì)、dope、膽固醇、和peg-偶聯(lián)的脂質(zhì))共溶于無(wú)水乙醇中。diva-peg-diva的摩爾含量范圍是0.1至5摩爾比例(50:10:38:2:0.1至50:10:38:2:5)。該方法獲得具有平均粒徑為50-100nm的脂質(zhì)體，其具有pdi<0.2和>85％的包載效率。用陽(yáng)離子脂質(zhì)的含sirna的脂質(zhì)體的形成。使用上述方法制備sirna-diva-脂質(zhì)體制劑和sirna-脂質(zhì)體制劑。陽(yáng)離子脂質(zhì)可以是，例如，hedc、hedodc、dc-6-14、或這些陽(yáng)離子脂質(zhì)的任何組合。用diva裝飾的含sirna的脂質(zhì)體的形成。使用上述方法制備sirna-脂質(zhì)體制劑，并稀釋至sirna在pbs中的濃度為0.5mg/ml。陽(yáng)離子脂質(zhì)可以是hedc、hedodc、dc-6-14、或這些陽(yáng)離子脂質(zhì)的任意組合。將diva-peg-diva溶解在無(wú)水乙醇(200標(biāo)準(zhǔn)強(qiáng)度)至10至50mg/ml的終濃度。將適量乙醇溶液加至sirna-脂質(zhì)體溶液以獲得最終的摩爾百分比在2至10摩爾％之間。用吸液管將溶液上下吸以混合。調(diào)整diva-peg-diva濃度和添加乙醇的體積以保持添加體積>1.0μl，并且最終的乙醇濃度<3％(體積/體積)。然后在體外或體內(nèi)評(píng)價(jià)之前，在環(huán)境溫度下在定軌搖床上將裝飾的脂質(zhì)體輕柔地?fù)u動(dòng)1小時(shí)。下表闡明本發(fā)明優(yōu)選的實(shí)施方式，其表示為摩爾比例、以及相當(dāng)?shù)哪枺ズ椭亓堪俜直?。?shí)施例34：使用脂質(zhì)體的制劑的轉(zhuǎn)染對(duì)于lx-2和phsc的轉(zhuǎn)染方法相同。將本發(fā)明脂質(zhì)體制劑或脂復(fù)合物制劑以所需的濃度與生長(zhǎng)培養(yǎng)基混合。將100μl的該混合物加至96孔板的孔中，并在培養(yǎng)箱中37℃和5％的co2下培育細(xì)胞30分鐘。30分鐘之后，用新鮮的生長(zhǎng)培養(yǎng)基更換培養(yǎng)基。48小時(shí)的轉(zhuǎn)染之后，使用溶菌試劑(appliedbiosystems)根據(jù)生產(chǎn)者的說(shuō)明書(shū)處理細(xì)胞。定量rt-pcr測(cè)量hsp47mrna的表達(dá)(qrt-pcr)：從appliedbiosystems購(gòu)買(mǎi)hsp47和gapdh測(cè)驗(yàn)和一步rt-pcr預(yù)混。各pcr反應(yīng)包含以下成分：一步rt-pcr混合物5μl、rt酶混合物0.25μl、基因表達(dá)測(cè)驗(yàn)探針(hsp47)0.25μl、基因表達(dá)測(cè)驗(yàn)探針(gapdh)0.5μl、無(wú)rna酶水3.25μl、細(xì)胞溶解產(chǎn)物0.75μl，總體積10μl。gapdh用作hsp47mrna水平的相對(duì)定量的內(nèi)源控制。在使用內(nèi)置的相對(duì)定量方法的viia7實(shí)時(shí)pcr系統(tǒng)(appliedbiosciences)中進(jìn)行定量rt-pcr。將所有值標(biāo)準(zhǔn)化為模擬轉(zhuǎn)染的細(xì)胞的平均hsp47表達(dá)，并表達(dá)為hsp47表達(dá)與模擬的相比的百分比。體內(nèi)試驗(yàn)：體重范圍為24-30克的雌性c57bl/6退役的育種者小鼠(charlesriver)用于該研究。動(dòng)物被隨機(jī)地(重量)分布為10組，每組10個(gè)動(dòng)物。如必要由bio-quant’siacuc和/或主治獸醫(yī)核準(zhǔn)所有動(dòng)物程序，并且所有動(dòng)物健康問(wèn)題得到解決和記錄。用異氟烷將小鼠麻醉，并通過(guò)下腔靜脈放血。通過(guò)每?jī)商煲淮喂?天(第0、2、4、6天)的腹膜內(nèi)注射ccl4(ccl4在橄欖油中，1:7(體積/體積)，每克體重1μl)誘導(dǎo)熱激蛋白47(hsp47)的增量調(diào)節(jié)。第3天，用本發(fā)明的脂質(zhì)體或脂復(fù)合物制劑或pbs通過(guò)iv注射入尾靜脈對(duì)小鼠進(jìn)行連續(xù)4天(第3、4、5、6)的處理。一組的10只小鼠(首次用于實(shí)驗(yàn)的)既不接受ccl4處理也不接受iv注射，作為正常hsp47基因表達(dá)的對(duì)照組。實(shí)驗(yàn)時(shí)間安排在第7天和最終的iv注射之后大約24小時(shí)，殺死所有剩余的小鼠，并在收集肝樣品用于pcr分析之前用pbs灌注肝。收集來(lái)自各小鼠肝的約150mg樣品并放入1.5ml的rnalater穩(wěn)定試劑(qiagen)中并保存在2-8℃直至分析時(shí)。不從透明的(clear)和標(biāo)記肝損傷和/或壞死的區(qū)域收集肝樣品。使用rneasy柱(qiagen)根據(jù)生產(chǎn)者的規(guī)程，從小鼠肝提取總rna。將20ng的總rna用于定量rt-pcr以測(cè)量hsp47表達(dá)。hsp47和gapdh測(cè)驗(yàn)以及一步rt-pcr預(yù)混購(gòu)買(mǎi)自appliedbiosystems。各pcr反應(yīng)包含以下成分：一步rt-pcr混合物5μl、rt酶混合物0.25μl、基因表達(dá)測(cè)驗(yàn)探針(hsp47)0.25μl、基因表達(dá)測(cè)驗(yàn)探針(gapdh)0.5μl、無(wú)rna酶水3.25μl、rna0.75μl，總體積10μl。gapdh用作hsp47mrna水平的相對(duì)定量的內(nèi)源控制。在使用內(nèi)置的相對(duì)定量方法的viia7實(shí)時(shí)pcr系統(tǒng)(appliedbiosciences)中進(jìn)行定量rt-pcr。將所有值標(biāo)準(zhǔn)化為首次用于實(shí)驗(yàn)的動(dòng)物組的平均hsp47表達(dá)，并表達(dá)為與首次用于實(shí)驗(yàn)的組相比的hsp47表達(dá)的百分比。在圖1中描述的制劑如下：*va-peg-va和diva-peg-diva是通過(guò)共溶加入。va通過(guò)過(guò)程后裝飾加入的。在圖2中描述的制劑如下：*diva-peg-diva是通過(guò)共溶加入。va通過(guò)過(guò)程后裝飾加入的。在圖3中描述的制劑如下。*diva-peg-diva是通過(guò)共溶加入。va通過(guò)過(guò)程后裝飾加入的。實(shí)施例35：體外功效(phsc)–劑量反應(yīng)phsc體外測(cè)驗(yàn)描述:在96孔板中將初級(jí)肝星形細(xì)胞(phsc)與具有增大濃度的sirna制劑(hedc:s104:dope:chol:peg-dmpe:diva，20:20:30:25:5:2)一起培育。30分鐘后，清洗細(xì)胞并用新鮮的生長(zhǎng)培養(yǎng)基處理并在37℃培育48小時(shí)。那時(shí)，溶解細(xì)胞，并通過(guò)定量rt-pcr測(cè)驗(yàn)測(cè)量gp46和gapdhmrna水平。將gp46的mrna水平標(biāo)準(zhǔn)化至gapdh水平。標(biāo)準(zhǔn)化的gp46水平表達(dá)為未處理的對(duì)照細(xì)胞的百分比。圖4顯示了結(jié)果。誤差棒表示標(biāo)準(zhǔn)方差(n＝3)。使用graphpad將數(shù)據(jù)擬合為s型劑量反應(yīng)曲線獲得ec50為11.8nm。實(shí)施例36：毒性hepg2細(xì)胞毒性測(cè)驗(yàn)描述：hepg2細(xì)胞是衍生自人肝細(xì)胞癌的黏著細(xì)胞系，將其培養(yǎng)在10％fbs(hyclone，logan，utahcat#sh30910)補(bǔ)充的mem/ebss(hyclone，logan，utah，cat#sh30024.01)中。將hepg2細(xì)胞以5000細(xì)胞/孔的密度接種于96孔o(hù)ptilux黑色板(bdfalcon，cat#bd353220)中過(guò)夜。將制劑加入每孔中以最終顯示sirna濃度(n＝3)。制劑添加后48小時(shí)，用celltiter-glo細(xì)胞活力熒光測(cè)驗(yàn)試劑盒(promega，cat#g7572)根據(jù)生產(chǎn)者的說(shuō)明書(shū)測(cè)定細(xì)胞活力。在清晰度發(fā)光酶標(biāo)儀(502-biotek，winooski，vermont)上測(cè)量化學(xué)發(fā)光信號(hào)?；诨瘜W(xué)發(fā)光信號(hào)的百分比計(jì)算活力?；谙鄬?duì)模擬處理的孔標(biāo)準(zhǔn)化的制劑處理的孔的化學(xué)發(fā)光信號(hào)的百分比計(jì)算活力。用本發(fā)明人的最有效的式i的季胺陽(yáng)離子脂質(zhì)研究制劑，本發(fā)明人評(píng)價(jià)了式i的季胺陽(yáng)離子脂質(zhì)與它們各自的可離子化的合成前體的組合(如以下實(shí)施例所示，i-dc和hedc、int4和dodc，s104和hes104)。下表提供來(lái)自不同制劑的示例性結(jié)果。季胺陽(yáng)離子脂質(zhì)和可離子化的陽(yáng)離子脂質(zhì)的組合令人驚奇地并出乎意料地比含單個(gè)陽(yáng)離子脂質(zhì)的脂質(zhì)體無(wú)毒(見(jiàn)下表中實(shí)施例hedc比hedc+idc；和dodc比dodc+int4)。hedc+s104組合被確認(rèn)為另一優(yōu)選的配方。體內(nèi)毒性在初步體內(nèi)毒性研究中，hedc:s104(20:20)制劑特別耐受。當(dāng)以高至25mg/kg(大鼠)和12mg/kg(猴子)的劑量進(jìn)行靜脈注射時(shí)，沒(méi)有觀察到毒性。這在該領(lǐng)域被認(rèn)為是優(yōu)良的。例如，alnylampharmaceuticals在2012年3月1號(hào)在asiatides會(huì)議上公開(kāi)了他們的最小毒性的第三代脂質(zhì)納米顆粒具有10mg/kg的noael(單劑量，大鼠)。實(shí)施例37：體內(nèi)功效(大鼠dmnq)在短期肝損傷模型(稱(chēng)作quick模型，dmnq)中評(píng)價(jià)目標(biāo)制劑的體內(nèi)活性。在該模型中，短期肝損傷是由用肝毒劑例如二甲基亞硝胺(dmn)的處理引發(fā)，并伴隨著gp46mrna水平的上升。為了引發(fā)這些變化，用dmn對(duì)雄性sprague-dawley大鼠進(jìn)行連續(xù)6天腹膜注射。在dmn治療期間的最后，基于個(gè)體動(dòng)物體重將動(dòng)物隨機(jī)分組。并在dmn的最后一次注射之后一小時(shí)，將制劑作為單一的靜脈劑量給藥。二十四小時(shí)之后，切除肝葉并通過(guò)定量rt-pcr測(cè)驗(yàn)確定gp46和mrpl19的mrna二者的水平。將gp46mrna的水平標(biāo)準(zhǔn)化為mrpl19的水平。在第4、5、6天用10mg/kg的dmn以1、2、3和5mg/kg通過(guò)腹膜給藥處理雄性sprague-dawley大鼠以引發(fā)肝損傷。最后一次注射dmn之后一個(gè)小時(shí)，用0.5、0.75、1.0、和2mg/kg的sirna劑量的包含hedc:s104:dope:chol:peg-dmpe:diva(20:20:30:25:5:2)的制劑，或pbs(載體)對(duì)動(dòng)物(n＝8/組)進(jìn)行靜脈注射。24小時(shí)之后，從來(lái)自各動(dòng)物的右肝葉的部分純化總sirna并儲(chǔ)存在4℃直至rna分離。對(duì)照組包含pbs載體組(dmn-處理的)和首次用于實(shí)驗(yàn)的(未處理的；無(wú)dmn)組。圖5顯示了測(cè)量結(jié)果。減去從首次用于實(shí)驗(yàn)的組確定的背景gp46mrna水平之后，將所有測(cè)試組的值標(biāo)準(zhǔn)化至載體組的平均gp46mrna(表達(dá)為載體組的百分比)。處理后的平均gp46mrna水平顯示劑量依賴反應(yīng)并擬合曲線成s型劑量反應(yīng)曲線，得到0.79mg/kg的ec50。實(shí)施例38：體內(nèi)功效(大鼠dmnc)用dmn通過(guò)腹膜給藥處理雄性spraguedawley大鼠(130-160g)以引發(fā)肝纖維化。dmn處理方案是前三周以10mg/kg(即，以5.0mg/mldmn和2.0ml/kg體重的劑量)每周3次(星期一、星期三和星期五)，和從第22天至57天以一半的5mg/kg劑量(即，以5.0mg/mldmn和1.0ml/kg體重的劑量)。使用相同的時(shí)間表用pbs(dmn的溶劑)注射假組動(dòng)物(shamgroupanimal)。第22天，在最后的dmn處理之后24小時(shí)收集血液樣品并測(cè)驗(yàn)肝疾病生物標(biāo)記以確認(rèn)dmn處理的有效性?；隗w重將dmn處理的動(dòng)物分配到不同的處理組中，并確保各組中動(dòng)物的平均體重和體重范圍沒(méi)有明顯區(qū)別。在第25天將來(lái)自預(yù)處理組的動(dòng)物殺死，來(lái)評(píng)價(jià)治療開(kāi)始之前疾病的發(fā)展階段。在第25天開(kāi)始用含有g(shù)p46sirna的制劑的治療，以特定的sirna劑量進(jìn)行每周兩次的治療，共10次。在第59天，最后一次制劑治療之后48小時(shí)和最后的dmn處理之后的72小時(shí)，通過(guò)co2吸入殺死動(dòng)物。切除肝葉并通過(guò)定量rt-pcr測(cè)驗(yàn)確定gp46和mrpl19mrna二者的水平。將gp46的mrna水平標(biāo)準(zhǔn)化為mrpl19水平。以10mg/kg的dmn(每周3次)然后從第22天至57天以5mg/kg(即，以5.0mg/mldmn和1.0ml/kg體重的劑量)通過(guò)腹膜注射給藥處理雄性sprague-dawley大鼠以誘發(fā)肝纖維化。最后一次注射dmn之后一個(gè)小時(shí)，用1.5、1.0、0.75、和0.5mg/kg的sirna的包含hedc:s104:dope:chol:peg-dmpe:diva(20:20:30:25:5:2)的制劑，或pbs(載體)對(duì)動(dòng)物(n＝10/組)進(jìn)行靜脈注射,10次(每周2次)。在第59天，從來(lái)自各動(dòng)物的右肝葉的部分純化總sirna并儲(chǔ)存在4℃直至rna的分離。對(duì)照組包含pbs載體組(dmn-引發(fā)的，pbs處理的，n＝7)和假組(在dmn和制劑位置用pbs處理；n＝10)組。圖6顯示測(cè)量結(jié)果。減去從首次用于實(shí)驗(yàn)的組確定的背景gp46mrna水平之后，將所有測(cè)試組的值標(biāo)準(zhǔn)化至載體組的平均gp46mrna(表達(dá)為載體組的百分比)。在第25天將來(lái)自預(yù)處理組(n＝7)的動(dòng)物殺死，來(lái)評(píng)價(jià)治療開(kāi)始之前疾病的發(fā)展階段。單因素anova分析及隨后的dunnett’s測(cè)試顯示與載體組相比在所有治療組中有明顯的gp46基因敲除(***，p<0.001)。下表總結(jié)了本文描述的化合物，以及在體內(nèi)和體外測(cè)試這些化合物的結(jié)果。實(shí)施例39：體內(nèi)抗肺纖維化將溶解在0.1ml鹽水中的0.45mg博來(lái)霉素(blm)通過(guò)麻醉下氣管內(nèi)的插套管(microsprayer，penn-century,inc.)對(duì)雄性s-d大鼠(每組8大鼠，8周老，charlesriverlaboratoriesjapan,inc.)一次性給藥進(jìn)肺，以產(chǎn)生博來(lái)霉素肺纖維化模型。用該方法，一般在約2周后在肺里發(fā)生顯著纖維化。在博來(lái)霉素給藥后的2周開(kāi)始，將脂質(zhì)體制劑(1.5mg/kg作為sirna的量，體積為1ml/kg，即，對(duì)200g的大鼠是200μl)或pbs(體積為1ml/kg)通過(guò)尾靜脈給藥至大鼠，總共10次(兩天一次)。在最后一次治療之后兩天將大鼠殺死，對(duì)肺組織進(jìn)行組織學(xué)研究(見(jiàn)圖7)。單因素anova分析和bonferroni多對(duì)比測(cè)試用于評(píng)價(jià)統(tǒng)計(jì)學(xué)上顯著的不同。根據(jù)常規(guī)方法，將切除的肺的一部分進(jìn)行福爾馬林固定，并進(jìn)行azan染色(偶氮卡紅、苯胺藍(lán)桔g溶液)。圖7中的組織學(xué)評(píng)分(t.ashcroftscore)結(jié)果顯示，在制劑給藥組(治療)中，纖維化的分顯著下降。實(shí)施例40：在lx-2細(xì)胞系和大鼠初級(jí)肝星形細(xì)胞(phscs)中va-sirna-脂質(zhì)體制劑的敲除功效的體外評(píng)價(jià)在培養(yǎng)箱中37℃和5％的co2下將lx2細(xì)胞(dr.s.l.friedman，mountsinaischoolofmedicine，ny)培養(yǎng)在補(bǔ)充了10％胎牛血清(invitrogen)的dmem(invitrogen)中。在培養(yǎng)箱中，使用tryplexpress溶液(invitrogen)將細(xì)胞在37℃胰蛋白酶解3分鐘。通過(guò)在血細(xì)胞計(jì)數(shù)器中計(jì)數(shù)細(xì)胞來(lái)測(cè)定細(xì)胞濃度，并接種3000細(xì)胞/孔入96孔板。在轉(zhuǎn)染前讓細(xì)胞生長(zhǎng)24小時(shí)。根據(jù)之前出版的方法(nat.biotechnol.2008,26(4):431-42)，從sprague-dawley大鼠分離大鼠初級(jí)肝星形細(xì)胞(phscs)。在補(bǔ)充了10％胎牛血清的dmem中培養(yǎng)phsc。在分離后用它們于體外篩查之前細(xì)胞生長(zhǎng)至兩個(gè)傳代。在96孔板中以1000細(xì)胞/孔的細(xì)胞密度接種細(xì)胞并在用它們于轉(zhuǎn)染之前讓其生長(zhǎng)48小時(shí)。用va-sirna-脂質(zhì)體制劑轉(zhuǎn)染。對(duì)lx-2和phsc細(xì)胞的轉(zhuǎn)染方法是一樣的。以所需的濃度將va-sirna-脂質(zhì)體或va-sirna-脂復(fù)合物制劑與生長(zhǎng)培養(yǎng)基混合。向96孔板的細(xì)胞中加入100μl的該混合物并在5％co2的培養(yǎng)箱中于37℃培育細(xì)胞30分鐘。30分鐘后，用新鮮的生長(zhǎng)培養(yǎng)基替換培養(yǎng)基。轉(zhuǎn)染48小時(shí)后，根據(jù)生產(chǎn)者的說(shuō)明書(shū)使用cell-to-ct溶解劑(appliedbiosystems)處理細(xì)胞。定量(q)rt-pcr以測(cè)量hsp47mrna的表達(dá)。hsp47和gapdh測(cè)驗(yàn)以及一步rt-pcr預(yù)混購(gòu)自appliedbiosystems。各pcr反應(yīng)包含以下組分：一步rt-pcr混合物5μl，rt酶混合物0.25μl，基因表達(dá)測(cè)驗(yàn)探針(hsp47)0.25μl，基因表達(dá)測(cè)驗(yàn)探針(gapdh)0.5μl，無(wú)rna酶水3.25μl，細(xì)胞溶解產(chǎn)物0.75μl，總體積10μl。gapdh用作hsp47mrna水平的相對(duì)定量的內(nèi)源控制。在使用內(nèi)置的相對(duì)定量方法的viia7實(shí)時(shí)pcr系統(tǒng)(appliedbiosciences)中進(jìn)行定量rt-pcr。將所有值標(biāo)準(zhǔn)化為模擬轉(zhuǎn)染細(xì)胞的平均hsp47表達(dá)，并表達(dá)為與模擬轉(zhuǎn)染細(xì)胞相比的hsp47表達(dá)的百分比。涉及制劑方案的sirna是具有21-聚體定向hsp47/gp46雙鏈的sirna序列，其中hsp47(小鼠)和gp46(大鼠)是同源的-在不同種類(lèi)中的相同基因：用于體外測(cè)驗(yàn)的大鼠hsp47-c雙鏈sirna(大鼠phscs)正義(5'->3')ggacaggccucuacaacuatt(seq.idno.1)反義(3'->5')ttccuguccggagauguugau(seq.idno.2).陽(yáng)離子脂質(zhì)貯存液制備。通過(guò)在乙醇中將陽(yáng)離子脂質(zhì)與dope、膽固醇、和diva-peg-diva分別以6.0、5.1和2.7和2.4mg/ml的濃度組合制備陽(yáng)離子脂質(zhì)的貯存液。如果需要，將溶液溫?zé)嶂良s50℃以促進(jìn)陽(yáng)離子脂質(zhì)溶出進(jìn)溶液?？罩|(zhì)體的制備。將陽(yáng)離子脂質(zhì)貯存液在40±1℃通過(guò)注射針在每注射口上以1.5ml/min注射入快速攪拌的9％蔗糖的水相混合物中。將陽(yáng)離子脂質(zhì)貯存液對(duì)水相溶液的比例(v/v)定在35:65?；旌蠒r(shí)，自然形成空的囊泡。然后在乙醇含量降至～12％之前讓所得的囊泡在40℃平衡10分鐘。脂復(fù)合物制備。用9％的蔗糖將根據(jù)上述方法制備的空的囊泡稀釋至1mm濃度的陽(yáng)離子脂質(zhì)的終體積。向攪拌的溶液每ml稀釋的空囊泡(“ev”)加入100μl在無(wú)rna酶水中的5％葡萄糖并混合均勻。然后一次性加入150μl在無(wú)rna酶水中的10mg/ml的sirna溶液并混合均勻。然后用5％葡萄糖溶液稀釋混合物，每ml的ev使用1.750ml。在室溫下以200rpm攪拌混合物10分鐘。在用適當(dāng)選擇的蠕動(dòng)泵(例如midgeehoop，ufp-100-h24la)的交叉流超濾系統(tǒng)中使用具有～100000mwco的半滲透膜，將該混合物濃縮至初始體積(或所需體積)的約1/3，然后相對(duì)5倍于樣品體積的含有3％蔗糖和2.9％葡萄糖的水溶液進(jìn)行滲濾。然后用前將產(chǎn)物通過(guò)是無(wú)菌條件下的0.8/0.2微米孔徑的濾器的組合過(guò)濾。含非-divasirna的脂質(zhì)體的形成。以50:10:38:2的摩爾比例將陽(yáng)離子脂質(zhì)、dope、膽固醇、和peg-偶聯(lián)的脂質(zhì)(例如，peg-脂質(zhì))溶解在無(wú)水乙醇(200標(biāo)準(zhǔn)強(qiáng)度)中。在50mm檸檬酸鹽緩沖液中溶解sirna并將溫度調(diào)至35-40℃。然后在攪拌時(shí)將乙醇/脂質(zhì)混合物加至含sirna的緩沖液中以自發(fā)形成裝載了sirna的脂質(zhì)體。將脂質(zhì)與sirna組合以達(dá)到最終脂質(zhì)比sirna的比例為15:1(重量：重量)。范圍可以是5:1至15:1，優(yōu)選地7:1至15:1。將裝載了sirna的脂質(zhì)體相對(duì)10x體積的pbs(ph7.2)滲濾以去除乙醇并交換緩沖液。將終產(chǎn)品過(guò)濾通過(guò)0.22μm無(wú)菌級(jí)別的pes濾器以減少生物負(fù)荷(bioburden)。該方法獲得具有平均粒徑為50-100nm的脂質(zhì)體，其具有pdi<0.2和>85％的包載效率。含sirna的與diva共溶的脂質(zhì)體的形成。使用上述方法制備sirna-diva-脂質(zhì)體制劑。在加至含sirna的緩沖液之前，將diva-peg-diva與其它脂質(zhì)(50:10:38:2比例的陽(yáng)離子脂質(zhì)、dope、膽固醇、和peg-偶聯(lián)的脂質(zhì))共溶于無(wú)水乙醇中。diva-peg-diva的摩爾含量范圍是0.1至5摩爾比例。該方法獲得具有平均粒徑為50-100nm的脂質(zhì)體，其具有pdi<0.2和>85％的包載效率。用陽(yáng)離子脂質(zhì)的含sirna的脂質(zhì)體的形成。使用上述方法制備sirna-diva-脂質(zhì)體制劑和sirna-脂質(zhì)體制劑。陽(yáng)離子脂質(zhì)可以是，例如，dodc、hedc、hedodc、dc-6-14、或這些陽(yáng)離子脂質(zhì)的任何組合。將diva-peg-diva溶解在無(wú)水乙醇(200標(biāo)準(zhǔn)強(qiáng)度)至10至50mg/ml的終濃度。將適量乙醇溶液加至sirna-脂質(zhì)體溶液以獲得在2至10摩爾％之間的最終的摩爾百分比。用吸液管將溶液上下吸以混合。調(diào)整diva-peg-diva濃度和添加乙醇的體積以保持添加體積>1.0μl，并且最終的乙醇濃度<3％(體積/體積)。然后在體外或體內(nèi)評(píng)價(jià)之前，在環(huán)境溫度下在定軌搖床上將裝飾的脂質(zhì)體輕柔地?fù)u動(dòng)1小時(shí)。結(jié)果圖8顯示了將va-偶聯(lián)物通過(guò)裝飾加至脂質(zhì)體提高了sirna的敲除功效，增強(qiáng)了sirna的活性。peg-脂質(zhì)。用于所有樣品的劑量是867nmsirnahsp47-c。結(jié)果顯示在將va-偶聯(lián)物加入脂質(zhì)體的每種情況下，與不含類(lèi)視黃醇的脂質(zhì)體相比并與用游離的(非偶聯(lián)的)視黃醇裝飾的脂質(zhì)體相比，sirna活性增強(qiáng)了。rnaimax是可商購(gòu)的轉(zhuǎn)染試劑。圖9顯示通過(guò)共溶將va-偶聯(lián)物添加至脂質(zhì)體提高了sirna的敲除功效。這些是含dodc的通過(guò)共溶添加的va-偶聯(lián)物的脂質(zhì)體。配方是50:10:38:2:x，其中x＝1至10(dodc:dope:膽固醇:peg-脂質(zhì):va-偶聯(lián)物，摩爾比率)。在各情況下的濃度是100nmsirnahsp47-c。結(jié)果顯示通過(guò)共溶將va-偶聯(lián)物添加至脂質(zhì)體增強(qiáng)sirna的活性。圖10顯示通過(guò)共溶將va-偶聯(lián)物添加至脂質(zhì)體戲劇性地提高了sirna的敲除功效。結(jié)果包含三種不同的脂質(zhì)體，dc-6-14、dodc、hedodc，其通過(guò)共溶添加va-偶聯(lián)物。對(duì)所有的配方是一樣的50:10:38:2，陽(yáng)離子脂質(zhì):dope:膽固醇:peg-脂質(zhì)，僅僅陽(yáng)離子脂質(zhì)變化。sirna的濃度對(duì)所有的是一樣的200nm的sirnahsp47-c。結(jié)果顯示當(dāng)通過(guò)共溶制備時(shí)，在添加va-偶聯(lián)物至具有不同陽(yáng)離子脂質(zhì)的脂質(zhì)體顯著增強(qiáng)了sirna活性。圖11顯示通過(guò)共溶向具有dc-6-14陽(yáng)離子脂質(zhì)的脂復(fù)合物添加va-偶聯(lián)物和將脂質(zhì)體的外部涂覆sirna增強(qiáng)了sirna的活性。配方是40％的脂復(fù)合物制劑，40:30:30，dc-6-14:dope:膽固醇。在各情況下的濃度是867nmsirnahsp47-c。結(jié)果顯示通過(guò)共溶將va-偶聯(lián)物添加至脂質(zhì)體增強(qiáng)sirna的活性。圖12顯示通過(guò)共溶向脂復(fù)合物添加va-偶聯(lián)物與通過(guò)裝飾添加的具有va-偶聯(lián)物的脂復(fù)合物的比較。這些結(jié)果來(lái)自dc-6-14和dodc脂復(fù)合物。該配方由40:30:30的dc-6-14:dope:膽固醇組成。在各樣品中的濃度是867nmsirnahsp47-c。相對(duì)于通過(guò)裝飾添加的va-偶聯(lián)物，通過(guò)共溶的va-偶聯(lián)物添加顯著提高體外的敲除功效。實(shí)施例41：體內(nèi)實(shí)驗(yàn)使用重量范圍為24-30克的雌性c57bl/6退役的育種者小鼠(charlesriver)。動(dòng)物被隨機(jī)地(重量)分布為10組，每組10個(gè)動(dòng)物。如必要由bio-quant’siacuc和/或主治獸醫(yī)核準(zhǔn)所有動(dòng)物程序，并且所有動(dòng)物健康問(wèn)題得到解決和記錄。用異氟烷將小鼠麻醉，并通過(guò)下腔靜脈放血。將小鼠hsp47-c雙鏈sirna用于體內(nèi)測(cè)驗(yàn)的制劑中(小鼠ccl4模型)正義(5'->3')ggacaggccuguacaacuatt(seq.idno.3)反義(3'->5')ttccuguccggacauguugau(seq.idno.4)通過(guò)每?jī)商煲淮喂?天(第0、2、4、6天)的腹膜內(nèi)注射ccl4(ccl4在橄欖油中，1:7(體積/體積)，每克體重1μl)誘導(dǎo)熱激蛋白47(hsp47)的增量調(diào)節(jié)。第3天，用本發(fā)明的脂質(zhì)體或脂復(fù)合物制劑或pbs通過(guò)iv注射入尾靜脈對(duì)小鼠進(jìn)行連續(xù)4天(第3、4、5、6)的處理。一組的10只小鼠(首次用于實(shí)驗(yàn)的)既不接受ccl4處理也不接受iv注射，作為正常hsp47基因表達(dá)的對(duì)照組。實(shí)驗(yàn)時(shí)間安排在第7天和最終的iv注射之后大約24小時(shí)，殺死所有剩余的小鼠，并在收集肝樣品用于pcr分析之前用pbs灌注肝。收集來(lái)自各小鼠肝的約150mg樣品并放入1.5ml的rnalater穩(wěn)定試劑(qiagen)中并保存在2-8℃直至分析時(shí)。不從透明的(clear)和標(biāo)記肝損傷和/或壞死的區(qū)域收集肝樣品。使用rneasy柱(qiagen)根據(jù)生產(chǎn)者的規(guī)程，從小鼠肝提取總rna。將20ng的總rna用于定量rt-pcr以測(cè)量hsp47表達(dá)。hsp47和gapdh測(cè)驗(yàn)以及一步rt-pcr預(yù)混購(gòu)買(mǎi)自appliedbiosystems。各pcr反應(yīng)包含以下成分：一步rt-pcr混合物5μl、rt酶混合物0.25μl、基因表達(dá)測(cè)驗(yàn)探針(hsp47)0.25μl、基因表達(dá)測(cè)驗(yàn)探針(gapdh)0.5μl、無(wú)rna酶水3.25μl、rna0.75μl，總體積10μl。gapdh用作hsp47mrna水平的相對(duì)定量的內(nèi)源控制。在使用內(nèi)置的相對(duì)定量方法的viia7實(shí)時(shí)pcr系統(tǒng)(appliedbiosciences)中進(jìn)行定量rt-pcr。將所有值標(biāo)準(zhǔn)化為首次用于實(shí)驗(yàn)的動(dòng)物組的平均hsp47表達(dá)，并表達(dá)為與首次用于實(shí)驗(yàn)的組相比的hsp47表達(dá)的百分比。實(shí)施例42：定向偶聯(lián)物hedc:s104:dope:chol:peg-dmpe:diva的脂溶性維生素的體外功效測(cè)試具有50nmsirna的脂質(zhì)體制劑。所述脂質(zhì)體是以下之一：hedc:s104:dope:chol:peg-dmpe:diva(+diva)或缺乏維生素a結(jié)構(gòu)部分的對(duì)照(-diva)，并將其培育在含有大鼠肝星形細(xì)胞的96孔培育板中30分鐘。30分鐘后，用新鮮的生長(zhǎng)培養(yǎng)基替換培養(yǎng)基。48小時(shí)后，將細(xì)胞溶解，并通過(guò)定量rt-pcr測(cè)驗(yàn)測(cè)量gp46和gapdh的mrna水平，并將gp46水平標(biāo)準(zhǔn)化至gapdh水平。體外功效(phsc)，2％divasirna的2％diva的作用是有效的并具有14nm的ec50。phsc與在50nm的sirna的缺少用于定向的維生素a結(jié)構(gòu)部分(-diva)的制劑或包含維生素a結(jié)構(gòu)部分(+diva)的制劑一起培育在96孔板中。30分鐘之后，用新鮮的生長(zhǎng)培養(yǎng)基替換培養(yǎng)基。48小時(shí)后，將細(xì)胞溶解，并通過(guò)定量rt-pcr測(cè)驗(yàn)測(cè)量gp46和gapdh的mrna水平，并將gp46水平標(biāo)準(zhǔn)化至gapdh水平。將標(biāo)準(zhǔn)化的gp46水平表達(dá)為模擬控制細(xì)胞的百分比。誤差棒表示標(biāo)準(zhǔn)方差(n＝3)。含diva的治療之后的平均gp46水平與基于單尾t檢驗(yàn)的(one-tailedt-test)模擬控制治療的顯著不同(p<0.001)。比較diva和satdiva在96孔板中將脂質(zhì)體制劑轉(zhuǎn)染入大鼠phsc中30分鐘。48小時(shí)之后，用溶解劑(appliedbiosystems)處理細(xì)胞并用qrt-pcr定量hsp47的mrna水平。將hsp47表達(dá)標(biāo)準(zhǔn)化為模擬控制。通過(guò)測(cè)量在六個(gè)半對(duì)數(shù)劑量的sirna并將數(shù)據(jù)擬合至graphpad5.04中的“典型s型劑量反應(yīng)函數(shù)”的hsp47敲除(kd)來(lái)確定ec50。結(jié)果顯示diva和satdiva二者增強(qiáng)了kd的功效(下表和圖15)。diva的ec50是12nm和satdiva的ec50是14nm。類(lèi)視黃醇偶聯(lián)物比非-類(lèi)視黃醇偶聯(lián)物據(jù)發(fā)現(xiàn)在體外類(lèi)視黃醇偶聯(lián)物相對(duì)于非類(lèi)視黃醇等價(jià)物(見(jiàn)4ttnbb和4myr對(duì)比類(lèi)視黃醇偶聯(lián)物等價(jià)物satdiva和diva)一貫更有效。實(shí)施例43：定向偶聯(lián)物hedc:s104:dope:chol:peg-dmpe:diva的脂溶性維生素的體內(nèi)功效在短期肝損傷模型(稱(chēng)作quick模型，dmnq)中評(píng)價(jià)目標(biāo)制劑的體內(nèi)活性。在該模型中，短期肝損傷是由用肝毒劑例如二甲基亞硝胺(dmn)的處理引發(fā)，并伴隨著gp46mrna水平的上升。為了引發(fā)這些變化，用dmn對(duì)雄性sprague-dawley大鼠進(jìn)行連續(xù)6天的腹膜注射。在dmn治療期間的最后，基于個(gè)體動(dòng)物體重將動(dòng)物隨機(jī)分組。將制劑作為單一的iv劑量給藥，并在dmn的最后一次注射之后一小時(shí)施用。二十四小時(shí)之后，切除肝葉并通過(guò)定量rt-pcr測(cè)驗(yàn)確定gp46和mrpl19的mrna二者的水平。結(jié)果(圖16)顯示類(lèi)視黃醇偶聯(lián)物的量和功效之間的關(guān)聯(lián)是明顯的。只需要0.25摩爾％即可看見(jiàn)在大鼠dmnq模型中的明顯作用。用2摩爾％diva觀察到對(duì)gp46表達(dá)的強(qiáng)勢(shì)敲除。圖16顯示用10mg/kg的dmn以1、2、3和5mg/kg在第4、5、6天通過(guò)腹膜給藥以引發(fā)肝損傷處理的雄性sprague-dawley大鼠。最后一次注射dmn之后一個(gè)小時(shí)，用含有0、0.25、0.5、1、和2％diva的0.75mg/kgsirna劑量的制劑，或pbs(載體)對(duì)動(dòng)物(n＝8/組)進(jìn)行靜脈注射。24小時(shí)之后，從來(lái)自各動(dòng)物的右肝葉的部分純化總sirna并儲(chǔ)存在4℃直至rna的分離。對(duì)照組包含pbs載體組(dmn-處理的)和首次用于實(shí)驗(yàn)的(未處理的；無(wú)dmn)組。減去從首次用于實(shí)驗(yàn)的組確定的背景gp46mrna水平之后，將所有測(cè)試組的值標(biāo)準(zhǔn)化至載體組的平均gp46mrna(表達(dá)為載體組的百分比)。用dmn通過(guò)腹膜給藥處理雄性spraguedawley大鼠(130-160g)以引發(fā)肝纖維化。dmn處理方案是前三周以10mg/kg(即，以5.0mg/mldmn和2.0ml/kg體重的劑量)每周3次(星期一、星期三和星期五)，和從第22天至57天以一半的5mg/kg劑量(即，以5.0mg/mldmn和1.0ml/kg體重的劑量)。使用相同的時(shí)間表用pbs(dmn的溶劑)注射假組動(dòng)物(shamgroupanimal)。在最后的dmn處理之后的第22、24天，收集血液樣品并測(cè)驗(yàn)肝疾病生物標(biāo)記以確認(rèn)dmn處理的有效性?；隗w重將dmn處理的動(dòng)物分配到不同的處理組中，并確保各組中動(dòng)物的平均體重和體重范圍沒(méi)有明顯區(qū)別。在第25天將來(lái)自預(yù)處理組的動(dòng)物殺死，來(lái)評(píng)價(jià)治療開(kāi)始之前疾病的發(fā)展階段。在第25天開(kāi)始用含有g(shù)p46sirna的制劑的治療，以特定的sirna劑量進(jìn)行每周兩次的治療，共10次。在第59天，最后一次制劑治療之后48小時(shí)和最后的dmn處理之后的72小時(shí)，通過(guò)co2吸入殺死動(dòng)物。切除肝葉并通過(guò)定量rt-pcr測(cè)驗(yàn)確定gp46和mrpl19mrna二者的水平。本文中提及或引用的文章、專(zhuān)利和專(zhuān)利申請(qǐng)，和所有其它文件以及可用的電子信息的內(nèi)容，在這里通過(guò)援引將其全部?jī)?nèi)容以特定地并單獨(dú)地指出各個(gè)出版物通過(guò)援引合并相同的程度合并入本文。申請(qǐng)人保留權(quán)利將任何和所有材料以及來(lái)自任何此類(lèi)文章、專(zhuān)利和專(zhuān)利申請(qǐng)的信息或其它物理性的和電子的文件物理性地加入該申請(qǐng)中。對(duì)本文公開(kāi)的說(shuō)明書(shū)進(jìn)行各種替換和改變而不背離本說(shuō)明書(shū)的范圍和精神對(duì)本領(lǐng)域技術(shù)人員將是顯而易見(jiàn)的。因此，此類(lèi)附加實(shí)施方式是在本發(fā)明和隨附的權(quán)利要求書(shū)的范圍之內(nèi)。本說(shuō)明書(shū)教導(dǎo)本領(lǐng)域技術(shù)人員測(cè)試對(duì)本文描述的化學(xué)改變的各種組合和/或替換以產(chǎn)生具有提高的的活性的核酸構(gòu)造，以調(diào)節(jié)rnai活性。這種提高的活性可包括提高的穩(wěn)定性、提高的生物利用度、和/或調(diào)節(jié)rnai的細(xì)胞反應(yīng)提高的活化。因此，本文描述的特定實(shí)施方式不是限制性的，本領(lǐng)域技術(shù)人員易于理解無(wú)需過(guò)度實(shí)驗(yàn)可測(cè)試本文中描述的改變的特定組合以確認(rèn)具有提高的rnai活性的核酸分子。在無(wú)本發(fā)明特定公開(kāi)的要素、限制下可合適地實(shí)踐本文中闡述性地描述的說(shuō)明書(shū)。因此，例如，除非本文中另有說(shuō)明或與上下文明確地相抵觸，在描述說(shuō)明書(shū)的上下文中術(shù)語(yǔ)“一”和“所述”以及類(lèi)似的指示(特別是在隨附的權(quán)利要求書(shū)文中)應(yīng)解釋為涵蓋了單數(shù)和復(fù)數(shù)二者。術(shù)語(yǔ)“包括”、“具有”、“包含”、“含有”等應(yīng)理解為擴(kuò)展性的和無(wú)限制的(例如，意指“包括但不限于”)。除非本文中另外指出，本文中值范圍的敘述只意在用作單獨(dú)地提及落入范圍內(nèi)的各單獨(dú)的值的速記方法，并且每個(gè)單獨(dú)的值以其在本文中被單獨(dú)引用那樣被結(jié)合到本說(shuō)明書(shū)中。除非本文中另有說(shuō)明或與上下文明確地相抵觸，本文中描述的所有方法可以任何合適的順序進(jìn)行。除非另有要求，使用任何和所有本文提供的實(shí)施例或示例性語(yǔ)言，僅僅是為了更好地說(shuō)明本說(shuō)明書(shū)，并不構(gòu)成對(duì)本說(shuō)明書(shū)的范圍的限制。在說(shuō)明書(shū)中沒(méi)有語(yǔ)言應(yīng)被解釋為指示任何未要求保護(hù)的元素對(duì)本說(shuō)明書(shū)的實(shí)踐是必需的。此外，本文所用的術(shù)語(yǔ)和表達(dá)被用作描述而不是限制，并不意在使用這些術(shù)語(yǔ)和表達(dá)排除所顯示和描述特征或其部分的任何等價(jià)物，但據(jù)認(rèn)知在所要求保護(hù)的說(shuō)明書(shū)的范圍內(nèi)進(jìn)行各種改變是可能的。因此，許理解雖然通過(guò)優(yōu)選的實(shí)施方式和任選的特征、其中所包含的說(shuō)明書(shū)的改進(jìn)和變化具體地公開(kāi)了本說(shuō)明書(shū)，但是本領(lǐng)域技術(shù)人員可借用這里所公開(kāi)的，并且此類(lèi)改進(jìn)和變化被認(rèn)為是在本說(shuō)明書(shū)的范圍之內(nèi)。這里廣泛地并一般性地描述了本說(shuō)明書(shū)。落入此一般性公開(kāi)的較窄種類(lèi)和亞屬組也構(gòu)成本說(shuō)明書(shū)的一部分。這包括本說(shuō)明書(shū)的一般性描述，條件或負(fù)面限制是從該種類(lèi)中去除任何題材，不管被去除的材料是否在本文中被具體引述。其它實(shí)施方式是在隨附的權(quán)利要求書(shū)中。另外，以markush組描述本說(shuō)明書(shū)的特征或方面的地方，本領(lǐng)域技術(shù)人員將認(rèn)識(shí)到因此本說(shuō)明書(shū)也以按照markush組成員的個(gè)別成員或亞組來(lái)描述。序列表<110>日東電工株式會(huì)社<120>用于定向藥物輸送和增強(qiáng)sirna活性的化合物<130>f3137wo(nitt-0017)<140>pct/us2012/041753<141>2012-06-08<150>61/494,840<151>2011-06-08<150>61/494,710<151>2011-06-08<160>5<170>patentinversion3.5<210>1<211>2208<212>rna<213>homosapiens<400>1ucuuuggcuuuuuuuggcggagcuggggcgcccuccggaagcguuuccaacuuuccagaa60guuucucgggacgggcaggaggggguggggacugccauauauagaucccgggagcagggg120agcgggcuaagaguagaaucgugucgcggcucgagagcgagagucacgucccggcgcuag180cccagcccgacccaggcccaccguggugcacgcaaaccacuuccuggccaugcgcucccu240ccugcuucucagcgccuucugccuccuggaggcggcccuggccgccgaggugaagaaacc300ugcagccgcagcagcuccuggcacugcggagaaguugagccccaaggcggccacgcuugc360cgagcgcagcgccggccuggccuucagcuuguaccaggccauggccaaggaccaggcagu420ggagaacauccuggugucacccguggugguggccucgucgcuagggcucgugucgcuggg480cggcaaggcgaccacggcgucgcaggccaaggcagugcugagcgccgagcagcugcgcga540cgaggaggugcacgccggccugggcgagcugcugcgcucacucagcaacuccacggcgcg600caacgugaccuggaagcugggcagccgacuguacggacccagcucagugagcuucgcuga660ugacuucgugcgcagcagcaagcagcacuacaacugcgagcacuccaagaucaacuuccg720cgacaagcgcagcgcgcugcaguccaucaacgagugggccgcgcagaccaccgacggcaa780gcugcccgaggucaccaaggacguggagcgcacggacggcgcccugcuagucaacgccau840guucuucaagccacacugggaugagaaauuccaccacaagaugguggacaaccguggcuu900cauggugacucgguccuauaccgugggugucaugaugaugcaccggacaggccucuacaa960cuacuacgacgacgagaaggaaaagcugcaaaucguggagaugccccuggcccacaagcu1020cuccagccucaucauccucaugccccaucacguggagccucucgagcgccuugaaaagcu1080gcuaaccaaagagcagcugaagaucuggauggggaagaugcagaagaaggcuguugccau1140cuccuugcccaagggugugguggaggugacccaugaccugcagaaacaccuggcugggcu1200gggccugacugaggccauugacaagaacaaggccgacuugucacgcaugucaggcaagaa1260ggaccuguaccuggccagcguguuccacgccaccgccuuugaguuggacacagauggcaa1320ccccuuugaccaggacaucuacgggcgcgaggagcugcgcagccccaagcuguucuacgc1380cgaccaccccuucaucuuccuagugcgggacacccaaagcggcucccugcuauucauugg1440gcgccugguccggccuaagggugacaagaugcgagacgaguuauagggccucagggugca1500cacaggauggcaggaggcauccaaaggcuccugagacacaugggugcuauugggguuggg1560ggggaggugagguaccagccuuggauacuccaugggguggggguggaaaaacagaccggg1620guucccgugugccugagcggaccuucccagcuagaauucacuccacuuggacaugggccc1680cagauaccaugaugcugagcccggaaacuccacauccugugggaccugggccauagucau1740ucugccugcccugaaagucccagaucaagccugccucaaucaguauucauauuuauagcc1800agguaccuucucaccugugagaccaaauugagcuaggggggucagccagcccucuucuga1860cacuaaaacaccucagcugccuccccagcucuaucccaaccucucccaacuauaaaacua1920ggugcugcagccccugggaccaggcacccccagaaugaccuggccgcagugaggcggauu1980gagaaggagcucccaggaggggcuucugggcagacucuggucaagaagcaucgugucugg2040cguuguggggaugaacuuuuuguuuuguuucuuccuuuuuuaguucuucaaagauaggga2100gggaagggggaacaugagccuuuguugcuaucaauccaagaacuuauuuguacauuuuuu2160uuuucaauaaaacuuuuccaaugacauuuuguuggagcguggaaaaaa2208<210>2<211>21<212>dna<213>artificialsequence<220><221>source<223>/note="descriptionofartificialsequence:syntheticoligonucleotide"<220><221>source<223>/note="descriptionofcombineddna/rnamolecule:syntheticoligonucleotide"<400>2ggacaggccucuacaacuatt21<210>3<211>21<212>dna<213>artificialsequence<220><221>source<223>/note="descriptionofartificialsequence:syntheticoligonucleotide"<220><221>source<223>/note="descriptionofcombineddna/rnamolecule:syntheticoligonucleotide"<400>3uaguuguagaggccugucctt21<210>4<211>21<212>dna<213>artificialsequence<220><221>source<223>/note="descriptionofartificialsequence:syntheticoligonucleotide"<220><221>source<223>/note="descriptionofcombineddna/rnamolecule:syntheticoligonucleotide"<400>4ggacaggccuguacaacuatt21<210>5<211>21<212>dna<213>artificialsequence<220><221>source<223>/note="descriptionofartificialsequence:syntheticoligonucleotide"<220><221>source<223>/note="descriptionofcombineddna/rnamolecule:syntheticoligonucleotide"<400>5uaguuguacaggccugucctt21當(dāng)前第1頁(yè)12