本發(fā)明涉及一種檢測(cè)基因突變的試劑盒、反應(yīng)體系及方法，特別涉及一種檢測(cè)人類EGFR基因外顯子19缺失突變的試劑盒、反應(yīng)體系及方法。
背景技術(shù)：
：一直以來(lái)肺癌都位居全球癌癥相關(guān)死亡的首位。世界衛(wèi)生組織國(guó)際癌癥研究署發(fā)布的癌癥報(bào)告顯示：全球肺癌新發(fā)病例預(yù)測(cè)約161萬(wàn)例，死亡約138萬(wàn)例，分別占惡性腫瘤新發(fā)病例及死亡病例的13％及18％，居惡性腫瘤第一位，其中非小細(xì)胞肺癌(Non-SmallCellLungCancer，NSCLC)占肺癌的80％以上。盡管肺癌的診斷方法和治療手段不斷提高，肺癌的死亡率仍未得到有效控制，患者的預(yù)后較差，5年生存率仍<20％。人類表皮生長(zhǎng)因子受體家族(epidermalgrowthfactorreceptorfamily,EGFR家族)屬于酪氨酸激酶受體家族，是一種多功能糖蛋白，其廣泛分布于人體各組織細(xì)胞膜上，是原癌基因的表達(dá)產(chǎn)物，其基因位于第七號(hào)染色體短臂上(7p12)，由188.307K個(gè)堿基組成，共有28個(gè)外顯子，EGFR具有酪氨酸激酶(tyrosinekinase,TK)區(qū)，其是傳遞胞外信號(hào)到胞內(nèi)的重要途經(jīng)蛋白，并由外顯子18.24編碼。EGFR家族成員的結(jié)構(gòu)相似，都包括胞外段、跨膜區(qū)和胞內(nèi)段三部分。胞外段為受體與配體結(jié)合部，跨膜段為疏水部，將受體固定于細(xì)胞膜上，胞內(nèi)區(qū)有典型的ATP結(jié)合位點(diǎn)和酪氨酸激酶區(qū)，其酪氨酸激酶活性在調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖及分化中起著至關(guān)重要的作用。當(dāng)配體與受體結(jié)合后，引起受體的二聚化作用，形成同型或異型二聚體，二聚化的受體發(fā)生交聯(lián)磷酸化，即一個(gè)受體和另外一個(gè)受體上特定的酪氨酸殘基磷酸化，激活胞內(nèi)區(qū)的TK亞區(qū)，從而激發(fā)下一級(jí)信號(hào)傳導(dǎo)。非小細(xì)胞肺癌EGFR突變85％以上發(fā)生在外顯子19的缺失突變及外顯子21的L858R點(diǎn)突變。近年來(lái)，表皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子受體(EGFR)酪氨酸激酶抑制物(TKIs)吉非替尼、厄洛替尼和阿法替尼等被證明對(duì)具有EGFR激活突變的晚期非小細(xì)胞肺癌(NSCLC)患者具有顯著療效，EGFR-TKI成為非小細(xì)胞肺癌治療的里程碑。但同時(shí)，幾乎所有初始時(shí)對(duì)EGFR-TKI反應(yīng)良好的患者會(huì)在6-12個(gè)月內(nèi)出現(xiàn)耐藥、疾病進(jìn)展，稱為“獲得性耐藥”。許多研究已證實(shí)EGFR的突變狀態(tài)決定了腫瘤對(duì)EGFR-TKI的反應(yīng)，研究表明EGFR-TKI藥物對(duì)于EGFRL858R和EGFR外顯子19缺失突變的患者作用顯著，尤其是EGFR基因外顯子19發(fā)生缺失突變的非小細(xì)胞肺癌患者對(duì)該類藥物敏感，即受體酪氨酸激酶抑制劑藥物對(duì)這些患者有療效。因此EGFR外顯子exon19缺失突變準(zhǔn)確的檢測(cè)，可以為篩選靶向治療患者提供參考；同時(shí)可用于癌癥患者，特別是肺癌患者的高靈敏度早期復(fù)發(fā)監(jiān)測(cè)，以及用藥期間耐藥性突變監(jiān)測(cè)。但外顯子19缺失突變主要是發(fā)生9、12、15、18、24個(gè)核苷酸的框內(nèi)缺失突變，其缺失形式較多，為檢測(cè)其缺失情況帶來(lái)一定困難。目前檢測(cè)EGFR基因突變最常用的樣本來(lái)源是腫瘤的病理組織或細(xì)胞學(xué)標(biāo)本，但是組織取材均為有創(chuàng)操作，有時(shí)難以實(shí)施，且這些操作受腫瘤大小、部位、患者一般情況等影響，有時(shí)不能取得滿意的組織或組織量太少不能進(jìn)行基因突變檢測(cè)。并且隨著疾病的進(jìn)展和EGFR-TKIs耐藥性的出現(xiàn)，常常需要再次進(jìn)行分子生物學(xué)檢測(cè)，而組織取材為有創(chuàng)操作，不能便捷、反復(fù)進(jìn)行。近些年血漿游離DNA(ctDNA)被認(rèn)為是一種可能代替腫瘤組織用來(lái)檢測(cè)腫瘤特異性改變的樣本。腫瘤組織、腫瘤細(xì)胞壞死及脫落的腫瘤細(xì)胞進(jìn)入血液后凋亡釋放游離DNA進(jìn)入外周血。ctDNA用于腫瘤突變檢測(cè)優(yōu)勢(shì)在于：操作無(wú)創(chuàng)；在疾病的任一進(jìn)程中都可獲取；可以作為一種腫瘤標(biāo)記物，實(shí)現(xiàn)實(shí)時(shí)檢測(cè)和動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)；克服腫瘤組織的異質(zhì)性。因此，使用外周血游離DNA監(jiān)測(cè)患者EGFR基因突變狀態(tài)，探索患者EGFR-TKI耐藥機(jī)制及預(yù)測(cè)預(yù)后成為一條可行的途徑。然而，目前使用ctDNA檢測(cè)EGFR基因突變?nèi)杂幸恍┘夹g(shù)上的挑戰(zhàn)。1)ctDNA含量因人而異，并且大多數(shù)人含量較低；2)ctDNA片段相對(duì)小，約為180bp：3)ctDNA中腫瘤相關(guān)的DNA所占比例不同人差別較大，并且常因比例小而難以測(cè)出；4)以前的研究顯示，與腫瘤組織相比，ctDNA檢測(cè)EGFR突變靈敏度僅為43-66％。因此，高靈敏度的ctDNAEGFR基因突變檢測(cè)技術(shù)的發(fā)展十分重要。綜上所述，本領(lǐng)域迫切需要一種能夠基于非腫瘤組織，高靈敏度、高準(zhǔn)確性和高可靠性地檢測(cè)患者中EGFR外顯子19缺失突變的方法。公開(kāi)于該
背景技術(shù)：
部分的信息僅僅旨在增加對(duì)本發(fā)明的總體背景的理解，而不應(yīng)當(dāng)被視為承認(rèn)或以任何形式暗示該信息構(gòu)成已為本領(lǐng)域一般技術(shù)人員所公知的現(xiàn)有技術(shù)。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：本發(fā)明的目的在于提供一種檢測(cè)人類EGFR基因突變的試劑盒、反應(yīng)體系及方法，該試劑盒針對(duì)EGFR基因外顯子19缺失突變?cè)O(shè)計(jì)了特定序列的引物對(duì)和特定序列的探針，在優(yōu)化的反應(yīng)體系中通過(guò)ThermoQuantStudio3DdigitalPCR平臺(tái)的方法，實(shí)現(xiàn)對(duì)EGFR基因外顯子19缺失突變的高靈敏度檢測(cè)；并且在檢測(cè)EGFR基因外顯子19缺失突變的陰陽(yáng)性的同時(shí)還可以獲得樣本中EGFR基因外顯子19缺失突變的比例；另外該檢測(cè)可以同時(shí)檢測(cè)18種不同類型的EGFR基因外顯子19缺失形式，大大提高了通用性，從而為EGFR靶向治療提供參考；進(jìn)一步的本申請(qǐng)中可檢測(cè)的樣本來(lái)源多樣，既可以是腫瘤組織，也可以是ctDNA，擴(kuò)大了該試劑盒、反應(yīng)體系和方法的使用范圍。本發(fā)明的具體技術(shù)方案如下：一種檢測(cè)人類EGFR基因外顯子19缺失突變的試劑盒，包括：具有如SEQIDNO:1所示序列的上游引物、具有如SEQIDNO:2所示序列的下游引物、具有如SEQIDNO:3所示序列的檢測(cè)外顯子19缺失突變的熒光探針和具有如SEQIDNO:4所示序列的檢測(cè)擴(kuò)增后總DNA的熒光探針。上游引物SEQIDNO:1的序列為GAAAGTTAAAATTCCCGTCGCT，下游引物SEQIDNO:2的序列為AGCAGAAACTCACATCGAGG。檢測(cè)外顯子19缺失突變的熒光探針序列SEQIDNO:3為TCCTTGTTGGCTTTC，檢測(cè)擴(kuò)增后總DNA的熒光探針序列SEQIDNO:4為AGGAATTAAGAGAAGCAAC。檢測(cè)外顯子19缺失突變的熒光探針5’端連接有熒光報(bào)告基團(tuán)，優(yōu)選為VIC，檢測(cè)外顯子19缺失突變的熒光探針3’端連接有淬滅基團(tuán)，優(yōu)選為MGB；檢測(cè)擴(kuò)增后總DNA的熒光探針5’端連接有熒光報(bào)告基團(tuán)，且該熒光報(bào)告基團(tuán)不同于檢測(cè)外顯子19缺失突變的熒光探針中的熒光報(bào)告基團(tuán)，優(yōu)選為FAM,檢測(cè)擴(kuò)增后總DNA的熒光探針3’端連接有淬滅接團(tuán)，優(yōu)選為MGB。上述試劑盒在另一種實(shí)現(xiàn)方式中，所述上游引物、下游引物、檢測(cè)外顯子19缺失突變的熒光探針和檢測(cè)擴(kuò)增后總DNA的熒光探針均以引物探針混合液的形式存在，即所述上游引物、下游引物、檢測(cè)外顯子19缺失突變的熒光探針和檢測(cè)擴(kuò)增后總DNA的熒光探針均溶解在同一TE緩沖液中，所述上游引物在引物探針混合液中的濃度為12μM，所述下游引物在引物探針混合液中的濃度為12μM，所述檢測(cè)外顯子19缺失突變的熒光探針在引物探針混合液中的濃度為3μM，所述檢測(cè)擴(kuò)增后總DNA的熒光探針在引物探針混合液中的濃度為3μM。上述試劑盒在另一種實(shí)現(xiàn)方式中，還包括數(shù)字PCR反應(yīng)預(yù)混液，優(yōu)選QuantStudioTM3DDigitalPCRMasterMixv2。上述試劑盒在另一種實(shí)現(xiàn)方式中，還包括陽(yáng)性質(zhì)控品，所述陽(yáng)性質(zhì)控品通過(guò)以下方式制備獲得：將EGFR外顯子19缺失突變細(xì)胞系基因組DNA與野生型細(xì)胞系基因組DNA混合后使含EGFR基因外顯子19缺失突變的DNA比例占總DNA的約1.0％，將所得混合DNA加到Covaris超聲管中并進(jìn)行超聲處理，獲得打斷成為與ctDNA片段長(zhǎng)度接近的180bp左右的片段化DNA。上述試劑盒在另一種實(shí)現(xiàn)方式中，還包括陰性質(zhì)控品，所述陰性質(zhì)控品通過(guò)以下方式制備獲得：將不含有EGFR外顯子19缺失突變的EGFR野生型細(xì)胞系基因組DNA加到Covaris超聲管中并進(jìn)行超聲處理，獲得打斷成為與ctDNA片段長(zhǎng)度接近的180bp左右的片段化DNA。一種檢測(cè)人類EGFR基因外顯子19缺失突變的PCR反應(yīng)體系，包括：其中所述引物探針混合液中包括具有如SEQIDNO:1所示序列的上游引物、具有如SEQIDNO:2所示序列的下游引物、具有如SEQIDNO:3所示序列的檢測(cè)外顯子19缺失突變的熒光探針、具有如SEQIDNO:4所示序列的檢測(cè)擴(kuò)增后總DNA的熒光探針；上游引物、下游引物、檢測(cè)外顯子19缺失突變的熒光探針和檢測(cè)擴(kuò)增后總DNA的熒光探針在PCR反應(yīng)體系的終濃度分別為800nM、800nM、200nM和200nM。上述PCR反應(yīng)體系在另一種實(shí)現(xiàn)方式中，所述DNA模板的來(lái)源為腫瘤組織中提取的DNA或血漿游離DNA，尤其是血漿游離DNA。一種檢測(cè)人類EGFR基因外顯子19缺失突變的芯片式數(shù)字PCR方法，包括以下步驟：1.配制上述檢測(cè)人類EGFR基因外顯子19缺失突變的反應(yīng)體系；2.把反應(yīng)體系上樣到數(shù)字PCR芯片中；3.把數(shù)字PCR芯片放入專用PCR儀中，進(jìn)行PCR擴(kuò)增；4.從專用PCR儀中取出芯片并放至室溫后，將芯片放入芯片掃描儀中掃描熒光信號(hào)；5.計(jì)算機(jī)根據(jù)熒光信號(hào)計(jì)算突變比例。上述芯片式數(shù)字PCR方法在另一種實(shí)現(xiàn)方式中，所述PCR擴(kuò)增的程序?yàn)椋?1)96℃，10min；(2)繼續(xù)進(jìn)行39個(gè)循環(huán)，每個(gè)循環(huán)包括57℃進(jìn)行2min，然后98℃進(jìn)行30sec；(3)39個(gè)循環(huán)之后57℃進(jìn)行2min；在10℃下保持不超過(guò)12小時(shí)。常規(guī)芯片式數(shù)字PCR的檢測(cè)原理如下：數(shù)字PCR芯片上含有2萬(wàn)個(gè)納米級(jí)微孔，用Chip-Loader將混合好的PCR反應(yīng)體系加樣到數(shù)字PCR芯片上，混合液由于親疏水作用進(jìn)入芯片的微孔中并在專用PCR儀中進(jìn)行PCR反應(yīng)。微孔中的PCR反應(yīng)體系包含DNA模板，PCR擴(kuò)增結(jié)束后，野生型DNA和突變型DNA分別對(duì)應(yīng)的熒光信號(hào)情況會(huì)反應(yīng)在含有相應(yīng)DNA模板的微孔中，PCR反應(yīng)體系沒(méi)有進(jìn)入的微孔則沒(méi)有擴(kuò)增后的熒光信號(hào)產(chǎn)生。用芯片掃描儀掃描并讀取這些熒光信號(hào)信息，再根據(jù)泊松分布原理可以計(jì)算出DNA模板的拷貝數(shù)。由于數(shù)字PCR在進(jìn)行結(jié)果判讀時(shí)僅判斷有無(wú)擴(kuò)增，不依賴于Ct值，對(duì)PCR反應(yīng)抑制劑的耐受能力大大提高，不需要參考品和標(biāo)準(zhǔn)曲線就可以精確定量。本申請(qǐng)?jiān)噭┖兄袡z測(cè)外顯子19缺失的熒光探針的設(shè)計(jì)原理與常規(guī)芯片式數(shù)字PCR不同，檢測(cè)外顯子19缺失的熒光探針序列是與外顯子19上易發(fā)生缺失的區(qū)域序列相對(duì)應(yīng)。這種設(shè)計(jì)使得當(dāng)外顯子19上易發(fā)生缺失的區(qū)域出現(xiàn)任何一種形式的缺失及突變時(shí)，該探針無(wú)法結(jié)合，從而沒(méi)有熒光信號(hào)。而檢測(cè)擴(kuò)增后總DNA的熒光探針被設(shè)計(jì)為與外顯子19不發(fā)生缺失的區(qū)域結(jié)合，且與突變型探針沒(méi)有區(qū)域交聯(lián)，因此不管有沒(méi)有發(fā)生外顯子19的缺失突變，該探針都能與所有擴(kuò)增所得DNA結(jié)合并發(fā)出熒光信號(hào)。為了方便用戶使用，使用本申請(qǐng)中試劑盒的方式仍按照常規(guī)芯片式數(shù)字PCR的操作方式進(jìn)行，但為了使按照常規(guī)芯片式數(shù)字PCR的方法、根據(jù)熒光信號(hào)信息和泊松分布原理計(jì)算出的DNA模板拷貝數(shù)同樣適用于本申請(qǐng)中的實(shí)際結(jié)果，需要控制以下內(nèi)容：控制反應(yīng)體系的DNA模版上樣量使芯片上每個(gè)微孔中分布的模版量為1或0，同時(shí)出現(xiàn)2個(gè)拷貝的幾率非常小。如果使用Thermo公司的3DDigitalPCRSystem，控制反應(yīng)體系的DNA模版上樣量為20-40ng，可以保證按照常規(guī)芯片式數(shù)字PCR的方法、根據(jù)熒光信號(hào)信息和泊松分布原理計(jì)算出的DNA模板拷貝數(shù)與本申請(qǐng)中的實(shí)際結(jié)果的誤差不大于5％。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有如下有益效果：1.本申請(qǐng)根據(jù)EGFR基因外顯子19缺失位點(diǎn)設(shè)計(jì)了特異性的引物和探針，使得在ThermoQuantStudio3DdigitalPCR平臺(tái)上檢測(cè)靈敏度達(dá)到萬(wàn)分之五～千分之一，與ARMS-PCR相比，靈敏度提高；并且在檢測(cè)外顯子19缺失突變的陰陽(yáng)性的同時(shí)還可以獲得樣本中該突變的比例；另外該檢測(cè)可以可在一張芯片上同時(shí)檢測(cè)18種不同類型的EGFR基因外顯子19缺失形式，大大提高了通用性；可以更好的進(jìn)行靶向藥物的選擇，病情監(jiān)測(cè)和預(yù)后評(píng)估等。2.該數(shù)字PCR可以擴(kuò)增小于100bp的片段，因此既可用于腫瘤組織提取的DNA，也可以用于ctDNA的擴(kuò)增。3.與液滴式數(shù)字PCR(digitaldropletPCR)相比，芯片式數(shù)字PCR無(wú)需對(duì)PCR反應(yīng)體系進(jìn)行液滴化處理，因此整個(gè)檢測(cè)過(guò)程時(shí)間較短且不存在液滴不均一的情況，理論上結(jié)果穩(wěn)定；并且成本較液滴式數(shù)字PCR低，反應(yīng)通量靈活(1～24個(gè)樣本均可)，液滴式數(shù)字PCR一次反應(yīng)為8個(gè)。4.與NGSCtdna測(cè)序?qū)Ρ?，時(shí)間短，速度快，準(zhǔn)確性高。附圖說(shuō)明圖1是本發(fā)明實(shí)施例3中EGFR基因外顯子19缺失突變比例26％的樣品的檢測(cè)結(jié)果；圖2是本發(fā)明實(shí)施例3中EGFR基因外顯子19缺失突變比例1.5％的樣品的檢測(cè)結(jié)果；圖3是本發(fā)明實(shí)施例3中EGFR基因外顯子19缺失突變比例0.1％的樣品的檢測(cè)結(jié)果；圖4是本發(fā)明中EGFR基因無(wú)外顯子19缺失突變的野生型樣品進(jìn)行檢測(cè)的檢測(cè)結(jié)果；圖1-圖4中，顯示的每個(gè)點(diǎn)對(duì)應(yīng)芯片上的一個(gè)微孔，其中：既沒(méi)有FAM熒光信號(hào)也沒(méi)有VIC熒光信號(hào)的點(diǎn)代表該微孔沒(méi)有進(jìn)入反應(yīng)體系，因此沒(méi)有任何擴(kuò)增信號(hào)(即：區(qū)域1)；既有FAM熒光信號(hào)也有VIC熒光信號(hào)的點(diǎn)(即：區(qū)域2)代表該微孔只進(jìn)入了僅含野生型模板的反應(yīng)體系，有FAM擴(kuò)增信號(hào)代表檢測(cè)擴(kuò)增后總DNA的熒光探針正常結(jié)合并且反應(yīng)體系正常擴(kuò)增，有VIC擴(kuò)增信號(hào)代表外顯子19未出現(xiàn)缺失突變，所以檢測(cè)外顯子19缺失突變的熒光探針能正常結(jié)合并且反應(yīng)體系正常擴(kuò)增；有FAM熒光信號(hào)但沒(méi)有VIC熒光信號(hào)的點(diǎn)(即：區(qū)域3)代表該微孔只進(jìn)入了僅含突變型模板的反應(yīng)體系，有FAM擴(kuò)增信號(hào)代表檢測(cè)擴(kuò)增后總DNA的熒光探針正常結(jié)合并且反應(yīng)體系正常擴(kuò)增，沒(méi)有VIC擴(kuò)增信號(hào)代表外顯子19出現(xiàn)缺失突變，所以檢測(cè)外顯子19缺失突變的熒光探針不能正常結(jié)合。具體實(shí)施方式下面結(jié)合附圖，對(duì)本發(fā)明的具體實(shí)施方式進(jìn)行詳細(xì)描述，但應(yīng)當(dāng)理解本發(fā)明的保護(hù)范圍并不受具體實(shí)施方式的限制。實(shí)施例1檢測(cè)人類EGFR基因外顯子19缺失突變的試劑盒的組成一種檢測(cè)人類EGFR基因外顯子19缺失突變的試劑盒，包括：引物探針混合液和數(shù)字PCR反應(yīng)預(yù)混液，其中：引物探針混合液是在TE緩沖液中溶解有具有如SEQIDNO:1所示序列的上游引物、具有如SEQIDNO:2所示序列的下游引物、具有如SEQIDNO:3所示序列的檢測(cè)外顯子19缺失突變的熒光探針和具有如SEQIDNO:4所示序列的檢測(cè)擴(kuò)增后總DNA的熒光探針，檢測(cè)外顯子19缺失突變的熒光探針5’端連接有熒光報(bào)告基團(tuán)，為VIC，檢測(cè)外顯子19缺失突變的熒光探針3’端連接有淬滅基團(tuán)，為MGB；檢測(cè)擴(kuò)增后總DNA的熒光探針5’端連接有熒光報(bào)告基團(tuán)，且該熒光報(bào)告基團(tuán)不同于檢測(cè)外顯子19缺失突變的熒光探針中的熒光報(bào)告基團(tuán)，為FAM,檢測(cè)擴(kuò)增后總DNA的熒光探針3’端連接有淬滅接團(tuán)，為MGB。其中：上游引物和下游引物在引物探針混合液中的濃度均為12μM，檢測(cè)外顯子19缺失突變的熒光探針和檢測(cè)擴(kuò)增后總DNA的熒光探針在引物探針混合液中的濃度均為3μM，引物探針混合液的配制方法為：將上游引物、下游引物、檢測(cè)外顯子19缺失突變的熒光探針和檢測(cè)擴(kuò)增后總DNA的熒光探針?biāo)姆N成分的干粉分別用TE緩沖液稀釋到30μM，然后按照上游引物：下游引物：檢測(cè)外顯子19缺失突變的熒光探針：檢測(cè)擴(kuò)增后總DNA的熒光探針＝4：4：1：1體積比混合，混合后的產(chǎn)物即為引物探針混合液；數(shù)字PCR反應(yīng)預(yù)混液為QuantStudioTM3DDigitalPCRMasterMixv2。檢測(cè)人類EGFR基因外顯子19缺失突變的試劑盒還可以包括：陽(yáng)性質(zhì)控品和陰性質(zhì)控品，陽(yáng)性質(zhì)控品通過(guò)以下方式制備獲得：將EGFR外顯子19缺失突變細(xì)胞系基因組DNA與野生型細(xì)胞系基因組DNA混合后使含EGFR基因外顯子19缺失突變的DNA比例占總DNA的約1.0％，之后將所得混合DNA加到Covaris超聲管中并進(jìn)行超聲處理，獲得打斷成為與ctDNA片段長(zhǎng)度接近的180bp左右的片段化DNA；陰性質(zhì)控品通過(guò)以下方式制備獲得：將不含有EGFR外顯子19缺失突變的EGFR野生型細(xì)胞系基因組DNA加到Covaris超聲管中并進(jìn)行超聲處理，獲得打斷成為與ctDNA片段長(zhǎng)度接近的180bp左右的片段化DNA。實(shí)施例2檢測(cè)人類EGFR基因外顯子19缺失突變的方法1.采用實(shí)施例1所述試劑盒；2.按下表配制PCR反應(yīng)體系：3.按照CHIP-LOADER的說(shuō)明書(shū)，將步驟2配制好的PCR反應(yīng)體系的混合液加樣至數(shù)字PCR芯片中，并用礦物油覆蓋芯片，密封好芯片并檢查確保無(wú)泄露；4.把芯片放入專用PCR儀中，按照以下擴(kuò)增程序進(jìn)行設(shè)置；5.擴(kuò)增結(jié)束后，從PCR儀中取出芯片，室溫放置10min，加入芯片掃描儀中讀取；6.計(jì)算機(jī)根據(jù)熒光信號(hào)計(jì)算突變比例。實(shí)施例3使用實(shí)施例2中的方法對(duì)標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行檢測(cè)將野生型標(biāo)準(zhǔn)品和突變比例分別為34％、1.5％和0.1％的EGFR基因外顯子19c.2236_2250delp.E746_A750del缺失突變標(biāo)準(zhǔn)品用實(shí)施例2中的方法進(jìn)行檢測(cè)、計(jì)算后得出含EGFR基因外顯子19c.2236_2250delp.E746_A750del缺失突變的標(biāo)準(zhǔn)品中突變比例分別為：34.02％、1.49％和0.09％。檢測(cè)方法的準(zhǔn)確性符合預(yù)期，其檢測(cè)結(jié)果如圖1-圖3所示，野生型標(biāo)準(zhǔn)品的檢測(cè)結(jié)果如圖4所示。其中：含突變的標(biāo)準(zhǔn)品是通過(guò)以下方式獲得的：將已知突變比例的EGFR突變型細(xì)胞系基因組DNA和野生型細(xì)胞系基因組DNA按照不同比例混合后再加到Covaris超聲管中并進(jìn)行超聲處理，獲得打斷成為與ctDNA片段長(zhǎng)度接近的180bp左右的片段化DNA。野生型標(biāo)準(zhǔn)品是通過(guò)以下方式獲得的：將不含有EGFR外顯子19缺失突變的EGFR野生型細(xì)胞系基因組DNA打斷成為與ctDNA片段長(zhǎng)度接近的180bp左右的片段化DNA。從圖3中可以看出使用本申請(qǐng)?jiān)噭┖泻蜋z測(cè)方法，檢測(cè)EGFR基因外顯子19缺失突變的靈敏度可達(dá)到0.1％。將僅含有以下表1中特定一種EGFR外顯子19缺失突變的標(biāo)準(zhǔn)品用上述同樣的方法進(jìn)行檢測(cè)，所獲得結(jié)果的準(zhǔn)確性同樣可以達(dá)到以上標(biāo)準(zhǔn)，靈敏度也可達(dá)到0.1％。另外，將各標(biāo)準(zhǔn)品混合獲得同時(shí)含有以下18種EGFR外顯子19缺失突變的混合標(biāo)準(zhǔn)品，用上述同樣的方法進(jìn)行檢測(cè)，所獲得結(jié)果的準(zhǔn)確性同樣可以達(dá)到以上標(biāo)準(zhǔn)，靈敏度也可達(dá)到0.1％。表1c.2235_2249delp.E746_A750delc.2236_2250delp.E746_A750delc.2236_2253delp.E746_T751delc.2237_2251delp.E746_T751>Ac.2237_2254delp.E746_S752>Ac.2238_2255delp.E746_S752>Dc.2239_2247delp.L747_E749delc.2239_2253delp.L747_T751delc.2239_2256delp.L747_S752delc.2240_2251delp.L747_T751>Sc.2240_2254delp.L747_T751delc.2240_2257delp.L747_P753>Sc.2235_2252>AAT(complex)p.E746_T751>Ic.2237_2250>T(complex)p.E746_S752>Vc.2238_2248>GC(complex)p.L747_A750>Pc.2238_2252>GCA(complex)p.L747_T751>Qc.2239_2248TTAAGAGAAG>C(complex)p.L747_A750>Pc.2239_2251>C(complex):p.L747_T751>P表1中的標(biāo)準(zhǔn)品均可通過(guò)商業(yè)渠道購(gòu)買獲得實(shí)施例4使用實(shí)施例2中的方法對(duì)實(shí)際樣品進(jìn)行檢測(cè)使用實(shí)施例2中的方法對(duì)20例臨床為3～4期非小細(xì)胞肺癌病人的血樣和與血樣對(duì)應(yīng)的組織樣本進(jìn)行檢測(cè)。一、血樣中ctDNA的檢測(cè)：1.混勻保存在EDTA抗凝管中的全血樣本10ml(樣本采集不超過(guò)3小時(shí))并轉(zhuǎn)移到15ml離心管中，2000g、4℃離心10min，取澄清的血漿；2.將血漿分裝到1.5ml管中，放置于4℃離心機(jī)中設(shè)置轉(zhuǎn)速為16000g離心15min，取澄清血漿；3.用ctDNA提取試劑盒(ThermoFisherScientific公司的MagMAXTMCell-FreeDNAIsolationKit)，按照說(shuō)明書(shū)操作提取ctDNA；4.ctDNA經(jīng)質(zhì)檢及Qubit3.0定量后確認(rèn)總量不少于20ng，按照實(shí)施例2中的檢測(cè)方法進(jìn)行檢測(cè)。二、組織樣本中的基因組DNA的檢測(cè)：與血樣對(duì)應(yīng)的20例組織樣本用EGFR突變檢測(cè)試劑盒(ARMS法)做了檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)的陽(yáng)性樣本繼續(xù)用sanger測(cè)序做了驗(yàn)證，結(jié)果一致。三、檢測(cè)結(jié)果如下：結(jié)果顯示，20例樣本的組織檢測(cè)與ctDNA檢測(cè)結(jié)果完全一致，說(shuō)明本試劑盒達(dá)到了非常好的效果。前述對(duì)本發(fā)明的具體示例性實(shí)施方案的描述是為了說(shuō)明和例證的目的。這些描述并非想將本發(fā)明限定為所公開(kāi)的精確形式，并且很顯然，根據(jù)上述教導(dǎo)，可以進(jìn)行很多改變和變化。對(duì)示例性實(shí)施例進(jìn)行選擇和描述的目的在于解釋本發(fā)明的特定原理及其實(shí)際應(yīng)用，從而使得本領(lǐng)域的技術(shù)人員能夠?qū)崿F(xiàn)并利用本發(fā)明的各種不同的示例性實(shí)施方案以及各種不同的選擇和改變。本發(fā)明的范圍意在由權(quán)利要求書(shū)及其等同形式所限定。當(dāng)前第1頁(yè)1 2 3