本發(fā)明屬于分子生物學(xué)技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種粘質(zhì)沙雷氏菌磷脂酶A1基因擴(kuò)增、測序方法及其引物。

背景技術(shù)：

粘質(zhì)沙雷氏菌(Serratia marcescens)又稱靈桿菌，一種產(chǎn)生鮮紅色素的細(xì)菌，存在于空氣和水中，可生長在動(dòng)、植物性食品中。為細(xì)菌中最小者，約0.5×(0.5～1.0)微米。近球形短桿菌，但形態(tài)多樣。粘質(zhì)沙雷氏菌廣泛分布于自然界，是水和土壤中的常居菌群，亦是臨床上常見的條件致病菌，在機(jī)體免疫功能降低時(shí)可引起肺部和尿道感染以及敗血癥。

磷脂酶A1是一類水解磷脂sn-1位酰基的酶類，廣泛存在于自然界，在動(dòng)物、植物和微生物中均有發(fā)現(xiàn)。含有磷脂酶A1的微生物主要包括耶和森菌、灰色鏈霉菌、曲霉菌、假單胞桿菌和沙雷氏菌等。磷脂酶A1主要應(yīng)用于食品、制藥和生物燃料產(chǎn)業(yè)。磷脂酶A1在工業(yè)上得到廣泛應(yīng)用，目前研究材料多來自于沙雷氏菌屬。磷脂酶A1基因(plaA)編碼產(chǎn)生磷脂酶，plaS在plaA的下游，也參與磷脂酶基因的表達(dá)，plaS編碼一段為224個(gè)氨基酸的蛋白，該蛋白沒有酶活性，可能對于磷脂酶A1基因的表達(dá)有輔助作用。因此，為了后續(xù)plaA和plaS的研究，建立plaA和plaS全序列擴(kuò)增和測序方法是十分必要的。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

根據(jù)以上現(xiàn)有技術(shù)的不足，本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是提出一種粘質(zhì)沙雷氏菌磷脂酶A1基因擴(kuò)增、測序方法及其引物，目的是能夠快速、簡便的擴(kuò)增粘質(zhì)沙雷氏菌plaA和plaS的全序列。

為了解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明采用的技術(shù)方案為：

一種用于擴(kuò)增粘質(zhì)沙雷氏菌磷脂酶A1基因的引物，所述引物包括第一引物對和第二引物對，所述第一引物對包括序列號為SEQ ID NO.1的KLSERF3和序列號為SEQ ID NO.2的KLSERR3；所述第二引物對包括序列號為SEQ ID NO.3的KLPERF4和序列號為SEQ ID NO.4的KLSERR4。

引物序列如下：

KLSERF3(SEQ ID NO.1)：5′-TTCCGCATCTCCAACAACCT-3′

KLSERR3(SEQ ID NO.1)：5′-GCCGCGATCTTCACCTATT-3′

KLPERF4(SEQ ID NO.1)：5′-TCGCTTGCTCACACTCACC-3′

KLSERR4(SEQ ID NO.1)：5′-TTGCCGTTGCTCTTCTCGTTC-3′

本發(fā)明還提供所述引物在粘質(zhì)沙雷氏菌磷脂酶A1基因測序中的應(yīng)用。

所述粘質(zhì)沙雷氏菌磷脂酶A1基因的測序方法，包括如下步驟：

(1)提取待測樣品的全基因組DNA；

(2)采用所述引物對全基因組DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增；

(3)對步驟(2)擴(kuò)增后的產(chǎn)物片段進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳檢測，割取目的條帶，并經(jīng)過純化后進(jìn)行測序，得到兩個(gè)基因片段；

(4)對測序結(jié)果進(jìn)行拼接，得到兩個(gè)基因的全序列。

步驟(1)采用天根生化科技(北京)有限公司提供的細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒提取粘質(zhì)沙雷氏菌全基因組，并通過瓊脂糖凝膠電泳檢測質(zhì)量。

步驟(2)首先根據(jù)plaA和plaS在粘質(zhì)沙雷氏菌菌株Db11全基因組序列中的相對位置，在其上下游保守區(qū)域利用Oligo7軟件設(shè)計(jì)兩對專用性引物，之后采用plaA和plaS兩對專用引物對奶粘質(zhì)沙雷氏菌全基因組DNA進(jìn)行擴(kuò)增，分別得到兩個(gè)擴(kuò)增片段。

所述測序方法還包括采用不同菌株的粘質(zhì)沙雷氏菌擴(kuò)增測序并驗(yàn)證引物的專用性。

步驟(3)中PCR擴(kuò)增后產(chǎn)物的兩種條帶所含有的DNA片段的長度分別為963bp和756bp。

為了得到更好的擴(kuò)增效果，步驟(2)中PCR擴(kuò)增是以25μl的PCR擴(kuò)增體系為基準(zhǔn)，每條引物的濃度分別為2.2μl,模板的用量為2μl。步驟(2)所述PCR擴(kuò)增的過程中退火溫度為50～60℃。

PCR擴(kuò)增采用25μl反應(yīng)體系：10×PCR bμffer 2.5μl,dNTPs(2mmol/L)3μl,DMSO(二甲基亞砜)0.5μl；上下游引物各2.2μl,,TaKaRa Taq(5Μ/μl)0.13μl,模板2μl,滅菌水13.47μl。

PCR擴(kuò)增反應(yīng)條件為：95℃預(yù)變性3min；94℃變性30s，50～60℃退火30s,72℃延伸1min,共36個(gè)循環(huán)；最后再72℃延伸10min。

本發(fā)明有益效果是:本發(fā)明的引物有著很好的擴(kuò)增性能，在退火溫度梯度為50℃～60℃范圍內(nèi)均能獲得明亮的條帶。用本發(fā)明的專用引物來擴(kuò)增不同菌株的粘質(zhì)沙雷氏菌plaA和plaS基因均能得到全序列，且本發(fā)明提供的粘質(zhì)沙雷氏菌plaA和plaS全基因序列可以應(yīng)用到系統(tǒng)進(jìn)化、磷脂酶功能、工業(yè)產(chǎn)磷脂酶等多個(gè)方面研究。本發(fā)明方法技術(shù)具有速度快，實(shí)用性強(qiáng)，成本低，重復(fù)性好，能快速有效地獲得plaA、plaS全基因序列。

附圖說明

下面對本說明書附圖所表達(dá)的內(nèi)容及圖中的標(biāo)記作簡要說明：

圖1是本發(fā)明的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳圖。

其中，泳道1～7是第一對引物KLSERF3和KLSERR3擴(kuò)增的條帶；泳道8～14是第二對引物KLPERF4和KLSERR4擴(kuò)增的條帶；泳道M為分子量標(biāo)記。

具體實(shí)施方式

下通過對實(shí)施例的描述，對本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)的說明，以幫助本領(lǐng)域技術(shù)人員對本發(fā)明的發(fā)明構(gòu)思、技術(shù)方案有更完整、準(zhǔn)確和深入的理解。

一種粘質(zhì)沙雷氏菌plaA和plaS全序列擴(kuò)增及測序方法，包括以下步驟：

(1)采用天根生化科技(北京)有限公司提供的細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒提取粘質(zhì)沙雷氏菌全基因組，并通過瓊脂糖凝膠電泳檢測質(zhì)量。

(2)根據(jù)plaA和plaS在粘質(zhì)沙雷氏菌菌株Db11全基因組序列中的相對位置，在其上下游保守區(qū)域利用Oligo7軟件設(shè)計(jì)兩對專用性引物，如下表1所示，

表1引物

第一對上游引物序列是KLSERF3有20個(gè)堿基TTCCGCATCTCCAACAACCT，下游引物序列是KLSERR3有19個(gè)堿基GCCGCGATCTTCACCTATT；

第二對上游引物是KLPERF4有19個(gè)堿TCGCTTGCTCACACTCACC，下游引物是KLSERR4有21個(gè)堿TTGCCGTTGCTCTTCTCGTTC

(3)采用plaA和plaS兩對專用引物對奶粘質(zhì)沙雷氏菌全基因組DNA進(jìn)行擴(kuò)增，分別得到兩個(gè)擴(kuò)增片段。

①采用第一引物對KLSERF3與KLSERR3對粘質(zhì)沙雷氏菌進(jìn)行擴(kuò)增，得到擴(kuò)增片段。

PCR擴(kuò)增采用25μl反應(yīng)體系：10×PCR bμffer 2.5μl,dNTPs(2mmol/L)3μl,DMSO 0.5μl；上下游引物各2.2μl,,TaKaRa Taq(5Μ/μl)0.13μl,模板2μl,滅菌水13.47μl。PCR反應(yīng)程序?yàn)椋?5℃預(yù)變性3min；94℃變性30s，50～60℃退火30s,72℃延伸1min,共36個(gè)循環(huán)；最后再72℃延伸10min。

②采用第二引物對KLSERF4與KLSERR4對粘質(zhì)沙雷氏菌進(jìn)行擴(kuò)增，得到擴(kuò)增片段。

PCR擴(kuò)增采用25μl反應(yīng)體系：10×PCR bμffer 2.5μl,dNTPs(2mmol/L)3μl,DMSO 0.5μl；上下游引物各2.2μl,,TaKaRa Taq(5Μ/μl)0.13μl,模板2μl,滅菌水13.47μl。PCR反應(yīng)程序?yàn)椋?5℃預(yù)變性3min；94℃變性30s，50～60℃退火30s,72℃延伸1min,共36個(gè)循環(huán)；最后再72℃延伸10min。

(4)分別對兩對專用引物所擴(kuò)增的片段進(jìn)行電泳檢測，割取目的條帶，并經(jīng)過DNA膠回收試劑盒純化后,最后送至通用生物系統(tǒng)(安徽)有限公司進(jìn)行測序，得到兩個(gè)基因片段。瓊脂糖凝膠電泳圖如圖1所示：其中泳道1～7是第一對引物KLSERF3和KLSERR3擴(kuò)增的條帶；泳道8～14是第二對引物KLPERF4和KLSERR4擴(kuò)增的條帶；泳道M為分子量標(biāo)記。泳道1～7是在退火溫度為50℃～60℃范圍內(nèi)擴(kuò)增的；泳道8～14是在退火溫度為50℃～60℃范圍內(nèi)擴(kuò)增的。

其具體操作流程如下：

1)柱平衡：向吸附柱CA2中(吸附柱放入收集管中)加入平衡液BL 500μl，12000rpm離心60秒后，收集管中的廢液倒掉，把吸附柱重新放回收集管中；

2)切下含單一目的DNA的膠塊，放入1.5或2mL的EP管中，并用記號筆作上標(biāo)記；

3)向2)中的EP管加入500μl的溶膠液PN，50℃水浴10min,使膠塊溶解；

4)將上一步中所得溶液移入柱平衡處理過的CA2中，室溫放置2分鐘后，12000rpm離心60秒，收集管中的廢液倒掉，將吸附柱CA2放回到收集管中；

5)向上一步的吸附柱CA2中加入600μl漂洗液PW，靜置2分鐘，12000rpm離心60秒，倒掉收集管中的廢液，將吸附柱CA2重新放回到收集管中；

6)重復(fù)上述步驟5)；

7)將步驟6)得到的CA2和收集管的組合，12000rpm離心2分鐘，盡量出凈漂洗液，將吸附柱置于室溫?cái)?shù)分鐘，徹底晾干，防止殘留液對后續(xù)實(shí)驗(yàn)的影響；

8)將步驟7)得到的吸附柱CA2放入一個(gè)已滅菌的1.5mL EP管中，向吸附膜中間位置懸空滴加一定量的洗脫緩沖液EB，室溫放置2分鐘，12000rpm離心2分鐘收集DNA溶液；

9)為了提高DNA的回收量，可將步驟8)得到的DNA溶液重新加入CA2中，室溫放置2分鐘，12000rpm離心2分鐘，再收集DNA溶液。

10)取2μl步驟9)得到的DNA進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳檢測回收效率，然后貼上標(biāo)簽，置于-40℃冰箱中保存。

(5)利用Seqμencher4.15軟件對測序結(jié)果進(jìn)行拼接，除去多余的片段，得到plaA全序列長度為963bp，plaS全序列長度為756bp。

(6)利用不同菌株的粘質(zhì)沙雷氏菌對兩對引物的專用性進(jìn)行擴(kuò)增驗(yàn)證。具體步驟按照步驟(3)的方法進(jìn)行操作。

實(shí)施例1沙雷氏菌系統(tǒng)進(jìn)化研究

1.1粘質(zhì)沙雷氏菌ESE-2014基因組提取

采用細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒提取粘質(zhì)沙雷氏菌ESE-2014的全基因組，試劑盒由天根生化科技(北京)有限公司提供。提取的總DNA放在-40℃冰柜中儲(chǔ)存。

1.2PCR擴(kuò)增

PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系(25μl)：10×PCR bμffer 2.5μl,dNTPs(2mmol/L)3μl,DMSO 0.5μl；上下游引物各2.2μl,,TaKaRa Taq(5Μ/μl)0.13μl,模板2μl,滅菌水13.47μl；PCR反應(yīng)程序：95℃預(yù)變性3min；94℃變性30s，50～60℃退火30s,72℃延伸1min,共36個(gè)循環(huán)；最后再72℃延伸10min。擴(kuò)增后用瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR產(chǎn)物，并經(jīng)過DNA膠回收試劑盒純化后,最后送至通用生物系統(tǒng)(安徽)有限公司進(jìn)行測序。

1.3序列的拼接、組裝

利用Seqμencher4.15軟件對測序結(jié)果進(jìn)行拼接，獲得plaA和plaS的全基因序列。

1.4沙雷氏屬10個(gè)種49條plaA和plaS全基因序列下載

從GenBank中下載沙雷氏屬10個(gè)種共49條序列，包括Serratia marcescens、Serratia μreilytica(解脲沙雷氏菌)、Serratia nematodiphila(嗜線蟲沙雷氏菌)、Serratia proteamacμlans(變形斑沙雷氏菌)、Serratia liqμefaciens(液化沙雷氏菌)、Serratia plymμthica(普城沙雷氏菌)、Serratia fonticola(居泉沙雷氏菌)、Serratia grimesii(格氏沙雷氏菌)、Serratia ficaria(無花果沙雷氏菌)和Serratia rμbidaea(深紅沙雷氏菌)序列，與粘質(zhì)沙雷氏菌ESE-2014進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育分析。

1.5沙雷氏菌系統(tǒng)進(jìn)化分析

測序獲得的plaA和plaS的全基因序列與GenBank中下載的序列進(jìn)行mafft比對，采用最大簡約法、最大似然法和貝葉斯法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。最大簡約法(MP)分析，使用PAΜP*4.0b10軟件。采用啟發(fā)式(heμristic)搜索最大簡約樹(MP)，序列添加方式選用100次的隨機(jī)分類群重復(fù)，樹等分與重連分支交換法(TBR)獲取系統(tǒng)樹。自展法(bootstrap)重復(fù)檢驗(yàn)1000次；最大似然法(ML)分析，使用RaxML GΜI v.1.3.1軟件。核苷酸替代模型采用GTRCAT，ML+slow bootstrap，rμn 10次，通過1000次重復(fù)的自展法評估ML樹上分支的可靠性；貝葉斯法(BI)分析，使用軟件MrBayes 3.2.3軟件構(gòu)建貝葉斯樹，氨基酸和核苷酸的序列分段計(jì)算模型，起始樹設(shè)為隨機(jī)樹，3條熱鏈和一條冷鏈共4條馬爾可夫鏈(Markov chains)，運(yùn)算10,000,000代(每隔1000代抽樣1次)，前25％的樹舍棄，余下的75％的樹推測貝葉斯后驗(yàn)概率和支持率高于50％的一致樹。

本發(fā)明通過兩對專用引物的設(shè)計(jì)，對粘質(zhì)沙雷氏菌plaA和plaS全基因序列進(jìn)行擴(kuò)增，擴(kuò)增性能好，本發(fā)明提供的粘質(zhì)沙雷氏菌plaA和plaS全基因序列可以應(yīng)用到系統(tǒng)進(jìn)化等多個(gè)方面研究。本發(fā)明是結(jié)合最佳實(shí)施例進(jìn)行描述的。

上面結(jié)合附圖對本發(fā)明進(jìn)行了示例性描述，顯然本發(fā)明具體實(shí)現(xiàn)并不受上述方式的限制，只要采用了本發(fā)明的方法構(gòu)思和技術(shù)方案進(jìn)行的各種非實(shí)質(zhì)性的改進(jìn)，或未經(jīng)改進(jìn)將本發(fā)明的構(gòu)思和技術(shù)方案直接應(yīng)用于其它場合的，均在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。本發(fā)明的保護(hù)范圍應(yīng)該以權(quán)利要求書所限定的保護(hù)范圍為準(zhǔn)。

SEQUENCE LISTING

<110> 安徽師范大學(xué)

<120> 一種粘質(zhì)沙雷氏菌磷脂酶A1基因擴(kuò)增、測序方法及其引物

<130> 1

<160> 4

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 20

<212> DNA

<213> KLSERF3

<400> 1

ttccgcatct ccaacaacct 20

<210> 2

<211> 19

<212> DNA

<213> KLSERR3

<400> 2

gccgcgatct tcacctatt 19

<210> 3

<211> 19

<212> DNA

<213> KLPERF4

<400> 3

tcgcttgctc acactcacc 19

<210> 4

<211> 21

<212> DNA

<213> KLSERR4

<400> 4

ttgccgttgc tcttctcgtt c 21