普羅威登斯菌(Providencia sp.)2D在降解鄰苯二甲酸二丁酯中的應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及環(huán)境污染物生物處理技術(shù)領(lǐng)域，更具體地，涉及普羅威登斯菌 sp. )2D在降解鄰苯二甲酸二丁醋中的應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 鄰苯二甲酸二丁醋（di-/?-butylphthalate，DBP)屬于鄰苯二甲酸醋類化合物 (Phthalic acidester，PAEs)，是塑料工業(yè)最主要的增塑劑之一，也是農(nóng)藥、染料去污劑的 載體以及諸多化妝品、紡織品的生產(chǎn)原料，廣泛用于食品包裝材料、容器、醫(yī)療器械以及兒 童玩具等領(lǐng)域。由于上述制品的大量應(yīng)用，DBP已經(jīng)成為全球性的有機污染物，廣泛存在于 大氣、水體、土壤以及生物體中。特別是在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中，由于塑料薄膜和塑料大棚的廣泛應(yīng) 用，殘留在農(nóng)業(yè)土壤中DBP極易通過食物鏈在人體中富集。DBP及其代謝物能夠?qū)C體造 成生殖毒性、發(fā)育毒性、神經(jīng)毒性、多器官癌變等多種損傷，因此美國環(huán)保署（EPA)和中國國 家環(huán)境監(jiān)測中心（CNEMC)都已將它列為優(yōu)先控制污染物。
[0003] 研宄表明，DBP的水解和光解速率都非常緩慢，生物降解是其在環(huán)境中分解的主要 途徑。因此，獲得DBP高效降解菌是提高其生物降解效率的重要環(huán)節(jié)。利用微生物降解作 用，將DBP轉(zhuǎn)化為無害物質(zhì)或完全礦化，是公認的去除環(huán)境中DBP污染的最佳手段。由于環(huán) 境中DBP的普遍存在，DBP降解菌的出現(xiàn)頻率也很高，目前對DBP有降解作用的微生物大多 數(shù)為戈登氏菌屬、農(nóng)桿菌屬、不動桿菌屬和赤紅球菌屬等，但已報道的這些細菌對于DBP的 生物降解不完全，會產(chǎn)生毒性更高的中間代謝產(chǎn)物，或者其降解速率還不能滿足實際污染 控制的要求，因此仍需篩選更加高效的專性或兼性降解菌。
[0004] 在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中，土壤的DBP污染已經(jīng)得到人們廣泛關(guān)注。DBP污染土壤的微 生物修復(fù)技術(shù)中需要解決的首要問題是高效降解菌株的篩選與構(gòu)建。普羅威登斯菌屬 是堆肥中廣泛存在的一類細菌，目前尚無關(guān)于其降解PAEs的報道。另外，堆 肥在改善土壤結(jié)構(gòu)和保護農(nóng)業(yè)生態(tài)環(huán)境方面具有高效、環(huán)保和低成本等優(yōu)勢，結(jié)合篩選獲 得的高效降解菌，對降低農(nóng)業(yè)土壤環(huán)境中DBP污染具有十分廣泛的應(yīng)用前景。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明為了克服現(xiàn)有技術(shù)的上述不足，提供普羅威登斯菌sp. )2D 在降解鄰苯二甲酸二丁酯中的應(yīng)用。
[0006] 本發(fā)明的第二個目的是提供普羅威登斯菌（Piwi也sp. )2D在制備降解鄰苯 二甲酸二丁酯的制劑中的應(yīng)用。
[0007] 本發(fā)明的第三個目的是提供一種降解鄰苯二甲酸二丁酯的生物菌劑。
[0008] 本發(fā)明的目的是通過以下技術(shù)方案予以實現(xiàn)的： 普羅威登斯菌sp. )2D在降解鄰苯二甲酸二丁醋中的應(yīng)用，該菌于2015 年1月22日保藏在中國典型培養(yǎng)物保藏中心（CCTCC)，保藏編號為CCTCC M 2015057,保藏 地址為：湖北省武漢市武漢大學。
[0009] 本發(fā)明從動物糞堆肥中分離篩選獲得一株對DBP具有高效、完全降解性能的普羅 威登斯菌，命名為2D，所述菌株/2D通過富集培養(yǎng)法從 農(nóng)場動物糞堆肥樣品中富集獲得，該菌的最適生長條件為：溫度30~40°C，pH為7. 0~ 8. 5〇
[0010] 所述菌株sp.2D在牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基（LB)上(酵母粉5. 0g， 蛋白胨10.0 g，氯化鈉10.0 g，pH= 7.0)劃線培養(yǎng)7天，菌落呈橘黃色，質(zhì)地膏狀，豐厚濕 潤，易被挑起，邊緣較??；掃描電子顯微鏡下呈長桿狀，長約1. 5~3. 0 ym，寬約0. 5~ 0. 8 ym ;經(jīng)革蘭氏染色鑒定該菌為革蘭氏陰性菌。
[0011] 所述菌株/sp. 2D的生理生化鑒定實驗結(jié)果如下：甲基紅試驗（陽 性)、V-P試驗（陰性)、吲哚反應(yīng)（陽性)、檸檬酸鹽利用（陽性)、肌醇產(chǎn)酸試驗（陽性)、葡萄糖 產(chǎn)酸試驗（陽性)、淀粉水解試驗（陰性)、尿酶試驗（陽性)、明膠液化試驗（陰性)、硝酸鹽還原 (陽性)、氧化酶試驗（陰性）和葡萄糖產(chǎn)氣試驗（陰性)。
[0012] 所述菌株/sp. 2D的16S rDNA基因序列如SEQ ID NO :1所示，通過 NCBI官方網(wǎng)站（http://www. ncbi. nlm. nih. gov/)的BLAST程序與其他已登錄細菌菌株16S rDNA序列進行比對，結(jié)果表明該菌株與sp.相似性最高，同源率達99%。
[0013] 所述菌株/sp. 2D能夠利用DBP作為唯一碳源和能源生長繁殖，不僅 能夠降解DBP，還能夠降解DBP的中間產(chǎn)物鄰苯二甲酸，最終將DBP完全礦化。
[0014] 本發(fā)明還提供普羅威登斯菌sp. 2D在降解鄰苯二甲酸中的應(yīng)用。
[0015] 同時還提供普羅威登斯菌/sp. 2D在制備降解鄰苯二甲酸二丁醋或 /和鄰苯二甲酸的制劑中的應(yīng)用。
[0016] 上述普羅威登斯菌/sp. 2D降解鄰苯二甲酸二丁醋的應(yīng)用具體為： 將普羅威登斯菌也flcia sp. 2D活化后制得的菌懸液接入受鄰苯二甲酸二丁酯污染 的介質(zhì)中。
[0017] 作為一種更優(yōu)選的技術(shù)方案，上述應(yīng)用是將普羅威登斯菌/sp. 2D經(jīng) 過過夜活化、震蕩培養(yǎng)至對數(shù)期，收集菌體，根據(jù)實際需要調(diào)節(jié)菌體含量并制成菌懸液，將 制得的菌懸液接入受鄰苯二甲酸二丁酯污染的水或土壤中。
[0018] 本發(fā)明還提供一種降解鄰苯二甲酸二丁酯的生物菌劑，包括普羅威登斯菌 Providenciasp. 2D〇
[0019] 本發(fā)明同時研究了普羅威登斯菌戶_roKi也sp.2D在DBP污染土壤中的修復(fù) 效應(yīng)，結(jié)果表明該菌可有效降低土壤中的DBP污染，是理想的土壤環(huán)境污染修復(fù)微生物。
[0020] 因此，可以將上述生物菌劑制成DBP污染土壤改良修復(fù)劑，包括普羅威登斯菌 Providenciasp. 2D〇
[0021] 優(yōu)選地，可以根據(jù)實際DBP污染土壤的情況調(diào)節(jié)普羅威登斯菌sp. 2D的用量。
[0022] 另外，發(fā)明人研宄還發(fā)現(xiàn)在DBP污染土壤中同時添加動物糞堆肥可進一步增強土 壤中DBP的降解，因此，進一步地，本發(fā)明所述土壤改良修復(fù)劑還包括動物糞堆肥。
[0023] 更優(yōu)選地，所述動物糞堆肥與DBP污染土壤的質(zhì)量比為1 :15。
[0024] 與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有以下有益效果： 本發(fā)明提供了普羅威登斯菌也flcia sp. 2D在降解鄰苯二甲酸二丁酯中的應(yīng)用。 該菌在72h對高濃度的DBP(1000mg/L)降解效率超過80%，對低濃度的DBP(200mg/L) 幾乎完全降解；該菌株還能夠降解DBP的中間產(chǎn)物鄰苯二甲酸。
[0025] 本發(fā)明還提供了一種DBP污染土壤改良修復(fù)劑，包括普羅威登斯菌 sp. 2D，接2D菌