本發(fā)明涉及化學(xué)制藥技術(shù)領(lǐng)域，尤其是涉及一種pH敏感釋放的10-羥基喜樹堿水溶性大分子綴合物及制備方法和應(yīng)用。

背景技術(shù)：

10-羥基喜樹堿(10-Hydroxycamptothecine,10-HCPT)是珙桐科旱蓮屬落葉植物喜樹果實(shí)與葉中提取的一種具顯著抗癌活性的喜樹堿類生物堿，也可由喜樹堿合成而得。其抗癌作用相當(dāng)于喜樹堿的30倍。10-HCPT對(duì)胰腺癌、前列腺癌、膀胱癌、口腔鱗癌、大腸癌、胃癌、肝癌、非小細(xì)胞肺癌等具有明顯療效。對(duì)口腔、頸面部癌、頭頸部癌、頭頸部圓柱型腺癌及皮膚癌也有較好療效；對(duì)惡性葡萄胎，絨毛膜上皮癌、肺癌、急慢性粒細(xì)胞、白血病，銀屑病，及血吸蟲病引起的肝脾腫大等也具有一定的療效。與其他常用的抗癌藥無交叉耐藥。10-HCPT的不良反應(yīng)主要是消化道反應(yīng)，表現(xiàn)為惡心、嘔吐和遲發(fā)性腹瀉，少數(shù)心律失常和血尿，停藥后均可緩解。

化療是腫瘤手術(shù)前后的有效療法，也是主要療法。但小分子抗腫瘤藥物的體內(nèi)半衰期短、給藥量大、選擇性差，會(huì)對(duì)正常組織器官產(chǎn)生很大的毒副作用，且大多數(shù)抗腫瘤藥物存在耐藥性問題，長(zhǎng)期使用會(huì)降低治療效果。此外，小分子抗腫瘤藥物大多是疏水性的，臨床應(yīng)用受到限制。目前我國(guó)臨床使用的10-HCPT制劑為鈉鹽注射液或其粉針。由于分子結(jié)構(gòu)中具有酚羥基，10-HCPT露置于空氣中或遇光、熱不穩(wěn)定，10-HCPT的鈉鹽注射液易氧化和水解；鈉鹽粉針雖解決了鈉鹽注射液的貯存穩(wěn)定性，但仍存在內(nèi)酯開環(huán)療效降低且半衰期短的問題。藥學(xué)工作者們一方面致力于10-HCPT化學(xué)結(jié)構(gòu)的改造，以增加水溶性；另一方面通過開發(fā)多種劑型來增加10-HCPT的穩(wěn)定性，以期實(shí)現(xiàn)對(duì)腫瘤組織的靶向性、緩釋性、提高生物利用度、減少劑量和降低毒副作用。

1975年，Ringsdorf提出聚合物前藥(polymeric prodrug)模型。目前仍然是藥物輸送研究領(lǐng)域的熱點(diǎn)之一。聚合物前藥是指將原藥(或稱母體藥物)與聚合物載體通過化學(xué)鍵連接在一起，形成無藥效的結(jié)合物或綴合物。當(dāng)其進(jìn)入體內(nèi)后，經(jīng)水解或酶解即可釋放出具有藥效的代謝物或原藥。具有以下優(yōu)點(diǎn):1)實(shí)現(xiàn)藥物的控制釋放，延長(zhǎng)藥物的體內(nèi)半衰期；2)實(shí)現(xiàn)藥物的靶向輸送，利用高通透性和滯留(EPR)效應(yīng)將藥物輸送到腫瘤部位，降低其對(duì)正常組織的毒副作用，提高生物利用度；3)通過化學(xué)鍵鍵合、物理增溶或表面吸附等方式提高疏水性抗癌藥物的溶解性，有效改善其給藥方式；4)通過胞吞方式進(jìn)入腫瘤細(xì)胞，有效克服上皮和內(nèi)皮運(yùn)輸障礙；5)可通過包載或與顯像劑連接，實(shí)現(xiàn)藥物輸送可視化，實(shí)時(shí)跟蹤藥物輸送和釋放過程。

與正常細(xì)胞(pH≈7.4)相比，腫瘤細(xì)胞具有酸性的微環(huán)境(pH≈5.8～7.2)，其溶酶體中的pH值甚至更低(5.0～5.5)。酸敏感的化學(xué)鍵(如酯鍵、肟鍵)或者化學(xué)結(jié)構(gòu)(如腙式、縮醛結(jié)構(gòu))在酸性的細(xì)胞內(nèi)環(huán)境中可發(fā)生水解斷裂或結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)變，從而調(diào)控藥物的釋放。因此，pH響應(yīng)型智能藥物輸送系統(tǒng)具有極大的應(yīng)用前景。近十幾年來，pH響應(yīng)型膠束的設(shè)計(jì)與合成成為智能藥物輸送領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)。一些聚合物疏水鏈上的伯胺、仲胺或叔胺在酸性條件下可發(fā)生質(zhì)子化，增加鏈段的親水性，使鏈段由收縮狀態(tài)轉(zhuǎn)變?yōu)槭嬲範(fàn)顟B(tài)，表現(xiàn)出良好的pH響應(yīng)特性。

在癌癥治療中，多藥耐藥(MDR)常是化療失敗的主要障礙，幾乎所有的藥物輸送系統(tǒng)都面臨這個(gè)問題。其原因之一是癌細(xì)胞膜表面的P-糖蛋白(P-gp)能夠?qū)⑿》肿铀幬锎罅颗懦黾?xì)胞外。P-gp是一種能量依賴(ATP依賴)型酶，它在細(xì)胞中過度表達(dá)之后，會(huì)導(dǎo)致藥物泵出細(xì)胞外，使細(xì)胞內(nèi)藥物濃度下降，藥效降低。對(duì)于多環(huán)生物堿類藥物其耐藥效果更加明顯。關(guān)于P-gp是否與喜樹堿(CPT)類藥物的耐藥性有關(guān)，存在爭(zhēng)議。理由是某些P-gp過度表達(dá)的腫瘤細(xì)胞對(duì)于CPT類藥物并沒有耐藥性，如P-gp過度表達(dá)的人白血病K562ADM細(xì)胞與未突變的K562細(xì)胞，在體內(nèi)對(duì)于CPT幾乎同樣敏感；而Carolyn等人研究卻證實(shí)：P-gp在某些腫瘤細(xì)胞上發(fā)揮了ATP依賴的藥物外排作用，而導(dǎo)致耐藥性的產(chǎn)生。

Megumi等人在研究拓?fù)涮婵档哪退帣C(jī)制的過程中，設(shè)計(jì)合成了多個(gè)結(jié)構(gòu)類似的化合物用來考察藥物結(jié)構(gòu)與ABC類蛋白(ATP-bind-ing cassette，具有與ATP連接的結(jié)構(gòu)特征域的一系列蛋白)所引起的藥物外排胞外作用的關(guān)系。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明:耐藥細(xì)胞PC-6，SN2-5H和非耐藥細(xì)胞PC-6(人小細(xì)胞肺癌細(xì)胞)的TOPOⅠ與細(xì)胞內(nèi)藥物積累濃度的測(cè)試結(jié)果證實(shí)耐藥率高的化合物在細(xì)胞內(nèi)的積累率較低。說明細(xì)胞內(nèi)藥物濃度積累不足是喜樹堿類藥物耐藥性產(chǎn)生的一個(gè)重要原因。酸敏感大分子聚合物前藥給藥系統(tǒng)可通過胞吞作用進(jìn)入細(xì)胞，藥物在溶酶體中從聚合物上釋放出來，可以跨質(zhì)膜以被動(dòng)擴(kuò)散進(jìn)入周圍細(xì)胞質(zhì)，進(jìn)一步到達(dá)細(xì)胞核。因此,pH-響應(yīng)聚合物給藥系統(tǒng)往往會(huì)引發(fā)藥物在微酸性腫瘤細(xì)胞中有效濃度達(dá)到一個(gè)較高的水平,促進(jìn)細(xì)胞內(nèi)積累化學(xué)藥物，有利于發(fā)揮抗腫瘤效果。也體現(xiàn)了其抵抗P-gp外排藥物和抗MDR的潛力。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于提供一種pH敏感釋放的10-羥基喜樹堿水溶性大分子綴合物，旨在提高10-HCPT制劑的溶解度、改善藥物動(dòng)力學(xué)特征，改善對(duì)腫瘤組織的靶向性，改善抗多藥耐藥性，以及降低毒副作用。

本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供上述綴合物的制備方法及應(yīng)用。

為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明采用如下技術(shù)方案：

一種pH敏感釋放的10-羥基喜樹堿水溶性大分子綴合物，該綴合物是經(jīng)過修飾的10-羥基喜樹堿與聚乙二醇的綴合物。

優(yōu)選地，所述經(jīng)過修飾的10-羥基喜樹堿為對(duì)10-羥基喜樹堿的10位羥基進(jìn)行酯化，接入一個(gè)帶有酮羰基的短鏈，再接入一個(gè)pH敏感的腙鍵。

優(yōu)選地，該綴合物為將經(jīng)過修飾的10-羥基喜樹堿的另一端與聚乙二醇分子鏈接得到的。

優(yōu)選地，所述綴合物具有式(1)所示的結(jié)構(gòu)，

式(1)中，n為正整數(shù)；優(yōu)選n為10-35的正整數(shù)。

優(yōu)選地，所述n為22。

上述的pH敏感釋放的10-羥基喜樹堿水溶性大分子綴合物的制備方法，該方法的合成路徑如下：

一種10-羥基喜樹堿制劑，該制劑中含有上述的pH敏感釋放的10-羥基喜樹堿水溶性大分子綴合物。

優(yōu)選地，所述制劑在體內(nèi)循環(huán)時(shí)間大于4h。

上述的10-羥基喜樹堿制劑在制備抗腫瘤藥物中的應(yīng)用。

上述的10-羥基喜樹堿制劑在pH響應(yīng)型智能藥物輸送系統(tǒng)中的應(yīng)用。

本發(fā)明的有益效果如下：

本發(fā)明制備的pH敏感釋放的10-羥基喜樹堿水溶性大分子綴合物具有如下特點(diǎn)：

1、通過結(jié)構(gòu)改造，大大提高了10-HCPT的水溶性；

2、改善了10-HCPT的藥代動(dòng)力學(xué)性質(zhì)；

3、利用腫瘤微環(huán)境的特點(diǎn)，實(shí)現(xiàn)了pH響應(yīng)性釋放藥物，具有控釋效果；

4、化學(xué)鍵載藥，載藥量高，無藥物泄露；

5、可將化療藥物靶向至腫瘤且滯留較長(zhǎng)時(shí)間，具有良好的靶向性。

附圖說明

圖1為10-羥基喜樹堿的分子結(jié)構(gòu)圖。

圖2為pH敏感釋放的10-羥基喜樹堿水溶性大分子綴合物結(jié)構(gòu)示意圖。

圖3為化合物F的核磁共振氫譜圖；

圖4為化合物F的核磁共振碳譜圖；

圖5為PEG2000質(zhì)譜圖；

圖6為化合物F質(zhì)譜圖；

圖7為化合物F自組裝形成的納米膠束的透射電鏡圖；

圖8為化合物F自組裝形成納米膠束的粒徑分布圖；

圖9為37℃下10-HCPT在體外不同pH值PBS和血漿中的釋放；

圖10為激光共聚焦顯微鏡照片；

圖11A為表1和表2中的AUC_0-inf的柱形示意圖；

圖11B為表1和表2中MRT_0-inf的柱形示意圖；

圖12腫瘤各給藥化合物F組、10-HCPT組和生理鹽水對(duì)照組14天后腫瘤大小情況；

圖13A腫瘤各給藥化合物F組、10-HCPT組和生理鹽水對(duì)照組14天后腫瘤的生長(zhǎng)曲線；

圖13B腫瘤各給藥化合物F組、10-HCPT組和生理鹽水對(duì)照組14天后實(shí)驗(yàn)動(dòng)物體重降低曲線。

具體實(shí)施方式

下面將結(jié)合附圖對(duì)本發(fā)明的技術(shù)方案進(jìn)行清楚、完整地描述，顯然，所描述的實(shí)施例是本發(fā)明一部分實(shí)施例，而不是全部的實(shí)施例?；诒景l(fā)明中的實(shí)施例，本領(lǐng)域普通技術(shù)人員在沒有做出創(chuàng)造性勞動(dòng)前提下所獲得的所有其他實(shí)施例，都屬于本發(fā)明保護(hù)的范圍。

10-羥基喜樹堿(10-HCPT)的分子結(jié)構(gòu)見圖1，是由一個(gè)吡咯喹啉環(huán)，一個(gè)共軛吡吡啶環(huán)和一個(gè)六元α羥基基內(nèi)酯環(huán)(環(huán)E)組成，分子式C₂₀H₁₆N₂o₅，摩爾質(zhì)量364.357，是黃色棱柱狀一水合物結(jié)晶，熔點(diǎn)268～270℃，微溶于少數(shù)有機(jī)溶劑，不溶于水，在稀堿溶液中變成開環(huán)羧酸鹽形式溶解，溶液具有藍(lán)色熒光。閉環(huán)結(jié)構(gòu)油水分配系數(shù)分別為L(zhǎng)ogP1.06(正辛醇/蒸餾水)與1.28(正辛醇/pH5.0的磷酸鹽緩沖液)，親脂性稍強(qiáng)。10-HCPT不具有明顯的生物堿性質(zhì)，近中性，不溶于酸，與酸不成鹽；難溶于水及一般有機(jī)溶劑，可溶于吡啶、二甲基亞楓、醋酸和氯仿與甲醇的混合液，溶液有明顯的藍(lán)色熒光。對(duì)光、熱敏感。光照射喜樹堿溶液，其吸光度降低，光越強(qiáng)，吸光度下降越多，避光則十分穩(wěn)定。加熱可使喜樹堿分解。

腙鍵由于其生理pH條件下良好的穩(wěn)定性，和酸性條件下迅速水解斷裂的響應(yīng)特性已被許多文獻(xiàn)報(bào)道用于設(shè)計(jì)pH響應(yīng)的藥物輸送系統(tǒng)。體外釋放實(shí)驗(yàn)表明，腙鍵在酸性條件下水解快速，可大大提高藥物的釋放速率?？梢杂行Э朔退幮詥栴}，提高腫瘤治療效果。

為克服HCPT制劑的缺陷，本發(fā)明的發(fā)明人制備出HCPT聚合物前藥給載藥系統(tǒng)，旨在提高其溶解度、改善藥物動(dòng)力學(xué)特征，腫瘤靶向，抗多藥耐藥，以及降低毒副作用。

聚乙二醇(Polyethylene glycol，PEG)是常用的納米系統(tǒng)表面修飾材料。可避免體內(nèi)網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)對(duì)其識(shí)別，從而延長(zhǎng)納米系統(tǒng)在血液中的循環(huán)時(shí)間，改善藥代動(dòng)力學(xué)性質(zhì)。

發(fā)明人采用對(duì)10-羥基喜樹堿的10位羥基進(jìn)行酯化，接入一個(gè)帶有酮羰基的短鏈，再接入一個(gè)pH敏感的腙鍵，以達(dá)到腫瘤微環(huán)境敏感和控制釋放，另一端鏈接PEG2000，做為親水部分，提高水溶性和體內(nèi)循環(huán)時(shí)間，制備的大分子水溶性聚合物前藥具有更好的藥動(dòng)力學(xué)性質(zhì)、良好的穩(wěn)定性、靶向性、控釋性和更低的毒副作用。

如圖2所示的本發(fā)明的pH敏感釋放的10-羥基喜樹堿水溶性大分子綴合物，內(nèi)酯環(huán)結(jié)構(gòu)，為抗腫瘤活性部位，開環(huán)可造成毒性升高和生物利用度降低，因此沒有選擇此環(huán)做為反應(yīng)部位以免對(duì)其結(jié)構(gòu)造成破壞。10羥基和羰基己酸形成的酯鍵。在堿性條件下不穩(wěn)定。腙鍵在低pH條件下迅速降解。2000Da MPEG，是水溶性部分，可大大提高分子的水溶性，并且具有體內(nèi)長(zhǎng)循環(huán)作用。當(dāng)聚合物前藥進(jìn)入腫瘤組織和細(xì)胞時(shí)，由于其內(nèi)部的酸性環(huán)境，腙鍵斷裂釋放出藥物，進(jìn)入細(xì)胞核發(fā)揮藥效。由于腫瘤組織缺乏淋巴引流作用，其對(duì)大分子的排出較慢，藥物可在腫瘤部位停留較長(zhǎng)時(shí)間。本發(fā)明的pH敏感釋放的10-羥基喜樹堿水溶性大分子綴合物(化合物F)的合成路徑如下：

pH敏感釋放的10-羥基喜樹堿水溶性大分子綴合物的具體制備方法如下：

根據(jù)上面的合成路徑，合成步驟包括：

(1)化合物B的合成

將化合物A(1.00g，2.7mmol)和5-羰基己酸(1.07g，8.1mmol)溶解于10mL吡啶中，于室溫下加入EDCI(2.06g,10.8mmol)，攪拌3h，薄層色譜法監(jiān)測(cè)反應(yīng)。向反應(yīng)體系中加入50mL二氯甲烷和50mL水，攪拌反應(yīng)30分鐘后，分出有機(jī)層，減壓干燥濃縮得到的殘?jiān)霉枘z柱進(jìn)行純化，用二氯甲烷:甲醇10:1洗脫，得到黃色的固體化合物B(1.25g,96％)。

(2)化合物C的合成

室溫下將化合物B(377mg,2.1mmol)溶解于100ml無水二氯甲烷中[2]。將氨基硫脲溶解于50ml無水甲醇中，混合二者，50℃攪拌反應(yīng)24h，降溫至室溫，得到白色沉淀，依次用100ml無水二氯甲烷和100ml無水甲醇洗滌，減壓干燥得到白色干燥固體粉末即化合物C；

(3)化合物E的合成

室溫下將線型MeO-PEG2000-COOH溶解于2ml無水N,N-二甲基甲酰胺中，加入100ml無水二氯甲烷，加入5ml氯化亞砜，氮?dú)獗Ｗo(hù)下，50℃攪拌反應(yīng)5h。減壓除去氯化亞砜，得到淡黃色油狀液體，即化合物E，充入氮?dú)?，保存?℃；

(4)化合物F的合成

將化合物E(205mg,0.1mmol)溶解于50ml無水N,N-二甲基甲酰胺中，0℃冰浴條件下逐滴加入化合物C(55mg,0.1mmol)，充氮?dú)膺M(jìn)行保護(hù)，加入適量碳酸鉀將體系的pH值維持在堿性狀態(tài)。冰浴條件下攪拌反應(yīng)3h，減壓除去溶劑，濃縮體系，使用分子排阻色譜柱(Sephadex LH-20)純化產(chǎn)物。重力法裝柱3.0×20cm。將濃縮后的反應(yīng)體系室溫下加入到柱上，每次1ml,用二氯甲烷:甲醇1:1溶液洗脫，每5ml洗脫液收集一管，薄層色譜監(jiān)測(cè)洗脫物，收集純化合物F的洗脫液，減壓濃縮。產(chǎn)物用二氯甲烷:甲醇1:1溶液洗滌，室溫減壓干燥過夜。

化合物F采用1H NMR(BRUKER,400MHz)，13C NMR和基質(zhì)輔助飛行時(shí)間質(zhì)譜(MALDITOF)鑒定結(jié)構(gòu)，線性正離子模式，15mV(sum＝850mv)，

數(shù)據(jù)結(jié)果采用Kratos PC Axima CFR plus V 2.4.1.軟件進(jìn)行分析。

1H NMR譜圖和13C NMR譜圖用氘代二甲基亞砜(DMSO-d6)做溶劑。以下為核磁信號(hào)結(jié)果:

1H NMR(Bruker，400MHz).δ0.89CH3(t)，δ1.87CH2(m)，δ1.95CH3(s)，δ2.37CH2(t)，δ2.42CH3(s)，δ2.70CH2(t)，δ3.23CH2(s)，δ3.43CH2(t)，δ3.50(CH2CH2)45(s)，δ3.68OH(s)，δ4.11CH2(t),δ5.30CH2(s)，δ5.44CH2(s)，δ6.54CH(s)，δ7.35CH(s)，δ7.55NH(s)，δ7.67CH(dd)，δ7.90CH(d)，δ8.13NH(s)，δ8.21CH(d)。

13C NMR(Bruker,100MHz)＝8.2,17.0,21.1,29.1,29.2,30.7,33.3,37.7,58.5,63.8,65.7,68.7,70.0,70.2,71.7,72.8,97.1,119.6,119.8,126.6,128.8,130.9,131.7,145.8,149.5,150.5,153.9,157.3,172.2,172.9,173.8,174.0.

MALDI-TOF法為高分子分子量測(cè)定的有效方法。未反應(yīng)的PEG(MW 2065)測(cè)定值與理論值相差一個(gè)道爾頓，終產(chǎn)物化合物F的分子量測(cè)定結(jié)果在單質(zhì)譜峰中均與理論值相差一個(gè)道爾頓。表明化合物F成功合成。而且沒有發(fā)現(xiàn)其他分子量的產(chǎn)物和未反應(yīng)完全的PEG?；衔颋的產(chǎn)率為32.4％。

圖3為化合物F的核磁共振氫譜圖；圖4為化合物F的核磁共振碳譜圖；圖5為PEG2000的質(zhì)譜圖；圖6為化合物F的質(zhì)譜圖。

本發(fā)明合成的化合物F聚合物前藥給藥系統(tǒng)分子結(jié)構(gòu)具有兩親性，可自組裝形成納米膠束，利用腫瘤組織EPR效應(yīng)被動(dòng)靶向至腫瘤。粒徑在80nm左右。如圖7和圖8所示，圖7為化合物F自組裝形成的納米膠束的透射電鏡圖；圖8為化合物F自組裝形成納米膠束的粒徑分布圖。

化合物F給藥后可通過胞吞作用進(jìn)入細(xì)胞，由于腫瘤細(xì)胞內(nèi)的酸性環(huán)境，藥物聚合物之間的酸敏感腙鍵斷裂，藥物釋放出來，進(jìn)入細(xì)胞核發(fā)揮抗腫瘤作用。該體系的設(shè)計(jì)路線利用了靶向給藥體系設(shè)計(jì)的前藥策略、pH響應(yīng)等靶向給藥控釋策略，利用化學(xué)鍵鍵合藥物，具有載藥量高、不泄露、可控釋放的優(yōu)點(diǎn)。

大分子綴合物(化合物F)給藥系統(tǒng)性質(zhì)測(cè)定

測(cè)定體外各pH條件下的藥物釋放。發(fā)現(xiàn)在中性條件下大分子綴合物(化合物F)穩(wěn)定，但在酸性(pH 6.0以下)溶液中腙鍵斷裂，藥物迅速釋放，具有顯著地pH響應(yīng)特性。采用香豆素-6對(duì)膠束進(jìn)行熒光標(biāo)記，利用激光共聚焦顯微鏡觀察細(xì)胞攝取藥物的過程；采用MTT法檢測(cè)其對(duì)MCF-7、HepG2、SW180細(xì)胞的毒性。結(jié)果表明：細(xì)胞攝取10-HCPT-Hyd-PEG的速度較快，1小時(shí)后即可觀察到細(xì)胞內(nèi)的黃綠色熒光，2小時(shí)后可觀察熒光增強(qiáng)，4小時(shí)熒光強(qiáng)度最大，藥物大量進(jìn)入細(xì)胞核，且細(xì)胞內(nèi)長(zhǎng)期維持較高濃度，沒有迅速被細(xì)胞排出，有助于藥效的持久發(fā)揮。

圖9為37℃下10-HCPT在不同pH值PBS和血漿中的體外釋放說明了在中性條件下化合物F穩(wěn)定，但在酸性(pH 6.0以下)溶液中腙鍵斷裂，藥物迅速釋放，具有顯著地pH響應(yīng)特性。

表1為體外細(xì)胞增殖抑制實(shí)驗(yàn)結(jié)果，說明了化合物F在三種腫瘤細(xì)胞種IC₅₀值均小于10-HCPT，因此具有比10-HCPT更強(qiáng)的抑制腫瘤細(xì)胞增殖的作用。

表1

圖10為激光共聚焦顯微鏡觀察MCF-7細(xì)胞攝取香豆素-6標(biāo)記的化合物F膠束7.5mg/mL 100μl后1小時(shí)，2小時(shí)，4小時(shí)后的照片；

A:FITC通道顯示香豆素-6標(biāo)記化合物F的黃綠色熒光；

B:DAPI通道表示DAPI染細(xì)胞核后的藍(lán)色熒光；

C:A和B通道的融合；

圖10結(jié)果表明細(xì)胞攝取化合物F的速度較快，1小時(shí)后即可觀察到細(xì)胞內(nèi)黃綠色熒光，2小時(shí)后可觀察熒光增強(qiáng)，4小時(shí)熒光強(qiáng)度最大，藥物大量進(jìn)入細(xì)胞核，且細(xì)胞內(nèi)長(zhǎng)期維持較高濃度，沒有迅速被細(xì)胞排出，有助于藥效的持久發(fā)揮。

用MCF-7細(xì)胞建立腋下荷瘤裸小鼠動(dòng)物模型，進(jìn)行組織分布靶向性研究，健康大鼠進(jìn)行體內(nèi)藥動(dòng)學(xué)研究。結(jié)果表明化合物F在荷大鼠體內(nèi)的循環(huán)時(shí)間顯著高于游離10-HCPT溶液，這有利于提高藥物可逆性地與拓?fù)洚悩?gòu)酶Ⅰ結(jié)合的機(jī)率，而提高藥效。荷瘤裸鼠腫瘤內(nèi)、肝臟和肺部10-HCPT藥物量大小順序?yàn)椋夯衔颋>10-HCPT注射液。結(jié)果表明10-HCPT-Hyd-PEG對(duì)腫瘤、肝臟和肺臟具有更好的靶向性。在心臟和腎臟內(nèi)藥物分布由小到大順序?yàn)椋夯衔颋<10-HCPT。表明本發(fā)明的制劑有利于降低10-HCPT的心臟和腎臟毒性。測(cè)定腫瘤各給藥化合物F組、10-HCPT組和生理鹽水對(duì)照組14天后腫瘤的生長(zhǎng)情況。結(jié)果各組制劑的腫瘤抑制效果由強(qiáng)至弱順序?yàn)椋夯衔颋>10-HCPT>生理鹽水組?；衔颋抑瘤率顯著提升。水溶性大分子綴合物療效顯著優(yōu)于游離小分子抗腫瘤藥物。

表2為大鼠體內(nèi)10-HCPT和compound F的藥動(dòng)學(xué)參數(shù)比較(n＝6,A:AUC_0-inf；B:MRT_0-inf)與10-HCPT注射液組相比p<0.05*；與10-HCPT注射液組相比P<0.01**，.說明了化合物F在荷瘤裸小鼠體內(nèi)的循環(huán)時(shí)間顯著高于游離10-HCPT溶液，這有利于提高藥物可逆性地與拓?fù)洚悩?gòu)酶Ⅰ結(jié)合的機(jī)率，而提高藥效。腫瘤內(nèi)、肝臟和肺部10-HCPT藥物量大小順序?yàn)椋夯衔颋>10-HCPT注射液。結(jié)果表明10-HCPT-Hyd-PEG對(duì)腫瘤、肝臟和肺臟具有更好的靶向性。在心臟和腎臟內(nèi)藥物分布由小到大順序?yàn)椋夯衔颋<10-HCPT。表明本發(fā)明的大分子綴合物有利于降低10-HCPT的心臟和腎臟毒性。

表2

a藥時(shí)曲線下面積；

b平均滯留時(shí)間；

c 10-HCPT注射液5.0mg/kg；

d化合物F：35.1mg/kg；

^*與10-HCPT注射液組比較p＜0.05；

^**與10-HCPT注射液組比較p＜0.01。

圖11A為以上表格中AUC_0-inf的柱形示意圖，比表格數(shù)據(jù)更加形象和突出地表示了以上結(jié)果。圖11B為以上表格中MRT_0-inf的柱形示意圖，比表格數(shù)據(jù)更加形象和突出地表示了以上結(jié)果。

通過分析給藥后實(shí)驗(yàn)動(dòng)物體重降低曲線，分析各給藥系統(tǒng)的毒性。結(jié)果表明毒性的大小順序?yàn)榛衔颋<10-HCPT。制劑的初步毒性研究顯示：本發(fā)明制劑毒性較市售參比制劑更低。

圖12為腫瘤各給藥化合物F組、10-HCPT組和生理鹽水對(duì)照組14天后腫瘤的大小圖片。說明了：結(jié)果各組制劑的腫瘤抑制效果由強(qiáng)至弱順序?yàn)椋夯衔颋>10-HCPT組>生理鹽水組?；衔颋比10-HCPT具有更強(qiáng)的腫瘤抑制活性

圖13A為腫瘤各給藥化合物F組、10-HCPT組和生理鹽水對(duì)照組14天后腫瘤的生長(zhǎng)曲線；說明了各組制劑的腫瘤抑制效果由強(qiáng)至弱順序?yàn)椋夯衔颋>10-HCPT組>生理鹽水組?；衔颋抑瘤率顯著提升。水溶性大分子綴合物療效顯著優(yōu)于游離小分子抗腫瘤藥物。

圖13B為腫瘤各給藥化合物F組、10-HCPT組和生理鹽水對(duì)照組14天后實(shí)驗(yàn)動(dòng)物體重降低曲線，均值±標(biāo)準(zhǔn)差(n＝8)；說明了毒性的大小順序?yàn)榛衔颋<10-HCPT。制劑的初步毒性研究顯示：本發(fā)明制劑毒性較市售參比制劑更低。

最后應(yīng)說明的是：以上各實(shí)施例僅用以說明本發(fā)明的技術(shù)方案，而非對(duì)其限制；盡管參照前述各實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)行了詳細(xì)的說明，本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解：其依然可以對(duì)前述各實(shí)施例所記載的技術(shù)方案進(jìn)行修改，或者對(duì)其中部分或者全部技術(shù)特征進(jìn)行等同替換；而這些修改或者替換，并不使相應(yīng)技術(shù)方案的本質(zhì)脫離本發(fā)明各實(shí)施例技術(shù)方案的范圍。