專利名稱：雜色鮑不同群體的微衛(wèi)星鑒別方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及雜色鮑，尤其是涉及一種雜色鮑不同群體的微衛(wèi)星鑒別方法。
背景技術(shù)：
雜色鮑(Haliotis diversicolor)是我國南方重要的水產(chǎn)養(yǎng)殖種類，主要分布于 熱帶、亞熱帶海域。現(xiàn)有的養(yǎng)殖種多為1990年代初從臺灣引進(jìn)群體的后代。伴隨著雜色鮑 養(yǎng)殖產(chǎn)業(yè)的迅猛發(fā)展，大規(guī)模流行性疾病不斷發(fā)生，雜色鮑養(yǎng)殖產(chǎn)量急劇下降。導(dǎo)致病害流 行的原因，除了技術(shù)和環(huán)境之外，養(yǎng)殖鮑種質(zhì)的退化是根本性問題。因此，研究開發(fā)雜色鮑 的種質(zhì)改良技術(shù)、培育雜色鮑新品種是當(dāng)務(wù)之急，同時(shí)也是解決這一問題的根本途徑。但在 實(shí)際的養(yǎng)殖生產(chǎn)中，因?yàn)轲B(yǎng)殖戶和苗種企業(yè)普遍缺乏種質(zhì)資源的保護(hù)意識，所以導(dǎo)致很多 養(yǎng)殖群體譜系不清楚，容易引起某一品種的退化和混亂，要維持雜色鮑養(yǎng)殖產(chǎn)業(yè)的持續(xù)發(fā) 展和種質(zhì)資源的保護(hù)，急需對雜色鮑的群體遺傳結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析鑒定。在水產(chǎn)動(dòng)物生產(chǎn)和育 種中，準(zhǔn)確的系譜鑒定對于確定個(gè)體選留、培育優(yōu)良苗種也非常重要，同時(shí)對于一些育種工 作來說，準(zhǔn)確地鑒定群體的遺傳結(jié)構(gòu)，才能充分地發(fā)揮利用雜種優(yōu)勢來培育新品種具有的 重要意義?！皷|優(yōu)1號”雜色鮑系利用雜色鮑臺灣群體選育系作為母本，日本群體選育系作為 父本，采用雜交技術(shù)培育出的具有明顯雜種優(yōu)勢的新品種，該新品種于2009年通過全國水 產(chǎn)原種和良種審定委員會(huì)審批，獲得國家級水產(chǎn)新品種證書?！皷|優(yōu)1號”雜色鮑目前已在 福建、廣東和海南多個(gè)鮑魚養(yǎng)殖集中區(qū)進(jìn)行示范推廣養(yǎng)殖。示范養(yǎng)殖結(jié)果表明，該品種抗病 力強(qiáng)、養(yǎng)成存活率較對照組提高35%以上，增產(chǎn)效果明顯。鑒于“東優(yōu)1號”雜色鮑養(yǎng)殖的 實(shí)際情況，采用簡單快捷的方式來鑒定“東優(yōu)1號”及其雙親群體一雜色鮑臺灣群體和雜色 鮑日本群體，具有非常重要的意義。在水產(chǎn)養(yǎng)殖領(lǐng)域，微衛(wèi)星標(biāo)記的開發(fā)和應(yīng)用日趨增多。在海洋貝類，近年來國 夕卜也相繼 艮道了太平洋牡販(Crassost reagigas) (Magoulas A, Gjetvaj B, Terzoglou V, et al. Three polymorphic microsatellites in the Japanese oyster, Crassost reagigas (Thunberg) [J]. Anim Genet, 1998,29 :69-70.) > @ yjfl 牛土 M (Ost reaedulis) (Naciri Y, Vigouroux Y, Dallas J,et al. Identification and inheritance of (GA/TC) η and (AC/GT)η repeats in the European flat oyster Ost reaedulis(L. )[J]. Mol Mar Biol Biotechnol，1995，4 :83-89.)、自皮紋盤鮑(Haliotis discus hannai) (Li Q, Park C, Kijima A. Isolation and characterization of microsatellite loci in the Pacific abalone, Haliotis discus hannai [J] .J Shellfish Res, 2002, 21 :811_815)等多種貝類 微衛(wèi)星標(biāo)記的分離，并已應(yīng)用于種群結(jié)構(gòu)分析、種質(zhì)鑒定、遺傳圖譜構(gòu)建等研究領(lǐng)域。Huang 等(Huang B X，Peakall R, Hanna P J. Analysi s of genetic structure of blacklip abalone (Haliotis rubra)populations using RAPD, minisatellite and microsatellite markers [J] · Mar Biol, 2000,136 207-216.)用 3 個(gè)微衛(wèi)星、2 個(gè)小衛(wèi)星 和RAPD分析了澳大利亞沿海10個(gè)地理種群的100個(gè)黑唇鮑個(gè)體，發(fā)現(xiàn)種群之間存在顯著的遺傳分化° Launey 等(Launey S, Ledu C, Boudry P, et al. Geographic structure in the European flat oyster, Ost reaedulis L. ， as revealed by microsatellite polymorphism [J], J Hered，2002，93 =331-351)用5個(gè)微衛(wèi)星標(biāo)記分析了從挪威至黑海的 歐洲沿海15個(gè)歐洲牡蠣種群的遺傳分化，結(jié)果表明，雜合度期望值差異明顯，種群間存在 顯著的地理隔離。在皺紋盤鮑的相關(guān)研究中，Li等(Li Q，Park C，Endo Τ, et al. Loss of genetic variation at microsatellite loci in hatchery strains of the Pacific abalone(Haliotis discus hannai) [J] · Aquaculture，2004，235 :207_222)用 6 個(gè)微衛(wèi)星 標(biāo)記分析了 3個(gè)皺紋盤鮑養(yǎng)殖群體和2個(gè)野生群體的共380個(gè)個(gè)體，結(jié)果表明所有養(yǎng)殖種 群的等位基因數(shù)和平均雜合度期望值都顯著低于野生種群，其中等位基因數(shù)平均減少了 76%，證實(shí)了皺紋盤鮑養(yǎng)殖種群建立時(shí)瓶頸效應(yīng)的發(fā)生。Evans等(Evans B, Bartlett J， Sweijd N, et al. Loss of genetic variation at microsatellite loci in hatchery produced abalone in Australia(Haliotis rubra)and South Africa(Haliotis midae) [J], Aquaculture, 2004, 233 :109-127)分別用3和5個(gè)微衛(wèi)星標(biāo)記研究了南非的中間鮑 Haliotis midae和澳洲黑唇鮑Haliotis rubra的6個(gè)養(yǎng)殖種群，發(fā)現(xiàn)同野生種群相比所 有養(yǎng)殖種群的遺傳多樣性都普遍下降，等位基因數(shù)減少了 35% 62%。從上述結(jié)果可以看 出，在育苗生產(chǎn)中進(jìn)行人工苗種的遺傳監(jiān)測，對于保護(hù)貝類養(yǎng)殖種群的遺傳多樣性至關(guān)重 要。迄今為止，未見能夠同時(shí)鑒定不同地理群體的雜色鮑的研究結(jié)果，因此，篩選能夠 同時(shí)鑒別雜色鮑臺灣群體、雜色鮑日本群體和“東優(yōu)1號”雜色鮑微衛(wèi)星標(biāo)記對于雜色鮑種 質(zhì)資源的保護(hù)和新品種的推廣都具有十分重要的意義。目前，雜色鮑不同群體的鑒定方法主要是通過雜色鮑足部肌肉顏色、殼形等形態(tài) 學(xué)方法鑒定，受環(huán)境和人為因素影響較大；相比較而言，以DNA為基礎(chǔ)的分子標(biāo)記技術(shù)如微 衛(wèi)星(SSR)技術(shù)，由于其呈共顯性遺傳，具有檢測位點(diǎn)多、多態(tài)性好、結(jié)果可重復(fù)性強(qiáng)、不受 人為因素和環(huán)境影響等優(yōu)點(diǎn)，而廣泛應(yīng)用于動(dòng)植物的DNA指紋圖譜和種質(zhì)鑒定方面。另外， 本專利采用的DNA池法，可以使PCR擴(kuò)增的模板數(shù)目數(shù)十倍的降低，大大減少PCR反應(yīng)次 數(shù)，減少實(shí)驗(yàn)人員工作量和實(shí)驗(yàn)中藥品的消耗。2步PCR法可以將不同退火溫度的引物在相 同的PCR反應(yīng)程序中進(jìn)行，縮短實(shí)驗(yàn)時(shí)間。DNA池法和2步PCR法的有機(jī)結(jié)合，在大大提高 引物篩選效率、保證引物篩選的準(zhǔn)確性的同時(shí)，節(jié)約了實(shí)驗(yàn)成本。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種不僅具有客觀、快速、準(zhǔn)確、經(jīng)濟(jì)等優(yōu)點(diǎn)，而且對于種質(zhì) 資源的保護(hù)、遺傳育種、“東優(yōu)1號”新品種的推廣有著重要意義的雜色鮑不同群體的微衛(wèi)星 鑒別方法。本發(fā)明包括以下步驟1)采用碧云天基因組DNA小量抽提試劑盒提取雜色鮑臺灣群體、雜色鮑日本群 體、雜色鮑“東優(yōu)1號”群體這三個(gè)群體的基因組DNA ；2)采用2步PCR法進(jìn)行PCR擴(kuò)增反應(yīng)，所述PCR擴(kuò)增反應(yīng)的引物序列為引物3_52，正向引物TCGTAAACGTGTTCTCTGCG；
反向引物TCGCGAAAAGTGTAATATCGAA；3)將PCR擴(kuò)增反應(yīng)產(chǎn)物進(jìn)行毛細(xì)管電泳，得雜色鮑臺灣群體、雜色鮑日本群體和 “東優(yōu)1號” 3個(gè)群體的特異性等位基因。在步驟2)中，所述PCR擴(kuò)增反應(yīng)的反應(yīng)總體積可為10μ 1，采用雜色鮑的群體 DNA池作為PCR擴(kuò)增反應(yīng)的模板，在每個(gè)PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系中加入20 40ng，10XPCR緩 沖液(Tris-HCl pH8. 5 100mmol/L、KCl 500nmol/L、MgCl2 15nmol/L, ) 1 μ 1, Mg2+(25mmol/ L)0. 6μ 1，dNTP (2. 5mmol/L)0. 8μ 1,反向引物(lOOng/μ 1) 0· 6 μ 1，正向引物(lOOng/ μ 1)0. 4 μ 1，rTaq(5U/y 1)0. 1 μ 1，加雙蒸水補(bǔ)體系至10 μ 1 ；所述PCR擴(kuò)增反應(yīng)的程序可 為94°C 5min — (94°C 30s — 57°C 30s ^ 72°C 30s) X 20 個(gè)循環(huán)一(94°C 30s ^ 53°C 30s — 72°C 30s) X 15 個(gè)循環(huán)—72°C 15min — 10°C保存。在步驟3)中，所述將PCR擴(kuò)增反應(yīng)產(chǎn)物進(jìn)行毛細(xì)管電泳，可采用QIAxcel公司生 產(chǎn)的型號為5370的毛細(xì)管電泳儀，電泳卡夾可購自QIAGEN公司，電泳卡夾可選擇高分辨率 (1200Runs)卡夾，電泳分型方法可采用機(jī)器自帶軟件BioCalculator中0M800. mtd方法， PCR產(chǎn)物分型結(jié)果使用BioCalculator軟件分析，數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)。所得雜色鮑臺灣群體特異性等位基因范圍為258 271bp。所得雜色鮑日本群體特異性等位基因?yàn)?95bp。所得“東優(yōu)1號”雜色鮑群體特異性等位基因?yàn)?23bp。由于本發(fā)明采用DNA池法和2步PCR法，結(jié)合分子標(biāo)記技術(shù)、毛細(xì)管電泳技術(shù)等， 找到雜色鮑臺灣群體、雜色鮑日本群體、雜色鮑“東優(yōu)1號”群體的特異性片段，進(jìn)而鑒別雜 色鮑臺灣群體、雜色鮑日本群體、雜色鮑“東優(yōu)1號”群體，因此本發(fā)明的結(jié)果可靠，可重復(fù) 性好。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，引物3-52可以準(zhǔn)確地區(qū)分雜色鮑臺灣群體、雜色鮑日本群體和“東優(yōu) 1號”雜色鮑3個(gè)雜色鮑群體。


圖1為雜色鮑臺灣群體引物3-52PCR擴(kuò)增反應(yīng)結(jié)果峰圖。在圖1中，左峰為 258. 4bp，右峰為 270. 5bp。圖2為雜色鮑日本群體引物3-52PCR擴(kuò)增反應(yīng)結(jié)果峰圖。在圖2中，峰為195. Ibp0圖3為雜色鮑“東優(yōu)1號”群體引物3-52PCR擴(kuò)增反應(yīng)結(jié)果峰圖。在圖3中，左峰 為 208. 9bp，右峰為 222. 5bp。
具體實(shí)施例方式實(shí)施例1從雜色鮑臺灣群體、雜色鮑日本群體和雜色鮑“東優(yōu)1號”這3個(gè)群體中，每個(gè)群體 分別選取32個(gè)個(gè)體，提取基因組DNA，測定DNA濃度，將每個(gè)群體的32個(gè)個(gè)體的基因組DNA 等量混合成群體DNA池，PCR擴(kuò)增反應(yīng)的反應(yīng)總體積為10 μ 1，采用雜色鮑的群體DNA池作 為PCR擴(kuò)增反應(yīng)的模板，在每個(gè)PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系中加入28ng，10XPCR緩沖液(Tris-HCl pH8. 5 100mmol/L、KCl 500nmol/L、MgCl2 15nmol/L, ) 1 μ 1, Mg2+(25mmol/L) 0. 6 μ 1, dNTP (2. 5mmol/L)0. 8μ 1,反向引物(lOOng/μ 1) 0. 6 μ 1，正向引物(lOOng/μ 1)0. 4 μ 1， rTaq (5U/ μ 1) 0. 1 μ 1，加雙蒸水補(bǔ)體系至10 μ 1。
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引物序列為引物3-52:正向引物TCGTAAACGTGTTCTCTGCG反向引物TCGCGAAAAGTGTAATATCGAAPCR 擴(kuò)增反應(yīng)程序?yàn)?4°C 5min — (94°C 30s — 57°C 30s — 72°C 30s) X 20 個(gè) 循環(huán)—(94°C 30s — 53°C 30s — 72°C 30s) X 15 個(gè)循環(huán)一72°C 15min — 10°C保存。PCR擴(kuò)增反應(yīng)產(chǎn)物進(jìn)行毛細(xì)管電泳，儀器使用QIAxcel公司生產(chǎn)的毛細(xì)管電泳 儀(型號5370)，電泳卡夾(購自QIAGEN公司)選擇高分辨率(1200RimS)卡夾，電泳 分型方法為機(jī)器自帶軟件BioCalculator中0M800.mtd方法，PCR產(chǎn)物分型結(jié)果使用 BioCalculator軟件分析，得到雜色鮑臺灣群體、雜色鮑日本群體和“東優(yōu)1號”3個(gè)群體的 特異性等位基因。①日本群體特異性等位基因?yàn)?95bp。②“東優(yōu)1號”實(shí)驗(yàn)組特異性等位基因?yàn)?23bp。③臺灣群體特異性等位基因范圍為258 265bp。實(shí)施例2從雜色鮑臺灣群體、日本群體和“東優(yōu)1號”這三個(gè)群體中，每個(gè)群體分別選取 45個(gè)個(gè)體，提取基因組DNA，測定DNA濃度，將每個(gè)群體的45個(gè)個(gè)體的基因組DNA等量 混合成群體DNA池，PCR擴(kuò)增反應(yīng)的反應(yīng)總體積為10 μ 1，采用雜色鮑的群體DNA池作為 PCR擴(kuò)增反應(yīng)的模板，在每個(gè)PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系中加入35ng，10 X PCR緩沖液(Tr i s-HC 1 pH8. 5 100mmol/L、KCl 500nmol/L、MgCl2 15nmol/L, ) 1 μ 1, Mg2+(25mmol/L) 0. 6 μ 1, dNTP (2. 5mmol/L)0. 8μ 1,反向引物(lOOng/μ 1) 0. 6 μ 1，正向引物(lOOng/μ 1) 0. 4 μ 1， rTaq (5U/ μ 1) 0. 1 μ 1，加雙蒸水補(bǔ)體系至10 μ L·引物序列為引物3-52:正向引物TCGTAAACGTGTTCTCTGCG
反向引物TCGCGAAAAGTGTAATATCGAAPCR 擴(kuò)增反應(yīng)程序?yàn)?4°C 5min — (94°C 30s — 57°C 30s — 72°C 30s) X 20 個(gè) 循環(huán)—(94°C 30s — 53°C 30s — 72°C 30s) X 15 個(gè)循環(huán)一72°C 15min — 10°C保存。PCR擴(kuò)增反應(yīng)產(chǎn)物進(jìn)行毛細(xì)管電泳，儀器使用QIAxcel公司生產(chǎn)的毛細(xì)管電泳 儀(型號5370)，電泳卡夾(購自QIAGEN公司)選擇高分辨率(1200RimS)卡夾，電泳 分型方法為機(jī)器自帶軟件BioCalculator中0M800.mtd方法，PCR產(chǎn)物分型結(jié)果使用 BioCalculator軟件分析，得到雜色鮑臺灣群體、雜色鮑日本群體和“東優(yōu)1號”3個(gè)群體的 特異性等位基因。①日本群體特異性等位基因?yàn)?95bp。②“東優(yōu)1號”實(shí)驗(yàn)組特異性等位基因?yàn)?23bp。③臺灣群體特異性等位基因范圍為260 271bp。
權(quán)利要求
雜色鮑不同群體的微衛(wèi)星鑒別方法，其特征在于包括以下步驟1)采用碧云天基因組DNA小量抽提試劑盒提取雜色鮑臺灣群體、雜色鮑日本群體、雜色鮑“東優(yōu)1號”群體這三個(gè)群體的基因組DNA；2)采用2步PCR法進(jìn)行PCR擴(kuò)增反應(yīng)，所述PCR擴(kuò)增反應(yīng)的引物序列為引物3 52，正向引物TCGTAAACGTGTTCTCTGCG；反向引物TCGCGAAAAGTGTAATATCGAA；3)將PCR擴(kuò)增反應(yīng)產(chǎn)物進(jìn)行毛細(xì)管電泳，得雜色鮑臺灣群體、雜色鮑日本群體和“東優(yōu)1號”3個(gè)群體的特異性等位基因。
2.如權(quán)利要求1所述的雜色鮑不同群體的微衛(wèi)星鑒別方法，其特征在于在步驟2)中， 所述PCR擴(kuò)增反應(yīng)的反應(yīng)總體積為10 μ 1，采用雜色鮑的群體DNA池作為PCR擴(kuò)增反應(yīng)的 模板，在每個(gè)PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系中加入20 40ng，10XPCR緩沖液，所述10XPCR緩沖液 的組成為 Tris-HCl pH8. 5 100mmol/L、KCl 500nmol/L、MgCl2 15nmol/L, 1 μ 1,Mg2+25mmol/ L 0. 6μ 1, dNTP 2. 5mmol/L 0. 8 μ 1，反向引物 IOOng/μ 1 0. 6 μ 1，正向引物 IOOng/μ 1 0· 4 μ 1，rTaq 5U/μ 1 0· 1 μ 1，加雙蒸水補(bǔ)體系至 10 μ 1。
3.如權(quán)利要求1或2所述的雜色鮑不同群體的微衛(wèi)星鑒別方法，其特征在于在步驟2) 中，所述 PCR 擴(kuò)增反應(yīng)的程序?yàn)?4°C 5min— (94°C 30s-57 °C 30s-72 °C 30s)X20 個(gè) 循環(huán)—(94°C 30s — 53°C 30s — 72°C 30s) X 15 個(gè)循環(huán)一72°C 15min — 10°C保存。
4.如權(quán)利要求1所述的雜色鮑不同群體的微衛(wèi)星鑒別方法，其特征在于在步驟3)中， 所述將PCR擴(kuò)增反應(yīng)產(chǎn)物進(jìn)行毛細(xì)管電泳，是采用QIAxcel公司生產(chǎn)的型號為5370的毛 細(xì)管電泳儀，電泳卡夾購自QIAGEN公司，電泳卡夾選擇分辨率為1200Runs的卡夾，電泳 分型方法采用機(jī)器自帶軟件BioCalculator中0M800. mtd方法，PCR產(chǎn)物分型結(jié)果使用 BioCalculator軟件分析，數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)。
全文摘要
雜色鮑不同群體的微衛(wèi)星鑒別方法，涉及雜色鮑。提供一種不僅具有客觀、快速、準(zhǔn)確、經(jīng)濟(jì)等優(yōu)點(diǎn)，而且對于種質(zhì)資源的保護(hù)、遺傳育種、“東優(yōu)1號”新品種的推廣有著重要意義的雜色鮑不同群體的微衛(wèi)星鑒別方法。采用碧云天基因組DNA小量抽提試劑盒提取雜色鮑臺灣群體、雜色鮑日本群體、雜色鮑“東優(yōu)1號”群體這三個(gè)群體的基因組DNA；采用2步PCR法進(jìn)行PCR擴(kuò)增反應(yīng)，所述PCR擴(kuò)增反應(yīng)的引物序列為引物3-52；將PCR擴(kuò)增反應(yīng)產(chǎn)物進(jìn)行毛細(xì)管電泳，得雜色鮑臺灣群體、雜色鮑日本群體和“東優(yōu)1號”3個(gè)群體的特異性等位基因。
文檔編號C12Q1/68GK101956001SQ20101024913
公開日2011年1月26日 申請日期2010年8月6日 優(yōu)先權(quán)日2010年8月6日
發(fā)明者戰(zhàn)欣, 柯才煥, 游偉偉, 范飛龍, 駱軒 申請人:廈門大學(xué)