本發(fā)明屬于分子生物學(xué)領(lǐng)域，具體地涉及一種應(yīng)用微衛(wèi)星標(biāo)記鑒定脊尾白蝦近交家系的方法。

背景技術(shù)：

脊尾白蝦屬于長(zhǎng)臂蝦科、白蝦屬，俗稱(chēng)白蝦、小白蝦和迎春蝦。主要分布于中國(guó)大陸沿岸和朝鮮半島西岸的淺海低鹽水域，以黃渤海產(chǎn)量最大，是我國(guó)重要的中小型經(jīng)濟(jì)蝦類(lèi)。脊尾白蝦具有環(huán)境適應(yīng)性廣、食性雜、繁殖周期短、抗病力強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)，大大降低了脊尾白蝦全人工室內(nèi)繁殖的難度，同時(shí)，脊尾白蝦成蝦個(gè)體小，體色透明易于實(shí)驗(yàn)操作。脊尾白蝦的這些特點(diǎn)使其具備成為甲殼類(lèi)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的可能。

按遺傳學(xué)控制方法，根據(jù)基因純合程度，可將實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分為近交系、突變系、雜交群、封閉群四類(lèi)。其中近交系動(dòng)物因其基因型的純合一致性，在實(shí)驗(yàn)的可重復(fù)性和可比性上具有明顯的優(yōu)勢(shì)，因此，在實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的研究多集中在近交系動(dòng)物。近交使一個(gè)種群達(dá)到接近完全純合程度，即所有同源染色體的相對(duì)位置都具有相同基因的狀態(tài)。在近交的過(guò)程中主要有以下幾方面的變化：第一，增多純合性，使基因位點(diǎn)變?yōu)榧兒献樱蛊浔憩F(xiàn)型趨向一致性，第二，近交可將群體分離為不同基因型的品系；第三，近交可引起近交衰退，親緣接近的交配所產(chǎn)生的后代常常會(huì)出現(xiàn)生長(zhǎng)、成活、生育、抗病、適應(yīng)環(huán)境等能力的減退。如何克服和解決近交衰退的問(wèn)題，是培育近交系動(dòng)物的關(guān)鍵所在。

近交系實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的顯著特點(diǎn)是其基因純合性及遺傳穩(wěn)定性，但在培育、保種及繁殖生產(chǎn)過(guò)程中，存在著發(fā)生遺傳變異或遺傳污染的可能，所以需要對(duì)近交系進(jìn)行嚴(yán)格、定時(shí)的遺傳檢測(cè)。對(duì)于脊尾白蝦而言，以培育理想的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物為目的的高度近交系研究尚處于起步階段，因此近交系的遺傳檢測(cè)也是近交系培育工作的需要。有關(guān)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定了利用皮膚移植法、免疫標(biāo)記基因檢測(cè)法和生化基因標(biāo)記檢測(cè)法等進(jìn)行常規(guī)檢測(cè)。近年來(lái)分子生物學(xué)技術(shù)發(fā)展迅速,可以直接檢驗(yàn)動(dòng)物基因組核酸的改變,為脊尾白蝦近交系的遺傳檢測(cè)提供了直接、客觀的途徑。

微衛(wèi)星，是指少數(shù)幾個(gè)核苷酸為單位多次串聯(lián)重復(fù)的DNA序列，其廣泛分布于真核生物的基因組中，大約每隔10-15kb就存在一個(gè)微衛(wèi)星標(biāo)記。微衛(wèi)星標(biāo)記在近交系培育的過(guò)程中具有以下的優(yōu)勢(shì)：采樣微量化、方便化；快速、高效、準(zhǔn)確性高；可長(zhǎng)期使用；可直接識(shí)別出任何個(gè)體的基因型，從而對(duì)群體中不期望存在的基因變異體淘汰。所以，用微衛(wèi)星標(biāo)記技術(shù)選出具品系特異性的多態(tài)位點(diǎn)，可準(zhǔn)確、快速、靈敏地應(yīng)用于近交系實(shí)驗(yàn)動(dòng)物培育過(guò)程中的鑒別、遺傳質(zhì)量監(jiān)測(cè)等方面。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明要解決的技術(shù)問(wèn)題在于提供一種鑒定脊尾白蝦近交家系的微衛(wèi)星標(biāo)記引物及方法，本發(fā)明方法應(yīng)用2個(gè)微衛(wèi)星標(biāo)記鑒定脊尾白蝦近交家系。

本發(fā)明是通過(guò)如下技術(shù)方案來(lái)實(shí)現(xiàn)的：

一種鑒定脊尾白蝦近交家系的微衛(wèi)星標(biāo)記引物，所述微衛(wèi)星標(biāo)記名稱(chēng)為ES034、ES096，其引物分別如下：

ES034

正向引物：5'ACTTCATCCACAAGCAGAGGT 3'，

反向引物：5'GAAGAAGAGGAAGGTGGGGC3'；

ES096；

正向引物：5'GCAATTTGCCTGTTCGGTCT 3'，

反向引物：5'GGTAGGGGTAAGGGGGTGAT 3'。

利用上述引物進(jìn)行脊尾白蝦近交家系鑒定的方法，具體步驟如下：

從待測(cè)脊尾白蝦群體中隨機(jī)抽樣得到待測(cè)樣本，以待測(cè)脊尾白蝦的基因組DNA為模板，利用具有由所述各個(gè)標(biāo)記的一對(duì)引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，然后檢測(cè)待測(cè)樣本的PCR產(chǎn)物的片段大小，如果滿足如下(1)至(3)的所有標(biāo)準(zhǔn)，待測(cè)脊尾白蝦為候選的脊尾白蝦近交家系：

(1)所述方法中，從待測(cè)脊尾白蝦群體中隨機(jī)抽樣得到30尾以上待測(cè)樣本；

(2)所述脊尾白蝦待測(cè)樣本屬于F₈或F₈以上的世代；

(3)用標(biāo)記ES034、ES096的每對(duì)引物檢測(cè)的待測(cè)脊尾白蝦群體時(shí)，群體內(nèi)的所有樣品具有相同的基因型，且片段大小分別為146bp、263bp。

本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比的有益效果：

本發(fā)明利用兩對(duì)微衛(wèi)星引物對(duì)脊尾白蝦群體進(jìn)行遺傳檢測(cè)，可以明確的區(qū)分出脊尾白蝦的近交系群體，維持脊尾白蝦近交系的純合性和同基因性，淘汰在脊尾白蝦近交系建立過(guò)程中發(fā)生遺傳變異或遺傳污染的群體。本發(fā)明方法不僅可以進(jìn)行純合位點(diǎn)的判定，而且能對(duì)基因的變異情況進(jìn)行分析，為近交系的遺傳檢測(cè)提供依據(jù)。

附圖說(shuō)明

圖1脊尾白蝦野生群體在微衛(wèi)星座位ES034的STR檢測(cè)結(jié)果；

圖2脊尾白蝦近交F₁代在微衛(wèi)星座位ES034的STR檢測(cè)結(jié)果；

圖3脊尾白蝦近交F₇代在微衛(wèi)星座位ES034的STR檢測(cè)結(jié)果；

圖4脊尾白蝦近交F₈代在微衛(wèi)星座位ES034的STR檢測(cè)結(jié)果；

圖5脊尾白蝦近交F₉代在微衛(wèi)星座位ES034的STR檢測(cè)結(jié)果；

圖6脊尾白蝦野生群體在微衛(wèi)星座位ES096的STR檢測(cè)結(jié)果；

圖7脊尾白蝦近交F₁代在微衛(wèi)星座位ES096的STR檢測(cè)結(jié)果；

圖8脊尾白蝦近交F₇代在微衛(wèi)星座位ES096的STR檢測(cè)結(jié)果；

圖9脊尾白蝦近交F₈代在微衛(wèi)星座位ES096的STR檢測(cè)結(jié)果；

圖10脊尾白蝦近交F₉代在微衛(wèi)星座位ES096的STR檢測(cè)結(jié)果。

具體實(shí)施方式

以下的實(shí)施例便于更好地理解本發(fā)明，但不限定本發(fā)明。下述實(shí)施例中的實(shí)驗(yàn)方法如無(wú)特殊說(shuō)明，均為常規(guī)方法。下述實(shí)施例中所用的試驗(yàn)材料如無(wú)特殊說(shuō)明，均為常規(guī)生化試劑商店可以購(gòu)買(mǎi)得到的。

實(shí)施例1

材料

研究對(duì)象脊尾白蝦近交家系群體F₇、F₈、F₉世代是由中國(guó)水產(chǎn)科學(xué)研究院黃海水產(chǎn)研究所李健課題組采用全人工室內(nèi)培育的脊尾白蝦家系。脊尾白蝦野生群體采自于江蘇海域，F(xiàn)₁代群體為野生群體后代，每個(gè)群體隨機(jī)抽樣30尾。

引物

本實(shí)驗(yàn)通過(guò)篩選獲得2對(duì)微衛(wèi)星標(biāo)記用于檢測(cè)鑒定脊尾白蝦家系。擴(kuò)增微衛(wèi)星座位ES034、ES096的引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成，其序列為：

ES034

正向引物：5'ACTTCATCCACAAGCAGAGGT 3'，

反向引物：5'GAAGAAGAGGAAGGTGGGGC3'。

ES096

正向引物：5'GCAATTTGCCTGTTCGGTCT 3'，

反向引物：5'GGTAGGGGTAAGGGGGTGAT 3'。

基因組DNA從上述待測(cè)脊尾白蝦的肌肉組織中提取，提取方法參照傳統(tǒng)酚氯仿法，加以改進(jìn)。以提取的基因組DNA為模板，在上述引物的引導(dǎo)下，分別進(jìn)行PCR擴(kuò)增，反應(yīng)體系為20μL。其中模板為30-50ng，上下游引物各1μL，2×TSINGKE Master Mix(來(lái)自于北京擎科新業(yè)生物技術(shù)有限公司)為10μL，ddH₂O 6μL。反應(yīng)條件為：先95℃,5min；然后95℃，40s，55℃，40s，72℃，50s，共計(jì)35個(gè)循環(huán)；72℃后延伸10min。擴(kuò)增的產(chǎn)物取10μL在3730XL測(cè)序儀上檢測(cè)。結(jié)果如圖所示，峰值所對(duì)應(yīng)位置為PCR產(chǎn)物的擴(kuò)增大小。ES034、ES096在各個(gè)群體中的多態(tài)性信息含量見(jiàn)表1。

近交家系F₇、F₈、F₉世代群體、野生群體和F₁代群體的STR分型的比較結(jié)果表明ES034、ES096在近交系群體F₈、F₉中具有相同的特異等位基因，大小分別為146bp、263bp。而在其它群體中2個(gè)位點(diǎn)均表現(xiàn)為多態(tài)性,其中在野生群體中表現(xiàn)為較高的多態(tài)性。

因此本實(shí)驗(yàn)方案實(shí)驗(yàn)了脊尾白蝦近交家系快速的基因分型，可用于脊尾白蝦近交系培養(yǎng)過(guò)程中的遺傳質(zhì)量檢測(cè)和品系的鑒定。

表1 ES034、ES096在群體中的多態(tài)性信息含量

SEQUENCE LISTING

<110> 中國(guó)水產(chǎn)科學(xué)研究院黃海水產(chǎn)研究所

<120> 一種鑒定脊尾白蝦近交家系的微衛(wèi)星標(biāo)記引物及方法

<130> 無(wú)

<160> 4

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 21

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> 人工設(shè)計(jì)的引物ES034正向引物

<400> 1

acttcatcca caagcagagg t 21

<210> 2

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> 人工設(shè)計(jì)的ES034反向引物

<400> 2

gaagaagagg aaggtggggc 20

<210> 3

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> ES096正向引物

<400> 3

gcaatttgcc tgttcggtct 20

<210> 4

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> ES096反向引物

<400> 4

ggtaggggta agggggtgat 20