對普羅威登斯菌o3，o4，o8，o12，o13和o20特異的核苷酸及其應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及對普羅威登斯菌O3，O4，O8，O12，O13和O20血清型特異的核苷酸及其應(yīng)用，所述核苷酸為SEQIDNO:1-12所示的核苷酸中的至少一種。這些核苷酸可用于制備檢測普羅威登斯菌用PCR試劑盒和基因芯片。所述的普羅威登斯菌可以取樣于腹瀉大便、尿道感染、傷口、燒傷和菌血癥標(biāo)本的培養(yǎng)物的粗提液，或是普羅威登斯菌的純培養(yǎng)物的粗提液等。本發(fā)明對普羅威登斯菌O3，O4，O8，O12，O13和O20血清型特異的核苷酸及包含該核苷酸的PCR試劑盒、基因芯片，PCR試劑盒配制方法簡便，檢測周期短、速度快，可操作性強(qiáng)，易于產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)，而檢測成本卻相對較低；準(zhǔn)確性高；靈敏度高。
【專利說明】對普羅威登斯菌03, 04, 08, 012, 013和020特異的核苷酸 及其應(yīng)用

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及對普羅威登斯菌03, 04, 08, 012, 013和020血清型特異的核苷酸，尤 其涉及對普羅威登斯菌03, 04, 08, 012, 013和020血清型0抗原基因簇中單個(gè)基因特異的 核苷酸及其應(yīng)用。

【背景技術(shù)】
[0002] 普羅威登斯菌（Providencia)是腸桿菌科中一種常見的革蘭氏陰性菌，是一種機(jī) 會致病菌。主要通過院內(nèi)感染或者食用海鮮感染該菌，可以引起呼吸道感染，也可引發(fā)敗血 癥、泌尿系感染、繼發(fā)性腦膜炎等。分離于腹瀉大便、尿道感染、傷口、燒傷和菌血癥標(biāo)本。
[0003] 細(xì)菌分型與鑒定方法主要有傳統(tǒng)的表型方法、血清學(xué)方法以及分子鑒定方法。然 而，隨著分子生物學(xué)的發(fā)展，傳統(tǒng)的血清分型和鑒定方法存在著一定的問題，如血清分型這 種診斷方法需要大量的抗血清，而抗血清一般種類不全，數(shù)量不足，大量的抗血清在制備和 儲存中也存在一些困難。另一方面血清分型方法耗時(shí)長、靈敏度低、漏檢率高、準(zhǔn)確性差，不 同的〇抗原產(chǎn)生的抗血清之間經(jīng)常存在交叉反應(yīng)。因此，建立基于分子生物學(xué)技術(shù)的血清 鑒定方法成為發(fā)展方向。
[0004] 普羅威登斯菌的分子鑒定越來越受到人們的重視，成為普羅威登斯菌菌種與株型 鑒定的重要依據(jù)，不少新菌也因此產(chǎn)生。分子生物學(xué)檢測技術(shù)具有速度快且易于大規(guī)模使 用的優(yōu)點(diǎn)，是目前國際上公認(rèn)的致病菌檢測的發(fā)展方向，但當(dāng)前的難點(diǎn)在于DNA靶標(biāo)分子 特異性較低。細(xì)菌表面多糖抗原的多樣性是由負(fù)責(zé)其合成的基因簇的遺傳多樣性導(dǎo)致的。 長期以來，人們一直試圖探索存在于普羅威登斯菌中的表面多糖抗原這一重要致病因子的 多樣性情況及相應(yīng)的遺傳進(jìn)化基礎(chǔ)。但該研究方向上總體進(jìn)展非常緩慢，針對其多糖抗原 多樣性和變異規(guī)律方面的認(rèn)識基本還是空白，例如：人們尚不了解普羅威登斯菌中存在多 少種表面多糖抗原以及哪些表面多糖抗原對于該菌的致病性和流行性具有重要意義，負(fù)責(zé) 其表面多糖抗原合成的基因簇尚未被定位(其它單位預(yù)測的部分表面多糖抗原基因均不能 與解析的多糖抗原化學(xué)結(jié)構(gòu)很好對應(yīng)）等。造成上述現(xiàn)象的主要原因是：多糖抗原合成基 因簇組成復(fù)雜、基因功能較難預(yù)、糖合成基因鑒定困難等。此外，已進(jìn)行部分相關(guān)研究的單 位大多缺乏前期研究基礎(chǔ)。
[0005] 前期研究中，我們在深入分析細(xì)菌表面多糖抗原進(jìn)化機(jī)理的基礎(chǔ)上提出了表面抗 原基因簇中的特定基因?qū)τ谄渚幋a的表面抗原具有極高的特異性理論，并以此為基礎(chǔ)建立 了從細(xì)菌表面抗原基因簇中篩選特異分子標(biāo)識的技術(shù)。我們據(jù)此建立了當(dāng)前國際上容量最 大的致病微生物特異分子標(biāo)識庫(包括300余種不同細(xì)菌的特異分子標(biāo)識)并建立了較為完 善的細(xì)菌分子型檢測系統(tǒng)。這些技術(shù)已被國內(nèi)外包括美國農(nóng)業(yè)部、美國疾病預(yù)防控制中心、 法國食品安全署、荷蘭食品與消費(fèi)品安全機(jī)構(gòu)等幾十家單位廣泛應(yīng)用。
[0006] 在本項(xiàng)目中，我們將在獲得普羅威登斯菌全部表面多糖抗原基因簇序列信息的基 礎(chǔ)上，建立普羅威登斯菌分子血清學(xué)分型系統(tǒng)和快速檢測方法，具有重要的科學(xué)意義和較 強(qiáng)的應(yīng)用價(jià)值。
[0007] 近年來，越來越多的分子技術(shù)用于病原菌的分型、鑒定、檢測及病害診斷，包括轉(zhuǎn) 錄間隔區(qū)（ITS)序列分析、隨機(jī)擴(kuò)增長度多態(tài)性（RAPD)分析、核糖體DNA限制性片段長度 多態(tài)性（RFLP)分析等。分子生物學(xué)方法不僅可用于普羅威登斯菌的快速血清分型篩查， 穩(wěn)定的鑒定結(jié)果可以彌補(bǔ)表型特征鑒定方法的不足。和傳統(tǒng)檢測技術(shù)相比，這些基于多聚 酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR)的分子檢測技術(shù)，不需要經(jīng)過病原菌的分離、純培養(yǎng)等過程，而且具有快 速、靈敏、特異性強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)。
[0008] 聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)技術(shù)（Polymerase chain reaction,簡稱PCR技術(shù)）作為微生物 檢測技術(shù)目前正在得到認(rèn)同和推廣，該技術(shù)相對于傳統(tǒng)的方法有高通量、檢測速度快、特異 性強(qiáng)、靈敏度高等優(yōu)點(diǎn)，只需對樣品進(jìn)行簡單的預(yù)增菌或增菌過程，再通過離心及裂解制備 細(xì)菌DNA模板，就可以在高特異性引物介導(dǎo)下的PCR過程中擴(kuò)增目標(biāo)序列，達(dá)到檢測樣品中 是否含有待測的致病性微生物的目的。PCR的擴(kuò)增過程僅需1個(gè)半小時(shí)。這對檢驗(yàn)檢疫部門 和臨床檢驗(yàn)無疑極大提高了工作速度和降低了工作成本。不論從國內(nèi)和國際的角度來看， 快速、準(zhǔn)確地鑒定出血清類型，為普羅威登斯菌的防控提供有效技術(shù)支持是十分重要的。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0009] 本發(fā)明的目的在于提供了本發(fā)明涉及對普羅威登斯菌03, 04, 08, 012, 013和020 血清型特異的核苷酸，其特征在于所述的核苷酸具有： 1) SEQ ID N0:1-12所示的核苷酸中的至少一種； 2) 與SEQ ID N0:1-12所示的核苷酸互補(bǔ)的核苷酸中的至少一種(例如，具有可以與031 血清型特異引物所擴(kuò)增出序列互補(bǔ)配對的核苷酸序列）； 所述的SEQ ID N0:1-12如下：

【權(quán)利要求】
1. 對普羅威登斯菌03, 04, 08, 012, 013和020血清型特異的核苷酸，其特征在于所述 的核苷酸具有： 1. SEQ ID N0:1-12所示的核苷酸中的至少一種； 2) 與SEQ ID N0:1-12所示的核苷酸互補(bǔ)的核苷酸中的至少一種。
2. -種PCR試劑盒，包括PCR引物、dNTP、緩沖液和DNA聚合酶，所述PCR引物為如SEQ ID N0:1-12所示的核苷酸中的至少一種。
3. 權(quán)利要求2所述的試劑盒，還包括如下試劑：10 mM dNTP 30μ 1 ;10X酶特異性反 應(yīng)緩沖液50 μ 1 ;5U/ μ 1耐熱DNA聚合酶5 μ 1 ;引物混合物10 μ 1 ;陽性對照品10 μ 1 ;陰 性對照品 1〇μ 1 ;ddH20 lml。
4. 權(quán)利要求1所述的SEQ ID NO: 1-12特異核苷酸在制備用于檢測普羅威登斯菌PCR 試劑盒方面的應(yīng)用。
5. 權(quán)利要求1所述的SEQ ID N0:1-12特異核苷酸在制備用于檢測普羅威登斯菌的基 因芯片方面的應(yīng)用。
6. 權(quán)利要求1所述的SEQ ID N0:1-12特異核苷酸在制備用于檢測普羅威登斯菌微陣 列方面的應(yīng)用。
7. 權(quán)利要求4-6所述的應(yīng)用，其中所述的檢測普羅威登斯菌指的是檢測引起呼吸道感 染、敗血癥、泌尿系感染、繼發(fā)性腦膜炎的細(xì)菌。
8. 權(quán)利要求4-6所述的應(yīng)用，其中所述的普羅威登斯菌指的是取樣于腹瀉大便、尿道 感染、傷口、燒傷和菌血癥標(biāo)本培養(yǎng)物的粗提液或是普羅威登斯菌的純培養(yǎng)物的粗提液。
【文檔編號】C12N15/11GK104059975SQ201410281515
【公開日】2014年9月24日 申請日期:2014年6月23日 優(yōu)先權(quán)日:2014年6月23日
【發(fā)明者】王磊, 夏香紅, 馮露, 劉斌 申請人:南開大學(xué)