本申請為分案申請，其原申請的申請日為2011年4月26日，申請?zhí)枮?01180031963.2，名稱為“稠合的環(huán)辛炔化合物及其在無金屬點擊反應中的應用”。

本發(fā)明涉及稠合的環(huán)辛炔化合物及其制備的方法。本發(fā)明所述稠合的環(huán)辛炔化合物可用于無金屬的點擊反應(clickreaction)。因此，本發(fā)明還涉及通過稠合的環(huán)辛炔綴合物與包含1,3-偶極子或1,3-(雜)二烯的靶分子的反應修飾靶分子的方法。本發(fā)明還涉及環(huán)辛炔綴合物用于靶分子的生物正交(bioorthogonal)標記、成像或修飾中的用途。

背景技術(shù)：

快速發(fā)展的“化學生物學”領域中的一個革命性發(fā)展涉及生命系統(tǒng)中的化學。生命系統(tǒng)中的化學涉及這樣的化學反應：其在自然條件下是溫和的，并且如此的快速和高產(chǎn)率以至于其可在大約生理ph、在水中和生物分子官能團(biomolecularfunctionality)附近發(fā)揮作用。這種反應可分類于術(shù)語“生物正交化學”內(nèi)。在生物正交化學領域，主要有兩個挑戰(zhàn)：一、開發(fā)適合的化學(chemistry)；以及二、將其應用于活生物體中(體內(nèi))。

在化學領域，存在大量的化學反應的工具盒，可用于構(gòu)建復雜的有機分子。但是，絕大多數(shù)這種反應只能在嚴格的無水條件下(換言之，在完全無水的情況下)實施。雖然還有極少數(shù)化學反應可在水中或有水條件下進行，但是大多數(shù)這種反應只能在體外應用，因為無法排除存在于活生物體中的其他化合物對所涉及的化學試劑的干擾。目前，只有少數(shù)化學反應能夠與存在于活生物體中的其他官能團完全相容。

這種反應的一個實例是環(huán)炔和疊氮化物的環(huán)加成反應，其中一個反應稱為“點擊反應”。該反應已成為生物分子(例如蛋白質(zhì)、脂質(zhì)、聚糖等)的生物正交標記和成像、蛋白質(zhì)組學和材料科學中的通用手段。本質(zhì)上，一個帶有疊氮化物、另一個帶有張力(strained)環(huán)炔的兩個獨立的分子實體會通過稱為張力促進的疊氮化物-炔環(huán)加成反應(spaac)的反應自發(fā)地結(jié)合成一個分子。用于生物正交標記的spaac的動力在于分離的環(huán)炔或疊氮化物對生物官能團例如胺、巰基、酸或羰基是完全惰性的，但是其結(jié)合會發(fā)生快速和不可逆的環(huán)加成反應形成穩(wěn)定的三唑綴合物。例如，通過簡單地攪拌所述疊氮基蛋白質(zhì)與環(huán)辛炔綴合物，可將(通過在營養(yǎng)缺陷型細菌中表達、遺傳工程或化學轉(zhuǎn)化得到的)疊氮基修飾的蛋白質(zhì)用生物素、熒光團、peg-鏈或其他官能團容易地標記。另外，已經(jīng)通過化學指示劑策略證明小尺寸的疊氮化物對于spaac在特定生物分子成像中的應用非常有用。

除疊氮化物外，環(huán)辛炔也顯示出與其他偶極子(例如硝酮和氧化腈)的高反應性。例如，張力促進的炔-硝酮環(huán)加成反應(spanc)應用于蛋白質(zhì)的n-末端修飾。

spaac和spanc環(huán)加成反應(方案1)自發(fā)進行，因此不存在(金屬)催化劑，并且它們和選定數(shù)量的額外環(huán)加成反應也稱為“無金屬點擊反應”。

現(xiàn)有技術(shù)中描述了幾種環(huán)炔及其在生物正交標記中的應用。us2009/0068738(以引用方式納入本文)涉及經(jīng)修飾的環(huán)炔化合物以及它們用于通過可在生理條件下實施的環(huán)加成反應修飾生物分子的應用。所述環(huán)加成包括使經(jīng)修飾的環(huán)炔(例如二氟化環(huán)辛炔化合物difo、difo2和difo3)與靶生物分子上的疊氮化物部分發(fā)生反應，產(chǎn)生經(jīng)共價修飾的生物分子。已發(fā)現(xiàn)氟化物取代對于與疊氮化物的環(huán)加成具有加速效應。例如difo3顯示出顯著提高的可高達k＝76×10^-3m^-1s^-1的反應速率常數(shù)，而與之相比，未氟化體系的最大值為2.4×10^-3m^-1s^-1。

wo2009/067663(其通過引用方式納入本文)中公開了其中環(huán)辛炔稠合到芳基上的環(huán)辛炔化合物(苯并(benzannulated)體系)，并且這些二苯并環(huán)辛炔化合物dibo在與疊氮化物的環(huán)加成中的反應動力學得到進一步改進(k＝0.12m^-1s^-1)。

vandelft等(chem.commun.2010,46,97–99)(其通過引用方式納入本文)開發(fā)了氮雜二苯并環(huán)辛炔dibac，并且dibac在與疊氮化物的環(huán)加成中顯示出進一步改進的反應動力學(k＝0.31m^-1s^-1)。

最近，bertozzi等(j.am.chem.soc.2010,132,3688–3690)(其通過引用方式納入本文)報道了另一種苯并體系：二芳基氮雜環(huán)辛酮barac。通過將酰胺官能團置于環(huán)中，顯著改進了barac與疊氮化物的環(huán)加成的反應動力學(k＝0.96m^-1s^-1)。

如pezacki(chem.commun.2010,46,931–933)和vandelft(angew.chem.int.ed.2010,49,3065–3068)所述，還發(fā)現(xiàn)dibo和dibac與硝酮進行快速環(huán)加成，其反應速率常數(shù)比與疊氮化物的環(huán)加成的反應速率常數(shù)高最高達300倍，所述兩篇文獻均以引用方式納入本文。

但是，在現(xiàn)有技術(shù)中已知的用于生物正交標記的環(huán)辛炔探針有幾點缺陷。首先，只有dibac可商購獲得，這阻礙了其廣泛應用。其合成制備需要高級的化學專業(yè)技術(shù)。此外，目前可獲得的探針的合成很耗時(對于difo2需要8個化學步驟，對于difo3需要10個化學步驟，對于dibac需要9個化學步驟)和/或產(chǎn)率低(對于dibo總共10％)。第三，dibo和dibac中存在的兩個苯并芳基部分導致嚴重的空間位阻以及親脂特性。dibo和dibac的親脂特性可導致通過范德華相互作用的非特異性蛋白結(jié)合，這是不合乎需要的。

因此，非常需要新的、易得的和具有反應活性的生物正交探針用于無金屬點擊反應，例如與疊氮化物、硝酮和其他1,3-偶極子的1,3-偶極環(huán)加成。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

在第一個方面，本發(fā)明涉及式(ia)、(ib)或(ic)的化合物，

其中：

m為0或1；

n為0或8；

p為0或1；

z是n或c(r³)，其中r³選自[(l)p-q]、氫、鹵素、c1-c24烷基、c6-c24(雜)芳基、c7-c24烷基(雜)芳基和c7-c24(雜)芳基烷基，所述烷基任選地被一個或多個選自o、n和s的雜原子間斷，其中所述烷基、(雜)芳基、烷基(雜)芳基和(雜)芳基烷基獨立地且任選地被一個或多個取代基取代，所述取代基獨立地選自c1-c12烷基、c2-c12烯基、c2-c12炔基、c3-c12環(huán)烷基、c1-c12烷氧基、c2-c12烯氧基、c2-c12炔氧基、c3-c12環(huán)烷基氧基、鹵素、氨基、氧基和甲硅烷基，其中所述烷基、烯基、炔基、環(huán)烷基、烷氧基、烯氧基、炔氧基和環(huán)烷基氧基任選地被取代，所述烷基、烷氧基、環(huán)烷基和環(huán)烷氧基任選地被一個或多個選自o、n和s的雜原子間斷，其中所述甲硅烷基用式(r⁴)3si-表示，其中r⁴獨立地選自c1-c12烷基、c2-c12烯基、c2-c12炔基、c3-c12環(huán)烷基、c1-c12烷氧基、c2-c12烯氧基、c2-c12炔氧基和c3-c12環(huán)烷基氧基，其中所述烷基、烯基、炔基、環(huán)烷基、烷氧基、烯氧基、炔氧基和環(huán)烷基氧基任選地被取代，所述烷基、烷氧基、環(huán)烷基和環(huán)烷氧基任選地被一個或多個選自o、n和s的雜原子間斷；

y是o、c(o)或c(r⁵)2，其中r⁵獨立地選自氫、鹵素、c1-c24烷基、c6-c24(雜)芳基、c7-c24烷基(雜)芳基和c7-c24(雜)芳基烷基，所述烷基任選地被一個或多個選自o、n和s的雜原子間斷，其中所述烷基、(雜)芳基、烷基(雜)芳基和(雜)芳基烷基任選地被取代；

任選地，當m＝1時，y和z以及連接y和z的鍵一起形成環(huán)烷基或(雜)芳基，其中所述環(huán)烷基和(雜)芳基任選地被取代，如果y和z形成(雜)芳基，那么–(l)p-q基團是(雜)芳基上的取代基；

l是連接基團，選自直鏈或支鏈c1-c24亞烷基、c2-c24亞烯基、c2-c24亞炔基、c3-c24環(huán)亞烷基、c5-c24環(huán)亞烯基、c8-c24環(huán)亞炔基、c7-c24烷基(雜)亞芳基、c7-c24(雜)芳基亞烷基、c8-c24(雜)芳基亞烯基、c9-c24(雜)芳基亞炔基，所述亞烷基、亞烯基、亞炔基、環(huán)亞烷基、環(huán)亞烯基、環(huán)亞炔基、烷基(雜)亞芳基、(雜)芳基亞烷基、(雜)芳基亞烯基和(雜)芳基亞炔基任選地被一個或多個取代基取代，所述取代基獨立地選自c1-c12烷基、c2-c12烯基、c2-c12炔基、c3-c12環(huán)烷基、c5-c12環(huán)烯基、c8-c12環(huán)炔基、c1-c12烷氧基、c2-c12烯氧基、c2-c12炔氧基、c3-c12環(huán)烷基氧基、鹵素、氨基、氧基和甲硅烷基，其中所述甲硅烷基可用式(r⁴)3si-表示，其中r⁴的定義如上所述；

q是選自氫、鹵素、r⁶、-ch＝c(r⁶)2、-c≡cr⁶、-[c(r⁶)2c(r⁶)2o]q-r⁶(其中q為1到200)、-cn、-n3、-ncx、-xcn、-xr⁶、-n(r⁶)2、-⁺n(r⁶)3、-c(x)n(r⁶)2、-c(r⁶)2xr⁶、-c(x)r⁶、-c(x)xr⁶、-s(o)r⁶、-s(o)2r⁶、-s(o)or⁶、-s(o)2or⁶、-s(o)n(r⁶)2、-s(o)2n(r⁶)2、-os(o)r⁶、-os(o)2r⁶、-os(o)or⁶、-os(o)2or⁶、-p(o)(r⁶)(or⁶)、-p(o)(or⁶)2、-op(o)(or⁶)2、-si(r⁶)3、-xc(x)r⁶、-xc(x)xr⁶、-xc(x)n(r⁶)2、-n(r⁶)c(x)r⁶、-n(r⁶)c(x)xr⁶和-n(r⁶)c(x)n(r⁶)2的官能團，其中x是氧或硫并且其中r⁶獨立地選自氫、鹵素、c1-c24烷基、c6-c24(雜)芳基、c7-c24烷基(雜)芳基和c7-c24(雜)芳基烷基；

r¹獨立地選自氫、c1-c24烷基、c6-c24(雜)芳基、c7-c24烷基(雜)芳基和c7-c24(雜)芳基烷基；并且

r²獨立地選自鹵素、-or⁶、-no2、-cn、-s(o)2r⁶、c1-c12烷基、c1-c12芳基、c1-c12烷基芳基和c1-c12芳基烷基，其中r⁶的定義如上所述，并且其中所述烷基、芳基、烷基芳基和芳基烷基任選地被取代。

本發(fā)明還涉及綴合物，例如環(huán)辛炔綴合物，其中式(ia)、(ib)和/或(ic)的化合物通過官能團q綴合到標記物。

本發(fā)明的另一方面是提供用于制備通式(ia)、(ib)或(ic)的化合物的方法，該方法包含以下步驟：

(a)將稠合的3元環(huán)或者4元環(huán)引入式(viia)、(viib)或(viic)的環(huán)辛二烯以形成雙環(huán)環(huán)辛烯化合物：

其中：

n＝0到8；

r¹獨立地選自氫、c1-c24烷基、c6-c24(雜)芳基、c7-c24烷基(雜)芳基和c7-c24(雜)芳基烷基；并且

r²獨立地選自鹵素、-or⁶、-no2、-cn、-s(o)2r⁶、c1-c12烷基、c1-c12芳基、c1-c12烷基芳基和c1-c12芳基烷基，其中所述烷基、芳基、烷基芳基和芳基烷基任選地被取代，并且其中r⁶獨立地選自氫、鹵素、c1-c24烷基、c6-c24(雜)芳基、c7-c24烷基(雜)芳基和c7-c24(雜)芳基烷基，

(b)溴化所得的雙環(huán)環(huán)辛烯化合物以形成雙環(huán)環(huán)辛烷化合物，并且

(c)使所得的雙環(huán)環(huán)辛烷化合物脫溴化氫。

本發(fā)明還涉及修飾靶分子的方法，其中本發(fā)明的綴合物與包含1,3-偶極子或1,3-(雜)二烯的化合物發(fā)生反應。

本發(fā)明的另一方面是本發(fā)明的綴合物用于靶分子的生物正交標記、成像或修飾(例如表面修飾)的用途。

最后，本發(fā)明涉及包含本發(fā)明的綴合物并且還包含可藥用載體的組合物。

附圖說明

圖1示出了對疊氮化物標記的衣殼蛋白和綴合至alexafluor555的環(huán)辛烷的spaac反應(左)和空白反應(右)的sds-page分析。

圖2示出了用綴合至alexafluor555的環(huán)辛烷官能化的衣殼蛋白的esi-tof質(zhì)譜圖。

圖3示出了對用綴合至alexafluor555的環(huán)辛烷官能化的衣殼蛋白的fplc分析。

圖4示出了代謝整合ac4mannaz、用dibo-或bcn-生物素標記并用alexafluor488-綴合的抗生蛋白鏈菌素檢測后用流式細胞儀測定的完整mv3細胞的細胞表面熒光。

圖5示出了代謝整合ac4mannaz、用dibo-或bcn-生物素標記并用alexafluor488-綴合的抗生蛋白鏈菌素檢測后的mv3細胞的熒光強度和細胞活力。

圖6示出了預先在不存在或存在ac4mannaz(50μm)的條件下培養(yǎng)、用dibo-或bcn-生物素標記并用alexafluor488-綴合的抗生蛋白鏈菌素檢測的經(jīng)標記細胞的代表性共聚焦圖像。

具體實施方式

定義

本說明書和權(quán)利要求書中所用的動詞“包含”及其變形以非限制性含義使用，意指包括該詞后面的條目，但不排除未具體提及的條目。

此外，除非上下文中明確表示有且只有一個要素，否則當以不定冠詞“一”或“一個”涉及一種元素時不排除存在多于一個所述要素的可能性。因此，所述不定冠詞“一”或“一個”通常表示“至少一個”。

本說明書和權(quán)利要求書中公開的化合物可被描述為稠合的環(huán)辛炔化合物，即其中第二個環(huán)結(jié)構(gòu)稠合到所述環(huán)辛炔部分的環(huán)辛炔化合物。在稠合的環(huán)辛炔化合物中所述環(huán)辛炔部分的三鍵可位于三個可能的位置(即所述環(huán)辛炔部分的2、3或4位(依據(jù)“iupacnomenclatureoforganicchemistry”,rulea31.2編號))中的任何一個。本說明書和權(quán)利要求書中對于任何稠合的環(huán)辛炔化合物的描述均意在包括所述環(huán)辛炔部分的所有三種單獨的區(qū)域異構(gòu)體(regioisomer)。

本說明書和權(quán)利要求書中公開的化合物可包含一種或多種不對稱中心，并且所述化合物可能存在不同的非對映異構(gòu)體和/或?qū)τ钞悩?gòu)體。除非另有說明，否則本說明書和權(quán)利要求書中對任何化合物的描述均意在包括所有非對映異構(gòu)體及其混合物。此外，除非另有說明，否則本說明書和權(quán)利要求書中對任何化合物的描述均意在包括所述單獨的對映異構(gòu)體以及所述對映異構(gòu)體的任意混合物(外消旋的或相反)。可以理解的是，當將化合物的結(jié)構(gòu)描述為具體的對應異構(gòu)體時，本申請的發(fā)明不限于所述具體的對映異構(gòu)體。

所述化合物可以不同的互變異構(gòu)形式存在。除非另有說明，本發(fā)明的化合物意在包括所有的互變異構(gòu)形式。

本說明書和權(quán)利要求書中公開的化合物還可存在外型(exo)和內(nèi)型(endo)區(qū)域異構(gòu)體。除非另有說明，否則本說明書和權(quán)利要求書中對任何化合物的描述意在包括化合物的單獨的外型區(qū)域異構(gòu)體和單獨的內(nèi)型區(qū)域異構(gòu)體，及其混合物。

此外，本說明書和權(quán)利要求書中公開的化合物還可存在順式和反式異構(gòu)體。除非另有說明，否則本說明書和權(quán)利要求書中對任何化合物的描述意在包括化合物的單獨的順式異構(gòu)體和單獨的反式異構(gòu)體，及其混合物。作為實例，可以理解的是，當將化合物的結(jié)構(gòu)描述為順式異構(gòu)體時，本申請的發(fā)明不排除其相應的反式異構(gòu)體或所述順式異構(gòu)體和反式異構(gòu)體的混合物。

未被取代的烷基具有通式cnh2n+1，并且可為直鏈或支鏈。未被取代的烷基還可包含環(huán)狀部分并因此具有隨之而來的通式cnh2n-1。任選地，所述烷基可被本文中進一步具體提及的一種或多種取代基取代。合適的烷基的實例包括，但不限于，甲基、乙基、丙基、2-丙基、叔丁基、1-己基、1-十二烷基等。

未被取代的烯基具有通式cnh2n-1，并且可以是直鏈或者支鏈。合適的烯基的實例包括但不限于，乙烯基、丙烯基、異丙烯基、丁烯基、戊烯基、癸烯基、十八烯基和二十碳烯基等。未被取代的烯基還可包含環(huán)狀部分并因此具有隨之而來的通式cnh2n-3。

未被取代的烯具有通式cnh2n，而未被取代的炔具有通式cnh2n-2。

芳基包含至少6個碳原子，并可包括單環(huán)、雙環(huán)和多環(huán)的結(jié)構(gòu)?？扇芜x地，所述芳基可被本文中進一步具體提及的一種或多種取代基取代。芳基的實例包括例如苯基、萘基、蒽基等的基團。

芳基烷基和烷基芳基包含至少7個碳原子，并可包括單環(huán)和雙環(huán)的結(jié)構(gòu)。任選地，所述芳基可被本文中進一步具體提及的一種或多種取代基取代。芳基烷基為例如苯甲基等。烷基芳基為例如4-叔丁基苯基等。

將芳基表示為(雜)芳基時，該符號意在包括芳基和雜芳基。同樣地，烷基(雜)芳基意在包括烷基芳基和烷基雜芳基，并且(雜)芳基烷基意在包括芳基烷基和雜芳基烷基。

雜芳基包含1到4個選自氧、氮和硫的雜原子。

稠合的環(huán)辛炔化合物

基于環(huán)炔的反應性隨著環(huán)尺寸的減小而增加這一事實，具有小于8個碳原子的環(huán)炔綴合物在生物正交化學中具有很高的應用價值。不幸的是，由于偏離理想的180°c–c·c角度導致的張力能增加，到目前為止尚不能以純的形式分離環(huán)庚炔及更小的環(huán)。

增加張力能的另一種方式是通過將環(huán)辛炔苯并至芳基(該策略在wo2009/067663中用于dibo)。隨后可通過在所述環(huán)中引入另一個sp²-型原子進一步提高張力能(該方法由vandelft用于dibac并由bertozzi用于barac)。但是，如上所述，環(huán)辛炔中存在兩個芳基部分不僅產(chǎn)生了嚴重的空間位阻，而且增加了所述環(huán)辛炔化合物親脂特性，這是不想要的。

本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)了一種非常有效的誘導額外的環(huán)張力的方法，其包括將環(huán)辛炔稠合到3元環(huán)或者4元環(huán)上，得到稠合的環(huán)辛炔化合物，更具體地分別得到雙環(huán)[6.1.0]壬炔和雙環(huán)[6.2.0]癸炔體系。這些雙環(huán)體系出乎意料地非常適合作為生物正交探針，因為它們在與1,3-偶極子的(3+2)環(huán)加成中和與1,3-(雜)二烯的(雜)diels-alder反應中兼具相對的穩(wěn)定性與高反應性。此外，除產(chǎn)生環(huán)張力之外，所述稠合的3元環(huán)或者4元環(huán)結(jié)構(gòu)也極其適合用于放置綴合官能團和/或標記物上的柄(handle)，并且可被便利地官能化用于例如靶分子的生物正交標記、成像和/或修飾(例如表面修飾)的應用。

因此在第一方面，本發(fā)明涉及通式(ia)、(ib)或(ic)的化合物，

其中：

m為0或1；

n為0到8；

p為0或1；

z是n或c(r³)，其中r³選自[(l)p-q]、氫、鹵素、c1-c24烷基、c6-c24(雜)芳基、c7-c24烷基(雜)芳基和c7-c24(雜)芳基烷基，所述烷基任選地被一個或多個選自o、n和s的雜原子間斷，其中所述烷基、(雜)芳基、烷基(雜)芳基和(雜)芳基烷基獨立地且任選地被一個或多個取代基取代，所述取代基獨立地選自c1-c12烷基、c2-c12烯基、c2-c12炔基、c3-c12環(huán)烷基、c1-c12烷氧基、c2-c12烯氧基、c2-c12炔氧基、c3-c12環(huán)烷基氧基、鹵素、氨基、氧基和甲硅烷基，其中所述烷基、烯基、炔基、環(huán)烷基、烷氧基、烯氧基、炔氧基和環(huán)烷基氧基任選地被取代，所述烷基、烷氧基、環(huán)烷基和環(huán)烷氧基任選地被一個或多個選自o、n和s的雜原子間斷，其中所述甲硅烷基用式(r⁴)3si-表示，其中r⁴獨立地選自c1-c12烷基、c2-c12烯基、c2-c12炔基、c3-c12環(huán)烷基、c1-c12烷氧基、c2-c12烯氧基、c2-c12炔氧基和c3-c12環(huán)烷基氧基，其中所述烷基、烯基、炔基、環(huán)烷基、烷氧基、烯氧基、炔氧基和環(huán)烷基氧基任選地被取代，所述烷基、烷氧基、環(huán)烷基和環(huán)烷氧基任選地被一個或多個選自o、n和s的雜原子間斷；

y是o、c(o)或c(r⁵)2，其中r⁵獨立地選自氫、鹵素、c1-c24烷基、c6-c24(雜)芳基、c7-c24烷基(雜)芳基和c7-c24(雜)芳基烷基，所述烷基任選地被一個或多個選自o、n和s的雜原子間斷，其中所述烷基、(雜)芳基、烷基(雜)芳基和(雜)芳基烷基任選地被取代；

任選地，當m＝1時，y和z以及連接y和z的鍵一起形成環(huán)烷基或(雜)芳基，其中所述環(huán)烷基和(雜)芳基任選地被取代，如果y和z形成(雜)芳基，那么–(l)p-q基團是(雜)芳基上的取代基；

l是連接基團，其選自直鏈或支鏈的c1-c24亞烷基、c2-c24亞烯基、c2-c24亞炔基、c3-c24環(huán)亞烷基、c5-c24環(huán)亞烯基、c8-c24環(huán)亞炔基、c7-c24烷基(雜)亞芳基、c7-c24(雜)芳基亞烷基、c8-c24(雜)芳基亞烯基、c9-c24(雜)芳基亞炔基，所述亞烷基、亞烯基、亞炔基、環(huán)亞烷基、環(huán)亞烯基、環(huán)亞炔基、烷基(雜)亞芳基、(雜)芳基亞烷基、(雜)芳基亞烯基和(雜)芳基亞炔基任選地被一個或多個取代基取代，所述取代基獨立地選自c1-c12烷基、c2-c12烯基、c2-c12炔基、c3-c12環(huán)烷基、c5-c12環(huán)烯基、c8-c12環(huán)炔基、c1-c12烷氧基、c2-c12烯氧基、c2-c12炔氧基、c3-c12環(huán)烷基氧基、鹵素、氨基、氧基和甲硅烷基，其中所述甲硅烷基可用式(r⁴)3si-表示，其中r⁴的定義如上所述；

q是選自氫、鹵素、r⁶、-ch＝c(r⁶)2、-c≡cr⁶、-[c(r⁶)2c(r⁶)2o]q-r⁶(其中q為1到200)、-cn、-n3、-ncx、-xcn、-xr⁶、-n(r⁶)2、-⁺n(r⁶)3、-c(x)n(r⁶)2、-c(r⁶)2xr⁶、-c(x)r⁶、-c(x)xr⁶、-s(o)r⁶、-s(o)2r⁶、-s(o)or⁶、-s(o)2or⁶、-s(o)n(r⁶)2、-s(o)2n(r⁶)2、-os(o)r⁶、-os(o)2r⁶、-os(o)or⁶、-os(o)2or⁶、-p(o)(r⁶)(or⁶)、-p(o)(or⁶)2、-op(o)(or⁶)2、-si(r⁶)3、-xc(x)r⁶、-xc(x)xr⁶、-xc(x)n(r⁶)2、-n(r⁶)c(x)r⁶、-n(r⁶)c(x)xr⁶和-n(r⁶)c(x)n(r⁶)2的官能團，其中x是氧或硫并且其中r⁶獨立地選自氫、鹵素、c1-c24烷基、c6-c24(雜)芳基、c7-c24烷基(雜)芳基和c7-c24(雜)芳基烷基；

r¹獨立地選自氫、c1-c24烷基、c6-c24(雜)芳基、c7-c24烷基(雜)芳基和c7-c24(雜)芳基烷基；并且

r²獨立地選自鹵素、-or⁶、-no2、-cn、-s(o)2r⁶、c1-c12烷基、c1-c12芳基、c1-c12烷基芳基和c1-c12芳基烷基，其中r⁶的定義如上所述并且其中所述烷基、芳基、烷基芳基和芳基烷基任選地被取代。

本發(fā)明所述稠合的環(huán)辛炔的一個優(yōu)點是它們易于合成。另一個優(yōu)點是這些分子的多個部分可以進行簡單、直接的修飾。

優(yōu)選式(ia)的所述稠合環(huán)辛炔化合物。該化合物中，三鍵位于所述環(huán)辛炔部分的4-位，即與所述稠合的3元環(huán)或4元環(huán)相對的位置。根據(jù)所述環(huán)辛炔化合物上取代基的性質(zhì)，這可能導致(ia)的可能的區(qū)域異構(gòu)體的數(shù)目減少。

在式(ia)、(ib)和(ic)的化合物中，z上的取代基–[(l)p-q]可位于相對于所述環(huán)辛炔環(huán)的外(exo)位或內(nèi)(endo)位。兩個r¹-取代基相對于彼此可為順式或反式的位置。

優(yōu)選地，q選自-cn、-n3、-ncx、-xcn、-xr⁶、-n(r⁶)2、-⁺n(r⁶)3、-c(x)n(r⁶)2、-c(r⁶)2xr⁶、-c(x)r⁶、-c(x)xr⁶、-xc(x)r⁶、-xc(x)xr⁶、-xc(x)n(r⁶)2、-n(r⁶)c(x)r⁶、-n(r⁶)c(x)xr⁶和-n(r⁶)c(x)n(r⁶)2，其中x和r⁶的定義如上所述。更優(yōu)選地，x是氧。最優(yōu)選地，q選自-or⁶、-n(r⁶)2、-⁺n(r⁶)3、-c(o)n(r⁶)2、-c(o)or⁶、-oc(o)r⁶、-oc(o)or⁶、-oc(o)n(r⁶)2、-n(r⁶)c(o)r⁶、-n(r⁶)c(o)or⁶和-n(r⁶)c(o)n(r⁶)2。此外，官能團q可任選地被掩蔽或保護。所述r⁶可相互獨立地進行選擇，也就是說例如-n(r⁶)2取代基中的2個r⁶基團可彼此不同。

在一個實施方案中，p為0，即q直接鍵合到z。在另一個實施方案中，p為1。在另一個實施方案中，p為1并且l是ch2。

在一個優(yōu)選的實施方案中，r1是氫。

在另一個優(yōu)選的實施方案中，n為0。在另一個優(yōu)選實施方案中，r²是吸電子基團，即hammett取代常數(shù)σ為正值的基團。合適的吸電子基團是本領域技術(shù)人員已知的，并且包括例如鹵素(特別為氟)、-or⁶、-no2、-cn、-s(o)2r⁶、取代的c1-c12烷基、取代的c1-c12芳基或取代的c1-c12烷基芳基，其中所述取代基是吸電子基團。優(yōu)選地，所述取代的烷基、芳基和烷基芳基是氟代c1-c12烷基(例如-cf3)、氟代c1-c12芳基(例如-c6f5)、或氟代c1-c12烷基芳基(例如-[3,5-(cf3)2(c6h3)])。

m＝0且z＝cr³的化合物

本發(fā)明涉及的一類具體的化合物是式(ia)、(ib)或(ic)類的化合物，其中所述環(huán)辛炔部分稠合到3元環(huán)結(jié)構(gòu)。因此，在本發(fā)明的一個優(yōu)選的實施方案中，如上所定義，m為0。

在另一個優(yōu)選的實施方案中，z是c(r³)，其中r³如上所定義。因此，本發(fā)明還涉及式(ia)、(ib)或(ic)的化合物，其中所述化合物具有式(iia)、(iib)或(iic):

其中n、p、r¹、r²、r³、l和q如上述式(ia)、(ib)和(ic)的化合物中所定義。

如上所述，式(iia)、(iib)和(iic)的化合物中的取代基–[(l)p-q]可位于相對于所述環(huán)辛炔環(huán)的外或內(nèi)位，并且兩個r¹取代基相對于彼此可位于順式或反式位置。在一個優(yōu)選實施方案中，r¹取代基為順式位置。

在一個實施方案中，p為0，即q直接鍵合到環(huán)丙基環(huán)。在另一個實施方案中，p為1。在另一個實施方案中，p為1并且l是ch2。

同樣在式(iia)、(iib)或(iic)的化合物中，當p為0和p為1時，q優(yōu)選地選自-cn、-n3、-ncx、-xcn、-xr⁶、-n(r⁶)2、-⁺n(r⁶)3、-c(x)n(r⁶)2、-c(r⁶)2xr⁶、-c(x)r⁶、-c(x)xr⁶、-xc(x)r⁶、-xc(x)xr⁶、-xc(x)n(r⁶)2、-n(r⁶)c(x)r⁶、-n(r⁶)c(x)xr⁶和-n(r⁶)c(x)n(r⁶)2,其中x和r⁶的定義如上所述。更優(yōu)選地，x是氧。最優(yōu)選地，q選自-or⁶、-n(r⁶)2、-⁺n(r⁶)3、-c(o)n(r⁶)2、-c(o)or⁶、-oc(o)r⁶、-oc(o)or⁶、-oc(o)n(r⁶)2、-n(r⁶)c(o)r⁶、-n(r⁶)c(o)or⁶和-n(r⁶)c(o)n(r⁶)2。此外，官能團q可任選地被掩蔽或保護。r⁶基團可相互獨立地進行選擇，也就是說例如-n(r⁶)2取代基中的2個r⁶基團可彼此不同。在一個優(yōu)選的實施方案中，q是–or⁶，優(yōu)選為–oh。在另一個優(yōu)選的實施方案中，q是-c(o)or⁶。

在另一個優(yōu)選的實施方案中，r³是氫或[(l)p-q]。

在一個優(yōu)選的實施方案中，r¹是氫。

在另一個優(yōu)選的實施方案中，n為0。在另一個優(yōu)選實施方案中，r²是吸電子基團，即hammett取代常數(shù)σ為正值的基團。合適的吸電子基團為本領域技術(shù)人員已知的，并且包括例如鹵素(特別為氟)、-or⁶、-no2、-cn、-s(o)2r⁶、取代的c1-c12烷基、取代的c1-c12芳基或取代的c1-c12烷基芳基，其中所述取代基是吸電子基團。優(yōu)選地，所述取代的烷基、芳基和烷基芳基是氟代c1-c12烷基(例如-cf3)、氟代c1-c12芳基(例如-c6f5)、或氟代c1-c12烷基芳基(例如-[3,5-(cf3)2(c6h3)])。

在式(iia)、(iib)和(iic)的化合物中，優(yōu)選式(iia)的化合物，因為它們可具有對稱的軸或平面，因而減少可能形成的潛在區(qū)域異構(gòu)體的數(shù)目。

特別優(yōu)選其中p為1、l是ch2、q是–oh、r¹是氫、r³是氫或[(l)p-q]并且n為0的實施方案。

m＝0且z＝n的化合物

本發(fā)明還涉及通式為(ia)、(ib)或(ic)的化合物，其中m為0且z是n。這些化合物具有通式(iiia)、(iiib)或(iiic)：

其中n、p、r¹、r²、l和q如上式(ia)、(ib)和(ic)的化合物中所定義。

兩個r¹取代基相對于彼此可位于順式或反式的位置。在一個優(yōu)選的實施方案中，所述r¹取代基位于順式位置。

在一個實施方案中，p為0，即q直接鍵合到n。在另一個實施方案中，p為1。在另一個實施方案中，p為1并且l是ch2。

同樣在式(iiia)、(iiib)或(iiic)的化合物中，當p為0和p為1時，q優(yōu)選地選自-cn、-n3、-ncx、-xcn、-xr⁶、-n(r⁶)2、-⁺n(r⁶)3、-c(x)n(r⁶)2、-c(r⁶)2xr⁶、-c(x)r⁶、-c(x)xr⁶、-xc(x)r⁶、-xc(x)xr⁶、-xc(x)n(r⁶)2、-n(r⁶)c(x)r⁶、-n(r⁶)c(x)xr⁶和-n(r⁶)c(x)n(r⁶)2,其中x和r⁶的定義如上所述。更優(yōu)選地，x是氧。最優(yōu)選地，q選自-or⁶、-n(r⁶)2、-⁺n(r⁶)3、-c(o)n(r⁶)2、-c(o)or⁶、-oc(o)r⁶、-oc(o)or⁶、-oc(o)n(r⁶)2、-n(r⁶)c(o)r⁶、-n(r⁶)c(o)or⁶和-n(r⁶)c(o)n(r⁶)2。此外，官能團q可任選地被掩蔽或保護。所述r⁶可相互獨立地進行選擇，也就是說例如-n(r⁶)2取代基中的2個r⁶基團可彼此不同。

在一個優(yōu)選的實施方案中，r¹是氫。

在另一個優(yōu)選的實施方案中，n為0。在另一個優(yōu)選實施方案中，r²是吸電子基團，即hammett取代常數(shù)σ為正值的基團。合適的吸電子基團為本領域技術(shù)人員已知的，并且包括例如鹵素(特別為氟)、-or⁶、-no2、-cn、-s(o)2r⁶、取代的c1-c12烷基、取代的c1-c12芳基或取代的c1-c12烷基芳基，其中所述取代基是吸電子基團。優(yōu)選地，所述取代的烷基、芳基和烷基芳基是氟代c1-c12烷基(例如-cf3)、氟代c1-c12芳基(例如-c6f5)、或氟代c1-c12烷基芳基(例如-[3,5-(cf3)2(c6h3)])。

在式(iiia)、(iiib)和(iiic)的化合物中，優(yōu)選式(iiia)的化合物，因為它們具有對稱元素，因而減少可能形成的潛在區(qū)域異構(gòu)體的數(shù)目。

m＝1且z＝c(r³)的化合物

本發(fā)明還涉及通式為(ia)、(ib)或(ic)的化合物，其中m為1且z是c(r³)，且這些化合物具有通式(iva)、(ivb)或(ivc)：

其中y是o、c(o)或c(r⁵)2，并且n、p、l、q、r¹、r²、r³和r⁵如上所定義。

同樣在式(iva)、(ivb)和(ivc)的化合物中，取代基–[(l)p-q]可位于相對于所述環(huán)辛炔環(huán)的外或內(nèi)位，并且兩個r¹取代基相對于彼此可位于順式或反式的位置。

在如上所示的式(iva)、(ivb)和(ivc)的化合物中，所述z-基團(即鍵合到r³和-[(l)p-q]取代基的c-原子)位于所述稠合的環(huán)辛炔化合物的9-位。但是，也包括(ivb)和(ivc)的區(qū)域異構(gòu)體，其中z-基團位于所述稠合的雙環(huán)癸炔的10-位，由此所述-[(l)p-q]取代基可位于外或內(nèi)位置。

在一個實施方案中，p為0，即q直接鍵合到環(huán)丁基環(huán)。在另一個實施方案中，p為1。在另一個實施方案中，p為1并且l是ch2。

同樣在式(iva)、(ivb)或(ivc)的化合物中，當p為0和p為1時，q優(yōu)選地選自-cn、-n3、-ncx、-xcn、-xr⁶、-n(r⁶)2、-⁺n(r⁶)3、-c(x)n(r⁶)2、-c(r⁶)2xr⁶、-c(x)r⁶、-c(x)xr⁶、-xc(x)r⁶、-xc(x)xr⁶、-xc(x)n(r⁶)2、-n(r⁶)c(x)r⁶、-n(r⁶)c(x)xr⁶和-n(r⁶)c(x)n(r⁶)2，其中x和r⁶的定義如上所述。更優(yōu)選地，x是氧。最優(yōu)選地，q選自-or⁶、-n(r⁶)2、-⁺n(r⁶)3、-c(o)n(r⁶)2、-c(o)or⁶、-oc(o)r⁶、-oc(o)or⁶、-oc(o)n(r⁶)2、-n(r⁶)c(o)r⁶、-n(r⁶)c(o)or⁶和-n(r⁶)c(o)n(r⁶)2。此外，官能團q可任選地被掩蔽或保護。所述r⁶可相互獨立地進行選擇，也就是說例如-n(r⁶)2取代基中的2個r⁶基團可彼此不同。

在一個優(yōu)選的實施方案中，y是o。在另一個優(yōu)選的實施方案中，y是c(o)。當y是o和y是c(o)時，優(yōu)選r¹為氫。

在另一個優(yōu)選的實施方案中，n為0。在另一個優(yōu)選實施方案中，r²是吸電子基團，即hammett取代常數(shù)σ為正值的基團。合適的吸電子基團為本領域技術(shù)人員已知的，并且包括例如鹵素(特別為氟)、-or⁶、-no2、-cn、-s(o)2r⁶、取代的c1-c12烷基、取代的c1-c12芳基或取代的c1-c12烷基芳基，其中所述取代基是吸電子基團。優(yōu)選地，所述取代的烷基、芳基和烷基芳基是氟代c1-c12烷基(例如-cf3)、氟代c1-c12芳基(例如-c6f5)、或氟代c1-c12烷基芳基(例如-[3,5-(cf3)2(c6h3)])。

優(yōu)選式(iva)的化合物。在該化合物中，三鍵位于所述環(huán)辛炔部分的4-位，即與稠合的環(huán)丁基環(huán)相對。

m＝1且z＝n的化合物

本發(fā)明還涉及通式為(ia)、(ib)或(ic)的化合物，其中m為1且z是n。這些化合物具有通式(va)、(vb)或(vc)：

其中y是c(o)或c(r⁵)2，并且n、p、l、q、r¹、r²和r⁵如上所定義。

在此處所示的式(va)、(vb)和(vc)的化合物中，所述4元環(huán)的n-原子位于所述雙環(huán)體系的9-位。但是，本發(fā)明還涉及式(vb)或(vc)的區(qū)域異構(gòu)體，其中所述4元環(huán)的n-原子位于所述雙環(huán)體系的10-位。此外，兩個r¹取代基相對于彼此可位于順式或反式的位置。

在一個實施方案中，p為0，即q直接鍵合到所述4元環(huán)。在另一個實施方案中，p為1。在另一個實施方案中，p為1并且l是ch2。

同樣在式(va)、(vb)或(vc)的化合物中，當p為0和p為1時，q優(yōu)選地選自-cn、-n3、-ncx、-xcn、-xr⁶、-n(r⁶)2、-⁺n(r⁶)3、-c(x)n(r⁶)2、-c(r⁶)2xr⁶、-c(x)r⁶、-c(x)xr⁶、-xc(x)r⁶、-xc(x)xr⁶、-xc(x)n(r⁶)2、-n(r⁶)c(x)r⁶、-n(r⁶)c(x)xr⁶和-n(r⁶)c(x)n(r⁶)2，其中x和r⁶的定義如上所述。更優(yōu)選地，x是氧。最優(yōu)選地，q選自-or⁶、-n(r⁶)2、-⁺n(r⁶)3、-c(o)n(r⁶)2、-c(o)or⁶、-oc(o)r⁶、-oc(o)or⁶、-oc(o)n(r⁶)2、-n(r⁶)c(o)r⁶、-n(r⁶)c(o)or⁶和-n(r⁶)c(o)n(r⁶)2。此外，官能團q可任選地被掩蔽或保護。所述r⁶可相互獨立地進行選擇，也就是說例如-n(r⁶)2取代基中的2個r⁶基團可彼此不同。

如果y是c(r⁵)2，r⁵優(yōu)選地為氫。當y是c(r⁵)2和y是c(o)時，優(yōu)選r¹為氫。

在另一個優(yōu)選的實施方案中，n為0。在另一個優(yōu)選實施方案中，r²是吸電子基團，即hammett取代常數(shù)σ為正值的基團。合適的吸電子基團為本領域技術(shù)人員已知的，并且包括例如鹵素(特別為氟)、-or⁶、-no2、-cn、-s(o)2r⁶、取代的c1-c12烷基、取代的c1-c12芳基或取代的c1-c12烷基芳基，其中所述取代基是吸電子基團。優(yōu)選地，所述取代的烷基、芳基和烷基芳基是氟代c1-c12烷基(例如-cf3)、氟代c1-c12芳基(例如-c6f5)、或氟代c1-c12烷基芳基(例如-[3,5-(cf3)2(c6h3)])。

如上所述，優(yōu)選式(va)的化合物，其中三鍵位于所述環(huán)辛炔部分的4-位，即與所述稠合的環(huán)丁基環(huán)相對。

m＝1且y和z形成環(huán)狀烷基或(雜)芳基的化合物

本發(fā)明還涉及通式為(ia)、(ib)或(ic)的化合物，其中m為1時，y和z以及連接y和z的鍵一起形成環(huán)狀烷基或(雜)芳基，其中所述環(huán)烷基和(雜)芳基任選地被取代，如果y和z形成(雜)芳基，那么–(l)p-q基團為(雜)芳基上的取代基。

所述環(huán)狀基團優(yōu)選為芳基，特別為苯并芳基，如在式(via)、(vib)和(vic)中：

其中p、n、r¹、r²、l和q如上所定義。

-(l)p-q取代基可位于所述苯并芳基的鄰位或間位，并且在式(via)、(vib)和(vic)的化合物中，r¹-取代基相對于彼此可位于順式或反式的位置。

在一個實施方案中，p為0，即q直接鍵合到所述芳基。在另一個實施方案中，p為1。在另一個實施方案中，p為1并且l是ch2。

當p為0和p為1時，q優(yōu)選地選自-cn、-n3、-ncx、-xcn、-xr⁶、-n(r⁶)2、-⁺n(r⁶)3、-c(x)n(r⁶)2、-c(r⁶)2xr⁶、-c(x)r⁶、-c(x)xr⁶、-xc(x)r⁶、-xc(x)xr⁶、-xc(x)n(r⁶)2、-n(r⁶)c(x)r⁶、-n(r⁶)c(x)xr⁶和-n(r⁶)c(x)n(r⁶)2，其中x和r⁶的定義如上所述。更優(yōu)選地，x是氧。最優(yōu)選地，q選自-or⁶、-n(r⁶)2、-⁺n(r⁶)3、-c(o)n(r⁶)2、-c(o)or⁶、-oc(o)r⁶、-oc(o)or⁶、-oc(o)n(r⁶)2、-n(r⁶)c(o)r⁶、-n(r⁶)c(o)or⁶和-n(r⁶)c(o)n(r⁶)2。此外，官能團q可任選地被掩蔽或保護。所述r⁶可相互獨立地進行選擇，這是指例如-n(r⁶)2取代基中的2個r⁶基團可彼此不同。

在一個優(yōu)選的實施方案中，r¹是氫。在另一個優(yōu)選的實施方案中，n為0。在另一個優(yōu)選實施方案中，r²是吸電子基團，即hammett取代常數(shù)σ為正值的基團。合適的吸電子基團為本領域技術(shù)人員已知的，并且包括例如鹵素(特別為氟)、-or⁶、-no2、-cn、-s(o)2r⁶、取代的c1-c12烷基、取代的c1-c12芳基或取代的c1-c12烷基芳基，其中所述取代基是吸電子基團。優(yōu)選地，所述取代的烷基、芳基和烷基芳基是氟代c1-c12烷基(例如-cf3)、氟代c1-c12芳基(例如-c6f5)、或氟代c1-c12烷基芳基(例如-[3,5-(cf3)2(c6h3)])。

如上所述，優(yōu)選式(via)的化合物，其中三鍵位于所述環(huán)辛炔部分的4-位。

綴合物

本發(fā)明所述稠合的環(huán)辛炔化合物非常適合用于無金屬點擊反應中，因此這些化合物在例如多種靶分子的生物正交標記、成像和/或修飾(包括表面修飾)的應用中是通用手段。本發(fā)明的一個方面提供綴合物，其中本發(fā)明的式(ia)、(ib)和/或(ic)的化合物通過官能團q綴合到標記物。

術(shù)語“標記物”是指可綴合到本發(fā)明的式(ia)、(ib)和(ic)的化合物的任何識別標簽。本領域已知有大量標記物，可用于多種不同的用途。根據(jù)具體的用途，可選擇適合該具體用途的標記物。適用于具體用途的適合標記物為本領域技術(shù)人員已知的，并且包括但不限于，所有種類的熒光團、生物素、聚乙二醇(peg)鏈、聚丙二醇(ppg)鏈、混合的聚乙二醇/聚丙二醇鏈、放射性同位素、類固醇、藥用化合物、脂質(zhì)、肽、聚糖(包括低聚糖和多糖)、核苷酸(包括寡核苷酸和多核苷酸)以及肽標簽。適合的熒光團的實例為例如所有種類的alexafluor(例如alexafluor555)、花青染料(例如cy3或cy5)、香豆素衍生物、熒光素、羅丹明、別藻藍蛋白、色霉素等。適合的肽標簽的實例包括flag或his標簽。適合的聚糖的一個實例是刀豆素。優(yōu)選地，所述標記物選自熒光團、生物素、聚乙二醇鏈、聚丙二醇鏈、混合的聚乙二醇/聚丙二醇鏈、放射性同位素、類固醇、藥用化合物、脂質(zhì)、肽、聚糖、核苷酸和肽標簽。

官能團q可直接連接到所述標記物或者通過連接體(linker)或連接單元(linkingunit)間接連接到所述標記物。連接單元是本領域中公知的，其具有的一般結(jié)構(gòu)為q-s-q，其中q如上所定義，并且s選自直鏈或支鏈c1-c200亞烷基、c2-c200亞烯基、c2-c200亞炔基、c3-c200環(huán)亞烷基、c5-c200環(huán)亞烯基、c8-c200環(huán)亞炔基、c7-c200烷基亞芳基、c7-c200芳基亞烷基、c8-c200芳基亞烯基、c9-c200芳基亞炔基。任選地，所述亞烷基、亞烯基、亞炔基、環(huán)亞烷基、環(huán)亞烯基、環(huán)亞炔基、烷基亞芳基、芳基亞烷基、芳基亞烯基、芳基亞炔基可被取代，并且任選地所述基團可被一個或多個雜原子(優(yōu)選為1到100個雜原子)間斷，所述雜原子優(yōu)選地選自o、s和nr⁶，其中r⁶如上所定義。最優(yōu)選地，所述雜原子是o。

合適的連接單元的實例包括但不限于，(聚)乙二醇二胺(例如1,8-二氨基-3,6-二氧雜辛烷或含較長的乙二醇鏈的等價物)、聚乙二醇或聚環(huán)氧乙烷鏈、聚丙二醇或聚環(huán)氧丙烷鏈、1,x-二氨基烷(其中x是所述烷中的碳原子數(shù))等。另一類合適的連接體包含可切割連接體?？汕懈钸B接體是本領域中公知的。

在一個優(yōu)選的實施方案中，本發(fā)明涉及綴合物，其中式(iia)、(iib)和/或(iic)的化合物通過官能團q綴合到標記物。在另一個優(yōu)選的實施方案中，所述式(iia)、(iib)和/或(iic)的綴合化合物是p為1并且l是ch2。r¹和/或r³優(yōu)選地為h。在另一個實施方案中，n為0(q、n、p、l、r¹和r³如上所定義)。最優(yōu)選地，p為1、l是ch2、r¹是h、r³是h并且n為0。

在另一個實施方案中，本發(fā)明涉及綴合物，其中式(iiia)、(iiib)和/或(iiic)的化合物通過官能團q綴合到標記物。在另一個實施方案中，所述式(iiia)、(iiib)和/或(iiic)的綴合化合物中p為1并且l是ch2。在另一個實施方案中，p為0，因此官能團q直接鍵合到n-原子。r¹優(yōu)選地為h。在另一個實施方案中，n為0(q、n、p、l、r¹和r³如上所定義)。在最優(yōu)選的實施方案中，p為1、l是ch2、r¹是h并且n為0。在另一個最優(yōu)選的實施方案中，p為0、r¹是h并且n為0。

在另一個實施方案中，本發(fā)明涉及綴合物，其中式(iva)、(ivb)和/或(ivc)的化合物通過官能團q綴合到標記物。在一個優(yōu)選的實施方案中，所述式(iva)、(ivb)和/或(ivc)的綴合化合物中p為1并且l是ch2。r¹和/或r³優(yōu)選地為h，并且y優(yōu)選地為c(o)或o。在另一個實施方案中，n為0(q、n、p、l、r¹和r³如上所定義)。在一個最優(yōu)選的實施方案中，y是o或c(o)、p為1、l是ch2、r¹是h、r³是h并且n為0。在另一個最優(yōu)選的實施方案中，y是o或c(o)、p為0、r¹是h、r³是h并且n為0。

此外，本發(fā)明涉及綴合物，其中式(va)、(vb)和/或(vc)的化合物通過官能團q綴合到標記物。在一個優(yōu)選的實施方案中，所述式(va)、(vb)和/或(vc)的綴合化合物中p為1并且l是ch2。r¹優(yōu)選地為h。y優(yōu)選地為c(o)。在另一個實施方案中，n為0(q、n、p、l、y、r¹和r³如上所定義)。在一個最優(yōu)選的實施方案中，y是c(o)、p為1、l是ch2、r¹是h并且n為0。在另一個最優(yōu)選的實施方案中，y是c(o)、p為0、r¹是h并且n為0。

本發(fā)明還涉及綴合物，其中式(via)、(vib)和/或(vic)的化合物通過官能團q綴合到標記物。在一個優(yōu)選的實施方案中，r¹是h。在另一個優(yōu)選的實施方案中，p為0，即q直接鍵合到芳基。

本發(fā)明還涉及本發(fā)明的綴合物用于靶分子的生物正交標記、成像或修飾(例如表面修飾)的用途。

合成方法

本發(fā)明的另一個方面是提供式(ia)、(ib)和(ic)的化合物的合成方法。本發(fā)明因此涉及制備通式(ia)、(ib)或(ic)的化合物的方法，該方法包括如下步驟：

(a)將稠合的3元環(huán)或4元環(huán)引入式(viia)、(viib)或(viic)的環(huán)辛二烯以形成雙環(huán)環(huán)辛烯化合物：

其中：

n＝0到8；

r¹獨立地選自氫、c1-c24烷基、c6-c24(雜)芳基、c7-c24烷基(雜)芳基和c7-c24(雜)芳基烷基；并且

r²獨立地選自鹵素、-or⁶、-no2、-cn、-s(o)2r⁶、c1-c12烷基、c1-c12芳基、c1-c12烷基芳基和c1-c12芳基烷基，其中所述烷基、芳基、烷基芳基和芳基烷基任選地被取代，并且其中r⁶獨立地選自氫、鹵素、c1-c24烷基、c6-c24(雜)芳基、c7-c24烷基(雜)芳基和c7-c24(雜)芳基烷基，

(b)溴化所得的雙環(huán)環(huán)辛烯化合物以形成雙環(huán)環(huán)辛烷化合物，并且

(c)使所得的雙環(huán)環(huán)辛烷化合物脫溴化氫以形成通式(ia)、(ib)或(ic)的化合物。

步驟(a)中所述式(viia)、(viib)或(viic)的環(huán)辛二烯可以是順,順-環(huán)辛二烯或順,反-環(huán)辛二烯。在一個實施方案中，所述環(huán)辛二烯是順,順-環(huán)辛二烯。在第二個實施方案中，所述環(huán)辛二烯是順,反-環(huán)辛二烯。也就是說，含r¹-取代基的雙鍵可具有e-或z-構(gòu)象。

在一個優(yōu)選的實施方案中，r¹是h。在另一個優(yōu)選的實施方案中，n為0。在另一個優(yōu)選的實施方案中，r¹是h且n為0。

官能團q可在所述合成方法中的任意點引入。例如，可在步驟(a)(形成所述雙環(huán)環(huán)辛烯化合物)過程中引入所述官能團。還可以在一個額外的步驟中引入所述官能團，例如在所述溴化步驟(b)之前或之后，或者所述脫溴化氫步驟(c)之后。本領域技術(shù)人員能夠知曉，引入所述官能團的策略完全取決于所需要引入的具體官能團的性質(zhì)。

很顯然，用于步驟(a)——將稠合的3元環(huán)或4元環(huán)引入式(viia)、(viib)或(viic)的環(huán)辛二烯中——的方法的選擇取決于所引入的3元環(huán)或4元環(huán)的類型。例如，含n-原子的3元環(huán)可通過與含氮烯的化合物反應稠合到所述環(huán)辛二烯而形成式(iiia)、(iiib)或(iiic)的化合物。例如，可通過使環(huán)辛二烯與含烯酮的化合物反應將4元環(huán)引入所述環(huán)辛二烯而形成式(iva)、(ivb)或(ivc)的化合物(其中，y是c(o))?？赏ㄟ^環(huán)辛二烯與(活化的)異氰酸酯反應而將含n-原子的4元環(huán)引入所述環(huán)辛二烯形成式(va)、(vb)或(vc)的化合物(其中y是c(o))，即含β-內(nèi)酰胺的化合物。隨后的氫化形成式(va)、(vb)或(vc)的化合物，其中y是ch2。例如，可通過所述環(huán)辛二烯與(取代的)苯炔化合物反應制備式(via)、(vib)或(vic)的化合物。

步驟(b)——環(huán)辛烯化合物的溴化——和步驟(c)——環(huán)辛烷化合物的脫溴化氫——被認為是本領域技術(shù)人員公知的標準的有機轉(zhuǎn)化。

本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，可從容易獲得的起始材料容易地且快速地以高產(chǎn)率制備例如式(iia)、(iib)或(iic)的化合物。因此，本發(fā)明還涉及制備式(iia)、(iib)或(iic)的化合物的方法，該方法包括如下步驟：

(a)環(huán)丙烷化式(viia)、(viib)或(viic)的環(huán)辛二烯以形成雙環(huán)環(huán)辛烯化合物:

其中，n、r¹和r²如上所定義，

(b)溴化所得的雙環(huán)環(huán)辛烯化合物以形成雙環(huán)環(huán)辛烷化合物，并且

(c)使所得的雙環(huán)環(huán)辛烷化合物脫溴化氫以形成式(iia)、(iib)或(iic)的化合物。

步驟(a)中所述式(viia)、(viib)或(viic)的環(huán)辛二烯可以是順,順-環(huán)辛二烯或順,反-環(huán)辛二烯。在一個實施方案中，所述環(huán)辛二烯是順,順-環(huán)辛二烯。在另一個實施方案中，所述環(huán)辛二烯是順,反-環(huán)辛二烯。也就是說，含r¹-取代基的雙鍵可具有e-或z-構(gòu)象。

在一個優(yōu)選的實施方案中，r¹是h。在另一個優(yōu)選的實施方案中，n為0。在另一個優(yōu)選的實施方案中，r¹是h且n為0。

同樣在該情況中，所述官能團q可以在一個額外的步驟中引入，例如所述溴化步驟(b)之前或之后，或者所述脫溴化氫步驟(c)之后。例如，步驟(a)——所述環(huán)辛二烯的環(huán)丙烷化——可通過使卡賓、類卡賓(carbenoid)或卡賓前體與環(huán)辛二烯反應實現(xiàn)，任選地存在催化劑。步驟(b)和步驟(c)是本領域技術(shù)人員公知的標準的有機轉(zhuǎn)化。

作為實例，只需4步即可在很短的時間內(nèi)(僅1-2天)以高產(chǎn)率合成式內(nèi)型-(iia)的化合物，其中p為1、l是ch2、q是oh、n為0、并且r¹和r³是h(內(nèi)型-9-(羥甲基)雙環(huán)[6.1.0]壬-4-炔)。本發(fā)明所述合成方法的另一個優(yōu)點是只需要有限的色譜純化，因此減少了整個合成所需的總時間。

靶分子的修飾

本發(fā)明的綴合物可成功地用于靶分子(例如蛋白質(zhì)、脂質(zhì)和聚糖)的生物正交標記、成像或修飾(包括表面修飾)。因此，本發(fā)明還涉及修飾靶分子的方法，其中本發(fā)明的綴合物與含1,3-偶極子或1,3-(雜)二烯的化合物反應。作為實例，方案1中示出了環(huán)炔與疊氮化物的張力促進環(huán)加成(spaac)或環(huán)炔與硝酮的張力促進環(huán)加成(spanc)。環(huán)辛炔與1,3-(雜)二烯的反應稱作(雜)diels-alder反應。這些反應也稱作無金屬點擊反應。

1,3-偶極化合物是本領域中公知的(參見，例如f.a.careyandr.j.sundberg,advancedorganicchemistry,parta:structureandmechanisms,第3^rd版,1990,第635–637頁)，并且其包括氧化腈、疊氮化物、重氮甲烷、硝酮、腈胺等。優(yōu)選地，所述含1,3-偶極子的化合物是含疊氮化物的化合物、含硝酮的化合物或含氧化腈的化合物。

(雜)diels-alder反應和1,3-(雜)二烯也是本領域中公知的。除其他的實例外，1,3-二烯的實例還包括1,3-丁二烯、1,3-環(huán)戊二烯、1,3-環(huán)己二烯、呋喃、吡咯及其經(jīng)取代的變體。除其他的實例外，1,3-雜二烯的實例還包括1-氧雜-1,3-丁二烯、1-氮雜-1,3-丁二烯、2-氮雜-1,3-丁二烯、3-氮雜-1,3-丁二烯及其經(jīng)取代的變體。

通過本發(fā)明的方法可修飾很多種靶分子，即含1,3-偶極子或1,3-(雜)二烯的化合物。合適的靶分子是本領域中公知的，并且包括但不限于，生物分子例如蛋白質(zhì)、肽、聚糖、脂質(zhì)、核酸、酶、激素等。原則上，任何含1,3-偶極子或1,3-(雜)二烯的化合物都適合作為靶分子。

本發(fā)明所述修飾靶分子的方法的應用包括但不限于，診斷和治療應用、活細胞(例如mv3細胞、成纖維細胞、jurkat細胞、cho細胞或hek細胞)的細胞標記、生物聚合物(蛋白質(zhì)、脂質(zhì)、核酸、聚糖)修飾、用于質(zhì)譜分析的蛋白質(zhì)和聚糖的富集、聚合物性質(zhì)調(diào)節(jié)、表面修飾等。

在一個實施方案中，所述綴合物的反應在體外實施。在一個優(yōu)選的實施方案中，所述反應在體內(nèi)即在生理條件下實施。

以上對可用于修飾靶分子的本發(fā)明的綴合物進行了詳細描述。這些綴合物的很大的優(yōu)點之一是它們可在體內(nèi)和在體外使用。此外，本發(fā)明所述的綴合物只遭受較少的不想要的非特異性親脂相互作用，并且在無金屬點擊反應中顯示出很好的反應動力學。另一個優(yōu)點是本發(fā)明所述的綴合物容易合成，并且所述綴合物的多個部分可進行簡單且直接的修飾。這使得可以為具體應用而“精確調(diào)節(jié)”所述綴合物，并且可優(yōu)化該應用的反應動力學。

在一個優(yōu)選的實施方案中，上述式(iia)、(iib)和/或(iic)的化合物或其綴合物與含1,3-偶極子或1,3-(雜)二烯的化合物反應。例如，(iia)與芐基疊氮的環(huán)加成在水性條件下以優(yōu)良的反應動力學(k＝0.09–0.28m^-1s^-1，取決于溶劑)快速且干凈地進行，形成相應的三唑加合物。(iia)與c-苯甲酰胺-n-甲基硝酮的環(huán)加成的反應動力學甚至更高(k＝1.25m^-1s^-1)。令人意外地，外型-(iia)和內(nèi)型-(iia)的反應動力學相似，這表明(iia)化合物在c-9位置的立體化學對反應性影響很小。因此，本發(fā)明的外型-和內(nèi)型-化合物的混合物可以用于某些應用中，而不需要分離外型-和內(nèi)型-化合物，并且甚至進一步簡化了本發(fā)明化合物的合成。

本發(fā)明所述方法的另外的應用包括，例如連接熒光團綴合物——其中(iia)和alexafluor555綴合到含單一疊氮化物的病毒質(zhì)粒蛋白，以及通過化學指示劑策略檢測細胞表面聚糖。

藥物組合物

最后，本發(fā)明涉及包含本發(fā)明的綴合物并且還包含可藥用載體的組合物。本領域已知多種適合的可藥用載體(參見，例如r.c.rowe,p.j.sheskeyandp.j.weller(eds.),handbookofpharmaceuticalexcipients,第4^th版，2003)。

實施例

實施例1:外型(exo)-和內(nèi)型(endo)-iia.2的合成

第一步，在乙酸銠的存在下，將重氮乙酸乙酯緩慢加入到大量過量(8倍當量)的1,5-環(huán)辛二烯在二氯甲烷中的溶液中，產(chǎn)生比例為2:1的非對映異構(gòu)化合物外型-iia.1和內(nèi)型-iia.1(總產(chǎn)率為82％)。通過硅膠直接分離后，按照還原、溴化和消除(elimination)的直接三步過程，首先將所述iia.1的內(nèi)型-異構(gòu)體轉(zhuǎn)化為醇iia.2。因此，用lialh4對內(nèi)型-iia.1的酯還原(30分鐘)產(chǎn)生粗的中間體醇(30分鐘)，其純度足以用于溴化反應而不需中間純化(30分鐘)。需要指出的是，不需要如dibo的合成中一樣對醇進行暫時保護。最后，將所得的二溴化物用溶于thf中的過量的kotbu處理(0℃→回流，2h),以對于從內(nèi)型-iia.1得到所需要的9-(羥甲基)雙環(huán)[6.1.0]壬-4-炔內(nèi)型-iia.2，所述三步的分離收率為61％?？稍谝惶靸?nèi)僅用一次色譜純化進行的一系列相似事件得到iia.2的非對映異構(gòu)外型-異構(gòu)體，收率為53％。

實施例2：反應動力學

對用典型的疊氮化物芐基疊氮進行的環(huán)加成的反應動力學進行了研究。因此，將內(nèi)型-iia.2化合物溶于cd3cn和d2o的比例為3:1的混合物中，并與芐基疊氮混合至最終濃度為18mm?；瘜W轉(zhuǎn)化之后通過對鑒定峰的積分進行質(zhì)子nmr，并顯示內(nèi)型-iia.2快速且干凈地反應得到期望的三唑加合物。二級反應動力學的計算顯示其速率常數(shù)為0.12m^-1s^-1。對于外型-iia.2測得類似的速率常數(shù)值0.10m^-1s^-1,這表明c-9位置的立體化學對反應性幾乎沒有影響，內(nèi)型-構(gòu)象化合物僅具有略微高的速率。發(fā)現(xiàn)存在顯著的溶劑效應，因為在cd3cn和d2o的比例為1:2的混合物中相同的環(huán)加成反應分別得到0.28m^-1s^-1(內(nèi)型-iia.2)和0.25m^-1s^-1(外型-iia.2)的速率常數(shù)。

實施例3：雙環(huán)[6.1.0]壬-4-炔(bcn)綴合物

綴合到生物素的bcn(iia.4)

將內(nèi)型-iia.1的醇部分轉(zhuǎn)化為如iia.3中的p-硝基苯基(pnp)碳酸鹽。然后與生物素-(poe)3-nh2反應產(chǎn)生bcn-生物素綴合物iia.4(69％產(chǎn)率)。

綴合到alexafluor555的bcn(iia.6)

或者，化合物iia.3與1,8-二氨基-3,6-二氧雜辛烷反應產(chǎn)生氨基封端的bcn-探針iia.5，其與市售的alexafluor555羥基琥珀酰亞胺酯反應后轉(zhuǎn)化為熒光團綴合物iia.6。

或者，化合物iia.3與1,5-二氨基戊烷反應后產(chǎn)生更加親脂的氨基封端bcn-探針。

實施例4：iia.6與疊氮化物標記的衣殼蛋白的反應(spaac標記)

將衣殼蛋白制備為每分子中僅含一個疊氮化物官能團，其在所述衣殼組裝后位于所述衣殼的內(nèi)表面上。所述蛋白質(zhì)溶于緩沖液中(50mm磷酸鹽緩沖液ph7.5；1mnacl)，其濃度為1mg/ml。alexafluor555-bcn綴合物iia.6溶于水中，并將4倍當量的所述綴合物加入所述蛋白質(zhì)溶液。分析之前，將所述反應混合物在室溫下孵育3小時。

所得反應產(chǎn)物在12％sds-page凝膠上分析，在用考馬斯藍(coomassie-blue)染色之前記錄其熒光圖像。圖1中示出了所述反應產(chǎn)物(左)和空白反應(右)的sds-page分析。圖1的上部示出了考馬斯藍染色，下部示出了考馬斯藍染色之前的熒光圖像。這些結(jié)果清楚地顯示alexafluor555-bcn綴合物被納入所述衣殼蛋白中。

為進行質(zhì)量分析，將所得粗反應混合物在milliq中用0.1％tfa透析，隨后在jeolaccutof上通過電噴霧離子化飛行時間(esi-tof)對其進行分析。圖2示出了與iia.6反應的衣殼蛋白的esi-tof質(zhì)譜。峰b對應于未反應的衣殼蛋白的質(zhì)量，而峰a對應于反應產(chǎn)物。峰之間的質(zhì)量差是1135.1(預期是1135)，這表明衣殼蛋白中單個的疊氮化物有效地與bcn-alexafluor555綴合物反應，該綴合物質(zhì)量為1135。

為測試所述功能化的衣殼蛋白的自組裝性能，將所述粗反應混合物用ph5.0的緩沖液(50mmnaoac；1mnacl；10mmcacl2)透析，其應該能夠誘導形成28nm尺寸的球形顆粒(b.j.m.verduin,febslett.1974,45,50–54，其以引用的方式納入本文)。通過透析組裝所述衣殼后，通過fplc分析所述反應混合物。圖3示出了在superpose6柱上的尺寸排阻分析。在1.2ml洗脫體積處的280nm處的吸收峰表明形成了28nm尺寸的衣殼，并且在555nm處的重疊吸收顯示所述衣殼中存在alexa染料，并因此存在iia.6。

實施例5：iia.2與硝酮標記的fratide蛋白的反應(spanc標記)

將fratide(15.6μg,3.4nmol,34μm)溶解于ph6.9的0.1mnh4oac緩沖液(100μl)中，并加入naio4(1.1μg,5.5nmol,48μm)。允許所述反應在室溫下進行40min，并加入p-甲氧基苯硫酚(9.2μg,66.0nmol,565μm)。將所述混合物在25℃下振蕩2h，并加入p-氨基苯甲醚(13.5μg,109.3μmol,845μm)、n-甲基羥胺鹽酸鹽(18.2μg,218.6nmol,1.5mm)以及bcn-ohii.a2(41.1μg,273.3nmol,1.8mm)。最后，將所述反應混合物在25℃下振蕩24h以產(chǎn)生所需的綴合物。

通過質(zhì)譜(accu-tof)監(jiān)測所述反應的過程。用高碘酸鈉處理后，在4533.8da處的分子離子峰——對應于fratide蛋白——消失，而在4534.8da處出現(xiàn)分子離子峰，其對應于甲基半縮醛。用n-甲基羥胺和bcn-oh處理后，分子離子峰出現(xiàn)在4681.4da處——對應于與bcn-ohiia.2反應后的fratide蛋白硝酮衍生物——作為主峰(去卷積后)。

實施例6：細胞表面標記

通過以化學指示劑策略檢測細胞表面聚糖，研究了生物素綴合物iia.4用于生物正交標記的有效性。通過代謝將n-疊氮基乙酰甘露糖胺(mannaz)納入mv3細胞，并通過facs和共聚焦顯微鏡進行檢測。

細胞培養(yǎng)步驟

侵襲性的和轉(zhuǎn)移性的人黑色素瘤細胞(mv3)保持在培養(yǎng)基rpmi1640中，其在5％co2水飽和的氣氛中含有10％胎牛血清、青霉素/鏈霉素(各50u/ml)。

細胞表面疊氮化物標記

在存在或不存在ac4mannaz(50μm)的條件下，將mv3細胞培養(yǎng)6天。3天后更換培養(yǎng)基和化合物。進行進一步的研究之前，用明視野顯微鏡進行細胞粘附和形態(tài)學分析。對于活細胞標記，通過edta(1mm)將細胞脫附、洗滌和離心3次(pbs,300×grpm,5min,4℃)，重懸浮于pbs中并在bcn-生物素(iia.4)(60μm)、dibo-生物素(60μm)或緩沖液(1h,20℃)中孵育，洗滌3次(pbs,300×g,2min,4℃)，重懸浮于冰預冷的含alexafluor488-綴合的抗生蛋白鏈菌素的pbs(5μg/ml,invitrogen；終體積200μl)中。孵育(30min,4℃)后將細胞洗滌3次，重懸浮于pbs(200μl,4℃)中用于進一步生物分析。

流式細胞術(shù)

在bdbiosciencesfacs-calibur流式細胞儀上用488nm氬激光實施流式細胞術(shù)，并將數(shù)據(jù)用fcsexpress版本3研究版本(denovosoftware,losangeles,ca)分析。在碘化丙啶(2.5μg/ml)存在的條件下，對每個樣本中2×10⁴個形態(tài)學上完整的細胞進行分析。

圖4示出了在代謝納入ac4mannaz、用dibo-或bcn-生物素標記后，并用alexafluor488-綴合的抗生蛋白鏈菌素檢測后，完整mv3細胞上的細胞表面熒光。通過流式細胞術(shù)進行的分析表明，用bcn-生物素或dibo-生物素標記后用alexafluor488-綴合的抗生蛋白鏈菌素檢測的熒光強度增加超過100-倍，背景熒光水平為細胞未用ac4mannaz孵育時的可忽略背景熒光水平。

圖5示出了在代謝納入ac4mannaz、用dibo-或bcn-生物素標記后，并用alexafluor488-綴合的抗生蛋白鏈菌素檢測后，mv3細胞的熒光強度和細胞活力。圖5a示出了4個獨立的實驗中綠色熒光(alexafluor488)的平均強度和標準差(sd)，圖5b示出了聚糖標記后完整細胞的活力。使用綠色熒光(alexafluor488)和碘化丙啶(pi)標記物。數(shù)字顯示pi-陰性的活細胞的百分比。從圖5a可得出,bcn和dibo都能夠有效地標記預先暴露于ac4mannaz的細胞，而bcn-生物素的標記效率更高。圖5b顯示細胞——無論是未處理的、bcn處理的或是dibo處理的——具有高活力(所有情況下都>98％)。

共聚焦顯微鏡

細胞表面聚糖用bcn-生物素或dibo-生物素標記，然后用alexafluor488-綴合的抗生蛋白鏈菌素標記。標記后，將細胞重懸浮于正常的培養(yǎng)基中，轉(zhuǎn)移到6-孔板中并在37℃下孵育30min。在室溫下用帶有氬488激光器的olympusfv1000共聚焦激光掃描顯微鏡對mv3細胞進行活細胞成像，所述激光器的激發(fā)光為488nm，發(fā)射光為520nm并且放大倍數(shù)為40×。

圖6示出了預先在不存在或存在ac4mannaz(50μm)的情況下培養(yǎng)的經(jīng)標記細胞的代表性共聚焦圖像。共聚焦圖像清楚地顯示，在將mv3細胞用ac4mannaz孵育后，接著用bcn-生物素或dibo-生物素和隨后的alexafluor488-綴合的抗生蛋白鏈菌素檢測mv3細胞表面聚糖時，mv3細胞的細胞表面出現(xiàn)熒光，但沒有用ac4mannaz孵育的細胞的細胞表面未出現(xiàn)熒光。

實施例7:iia.7合成

(1r,8s,z)-二乙基雙環(huán)[6.1.0]壬-4-烯-9,9-二甲酸酯(iia.8)

在3h內(nèi)向1,5-環(huán)辛二烯(5.27ml,43.0mmol)和rh2(oac)4(100mg,0.23mmol)的ch2cl2(5ml)溶液中滴加重氮丙二酸二乙酯(1.0g,5.37mmol)的ch2cl2溶液(5ml)。所述溶液在室溫下攪拌24h。使ch2cl2蒸發(fā)，并通過用填充二氧化硅的玻璃過濾器過濾而移除過量的環(huán)辛二烯(洗脫劑:庚烷)。將濾液在真空中濃縮，并通過在硅膠上進行柱色譜(etoac：庚烷為1:10)純化所得剩余物，得到iia.8(1.03g,72％)。

¹hnmr(cdcl3,400mhz):δ5.65-5.57(m,2h),4.10(2×q,j＝7.2hz,4h),2.41-2.29(m,2h),2.15-2.06(m,3h),1.83-1.70(m,3h),1.31-1.23(2×t,j＝7.2hz,6h)。

(1r，8s，z)-雙環(huán)[6.1.0]壬-4-烯-9，9-二基二甲醇(iia.9)

在0℃下向lialh4(103mg,2.70mmol)在et2o(10ml)中的懸液中滴加iia.8(400mg,1.50mmol)的et2o(10ml)溶液。小心地加入水至灰色固體變?yōu)榘咨?。然后加入na2so4(2g)，過濾出所述固體并用et2o(100ml)徹底洗滌。在真空中濃縮所得濾液。通過在硅膠上進行柱色譜(etoac：庚烷為3:1)純化所得剩余物，得到白色固體iia.9(190mg,69％)。

¹hnmr(cdcl3,400mhz):δ5.66-5.58(m,2h),3.88(d,j＝4.8hz,2h),3.58(d,j＝4.8hz,2h),2.43-2.35(m,2h),2.20-1.99(m,6h),1.71-1.57(m,2h),0.95-0.88(m,2h).

((1r,8s)-4,5-二溴雙環(huán)[6.1.0]壬烷-9,9-二基)二甲醇(iia.10)

將二元醇iia.9(145mg,0.796mmol)溶于ch2cl2(5ml)中。在0℃下滴加br2(45μl,0.875mmol)的ch2cl2(1ml)溶液，至黃色穩(wěn)定不變。用10％na2s2o3溶液(5ml)將所得反應混合物淬滅，并用ch2cl2(2×20ml)提取。將有機層干燥(na2so4)并真空濃縮。通過在硅膠上進行柱色譜(etoac：庚烷為5:1)純化所得剩余物，得到白色固體iia.10(235mg,86％)。

¹hnmr(cdcl3,400mhz):δ4.87-4.78(m,2h),3.96-3.88(m,2h),3.60(d,j＝5.2hz,2h),2.75-2.63(m,2h),2.32-2.22(m,3h),2.20-2.13(m,1h),2.05-1.94(m,2h),1.74-1.57(m,2h),1.13-0.99(m,2h)。

(1r,8s)-雙環(huán)[6.1.0]壬-4-炔-9,9-二基二甲醇(iia.7)

在0℃下向所述二溴化物iia.10(100mg,0.292mmol)的thf(5ml)溶液中滴加kotbu溶液(1.29ml,在thf中1m,1.29mmol)。然后，使所述溶液回流1.5h。所述混合物冷卻至室溫后，用飽和nh4cl溶液(20ml)淬滅所述混合物，并用ch2cl2(3×20ml)提取。將有機層干燥(na2so4)并真空濃縮。通過在硅膠上進行柱色譜(etoac)純化所得剩余物，得到白色固體iia.7(24mg,46％)。

¹hnmr(cdcl3,400mhz):δ3.89(bs,2h),3.63(bs,2h),2.58(bs,2h),2.34-2.20(m,6h),1.68-1.59(m,2h),0.89-0.82(m,2h)。