本發(fā)明涉及無患子皂苷，尤其是涉及一種兩步法制備無患子皂苷的方法。

背景技術：

無患子皂苷主要包括以長春藤皂苷元為基本骨架的三萜皂苷及部分倍半萜糖苷。它們是一種天然的非離子型表面活性劑，具有抗菌、殺菌、消炎、發(fā)泡和較強的去污能力，可用作洗滌劑。無患子的分離純化是其開發(fā)利用的基礎，目前提取分離方法有大孔樹脂分離法、萃取法和超濾法等。魏鳳玉等([1]魏鳳玉,余錦城,解輝.天然無患子皂苷的提取分離[J].安徽化工,2007,33(3):15-17)采用水提-大孔樹脂吸附分離法及超濾法對無患子皂苷進行分離純化，總皂苷純度可分別達85％和67％。但是該方法的溶劑消耗量大，操作周期長。

泡沫分離是以氣泡為介質，利用組分的表面活性差進行分離的一種方法。通過鼓泡使溶質選擇性地聚集在氣-液界面，并借助浮力上升至溶液主體上方形成泡沫層，從而達到富集皂苷的過程([2]Yan J,Wu Z,Zhao Y,et al.Separation of tea saponin by two-stage foam fractionation[J].Separation and Purification Technology,2011,80(2):300-305)。近年來，在分離人參皂苷、三七皂苷和文冠果果皮等天然類皂苷中取得了較好的成效。

技術實現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于針對市面上無無患子質控品售賣，無患子總皂苷檢測方法缺失及實際應用研究少的問題，提供一種兩步法制備無患子皂苷的方法。

本發(fā)明包括以下步驟：

1)大孔樹脂吸附分離(一次大孔樹脂分離)；

在步驟1)中，所述大孔樹脂吸附分離的具體方法可為：

以無患子果皮為原料，粉碎，醇提，合并無患子提取液，噴霧干燥，得到無患子皂苷粗粉末，再定容，超聲后上樹脂柱，水洗除糖，醇洗除去雜質，再醇洗收集皂苷，旋轉蒸發(fā)，揮干溶劑后，得到皂苷粗粉末。

所述醇提可醇提2～3次；所述超聲的時間可為15min；所述樹脂柱可采用D101樹脂柱；所述水洗除糖可采用去離子水；所述醇洗可采用質量百分濃度為20％的乙醇；所述再醇洗可采用質量百分濃度為70％的乙醇。

2)泡沫分離，得無患子皂苷。

在步驟2)中，所述泡沫分離的具體方法可為：

樹脂產(chǎn)品粉末配制水溶液，從底端裝有砂芯(作為氣體分布器)的層析柱的上方原料液進口進樣，空氣經(jīng)空氣泵進入空氣流量計，再進入緩沖瓶和增濕瓶后，通過層析柱底端的空氣進口，然后經(jīng)過層析柱底端的砂芯，分散成氣泡通過層析柱底的無患子皂苷粗提液，泡沫溢出后進入外層由下到上再從蒸餾管頂端的泡沫液進口通入60℃循環(huán)熱水的直型蒸餾管，加速泡沫破裂，收集其底端泡沫液，待消泡后測溶液的體積，用分光光度法檢測泡沫液中無患子皂苷含量，揮干溶劑后測固含量濃度，計算其純度。

所述進樣可分三次進樣；所述空氣的氣速可為2min/L。

所述層析柱的內徑可為25mm，高可為300mm；所述蒸餾管的內徑可為35mm，高為600mm。

本發(fā)明采用大孔樹脂與泡沫分離兩步法提取分離高純度無患子皂苷，并設計出一種操作簡單、能快速檢測無患子總皂苷的方法，為無患子皂苷的質量控制提供基礎，推進無患子皂苷提取分離工業(yè)化應用的研究。

本發(fā)明的工作原理是：

無患子皂苷由親油性的苷元部分和親水的糖基構成。其親油性苷元部分又使其能被吸附樹脂吸附，進行第一步分離。無患子皂苷又為一種天然表面活性劑，具有表面活性，是泡沫分離的必要條件，其在氣流鼓泡作用下產(chǎn)生泡沫，第二步通過泡沫分離與其他雜質分離精制制得高純度無患子皂苷品。

附圖說明

圖1為泡沫分離裝置結構示意圖。

圖2為本發(fā)明實施例制備的無患子皂苷樣品圖。

圖3為本發(fā)明實施例制備的無患子皂苷ESI-MS色譜圖。

具體實施方式

實施例1

1)大孔樹脂吸附分離(一次大孔樹脂分離)

以無患子果皮為原料，粉碎，醇提2～3次，合并無患子提取液，噴霧干燥，得到無患子皂苷粗粉末。準確稱取0.5001g樣品粉末，去離子水定容至100ml，超聲15min，上D101樹脂柱，用去離子水300ml水洗除糖，20％醇洗100ml除其他雜質，70％醇洗100ml收集皂苷，旋轉蒸發(fā)，揮干溶劑后，收到皂苷粗粉末。70％醇洗可采用2次，2次70％醇洗均取0.5ml和0.1ml用紫外分光光度計分別測皂苷及總糖吸光度值，代入各自關系式中：

吸光度值(A)與齊墩果酸標準溶液濃度(C)的關系式為A＝48.9228C+0.0353，相關系數(shù)R＝0.9995。

吸光度值(A)與總糖標準溶液濃度(C)的關系式為A＝25.525C+0.0186，相關系數(shù)R＝0.9900。

70％醇洗中皂苷濃度1.533mg/ml，皂苷含量＝0.01022g，固含量＝0.0495g，純度＝20.64％。

大孔樹脂各階段無患子皂苷濃度參見表1。

表1

2)泡沫分離，得無患子皂苷(參見圖1)。

所述泡沫分離的具體方法可為：

樹脂產(chǎn)品粉末配制水溶液，從底端裝有砂芯11(作為氣體分布器)的層析柱1的上方原料液進口13進樣，空氣經(jīng)空氣泵3進入空氣流量計4，再進入緩沖瓶5和增濕瓶6后，通過層析柱1底端的空氣進口12，然后經(jīng)過層析柱1底端的砂芯11，分散成氣泡通過層析柱底的無患子皂苷粗提液，泡沫溢出后進入外層由下到上再從蒸餾管2頂端的泡沫液進口21通入60℃循環(huán)熱水的直型蒸餾管2，加速泡沫破裂，收集其底端泡沫液，待消泡后測溶液的體積，用分光光度法檢測泡沫液中無患子皂苷含量，揮干溶劑后測固含量濃度，計算其純度。該產(chǎn)品最終無患子皂苷純度為92％。

所述進樣可分三次進樣；所述空氣的氣速可為2min/L。

所述層析柱的內徑可為25mm，高可為300mm；所述蒸餾管的內徑可為35mm，高為600mm。

在圖1中，標記22為泡沫液出口，23為泡沫液接收器，24為熱水出口，25為熱水入口。

實施例2

1)大孔樹脂吸附分離(兩次大孔樹脂分離)

以無患子果皮為原料，粉碎，醇提2～3次，合并無患子提取液，噴霧干燥，得到無患子皂苷粗粉末。準確稱取1.0g樣品粉末，去離子水定容至250ml，超聲15min，上D101樹脂柱，用去離子水300ml水洗除糖,20％醇洗100ml除其他雜質，70％醇洗100ml收集皂苷，旋轉蒸發(fā)，揮干溶劑后，丙酮沉降，離心，揮干丙酮，加去離子水溶解，用飽和水正丁醇萃取三次，取有機層揮干溶劑后，配制20mg/mL無患子皂苷水溶液，以1mL/min速度上D101大孔樹脂，3BV去離子水洗后用1BV的70％乙醇洗脫，揮干溶劑收集粉末，皂苷均取0.1ml測吸光度，并測固含量，D101樹脂對無患子皂苷的飽和吸附量達481.57mg/mL，純度約35.51％。

2)泡沫分離

樹脂產(chǎn)品粉末配制0.2mg/mL水溶液，從底端裝有層析柱的上方進樣，分三次進料，共100mL，空氣氣速2min/L，經(jīng)空氣泵進入空氣流量計，進入一個緩沖瓶和增濕瓶后，通過層析柱底端的砂芯，分散成氣泡通過柱底的無患子皂苷粗提液，泡沫溢出后進入外層由下到上通入60℃循環(huán)熱水的直型蒸餾，加速泡沫破裂，待消泡后測溶液的體積，用分光光度法檢測泡沫液中無患子皂苷含量，揮干溶劑后測固含量濃度，計算求其純度。實驗裝置見說明書圖1。泡沫分離無患子皂苷收率19.68％，富集比1.96，純度92.92％。

為了判斷質控品的成分，選擇正離子模式進行無患子皂苷的ESI-MS檢測，圖中出現(xiàn)各皂苷的【M+Na】⁺準分子離子分。

無患子皂苷質控品成分分析見表2。

表2

利用泡沫分離與大孔樹脂聯(lián)用制得高純度的質控品可作為無患子皂苷檢測的對照品，通過各種圖譜結構表征，證明自制無患子皂苷質控品主要成分為Sapindosides C(分子量882)。

本發(fā)明實施例制備的無患子皂苷樣品圖參見圖2，本發(fā)明實施例制備的無患子皂苷ESI-MS色譜圖參見圖3。